专利名称：一种青岛文昌鱼细胞系培养液及其制备方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种青岛文昌鱼细胞系培养液，以及制备该培养液的方法。
背景技术：
海洋模式动物文昌鱼,拉丁文学名为Branchiostoma belcheri,属于原索动物，既保留了无脊椎动物的一些特性，又具有脊椎动物的特点，是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型。文昌鱼早在5亿年前就已经出现，被认为是现存的脊椎动物始祖代表，素有“活化石”之称。由于其独特的进化地位，被认为是研究动物进化和胚胎发育的典型模式动物，在学术上有很高的进化地位，是国内外近年来遗传、免疫、进化、发育和基因组学研究的热点。但文昌鱼对栖息地生态环境的要求十分严格和苛刻，在世界分布范围很窄，产量很少。它生活在沙质中，要求海水透明度较高，水质洁净，水深在5-10米，最适盐度为每升海水中含14-29克盐，酸碱度在8. 1-8.2。文昌鱼在我国主要分布在厦门、青岛和烟台沿海。
为进一步深化文昌鱼的研究，建立文昌鱼细胞系是至关重要的一个环节。二十世纪八十年代就有人尝试培养文昌鱼细胞，但只局限于原代培养，细胞无法传代。如《厦门大学学报(自然科学版)》2006年第B05期第181-183页《文昌鱼离体细胞原代培养初步研究》一文中就公开了一种原代培养文昌鱼细胞的方法。至今国内外也尚无文昌鱼细胞建系的报道，研究文昌鱼基因功能只能通过其他物种的细胞系来进行。其主要原因是文昌鱼细胞在体外不增殖，迅速进入衰老期，因而无法扩增和传代培养。端粒为细胞染色体末端一种有6kb串联的短片段重复序列(TTAGGG) η及一些结合蛋白组成的特殊结构。细胞在体外培养过程中进入复制性衰老与端粒有关。每次细胞分裂端粒丢失30-50个核苷酸。端粒酶通过维持和延伸细胞染色体末端端粒，避免了染色体末端的不稳定性。目前认为细胞永生化过程中的一个关键点是维持或延长细胞染色体的端粒，使端粒酶重新表达。端粒酶催化亚单位TERT在维持端粒酶的活性中起着致关重要的作用。现有技术中的一个例子是，Choy-Pik Chiu的研究小组将人端粒酶催化亚单位hTERT导入人皮肤成纤维细胞，此转染细胞可以在体外持续传代，而且保持亲本细胞的生物学特性，同样有接触性抑制。Carmela P. Morales等人同样将hTERT导入人皮肤成纤维细胞，他们发现高表达hTERT的成纤维细胞可以进行280次population doublings (PD),而亲本细胞则只有70-80PD。这些细胞的增殖速度与亲本细胞基本相同。现有技术中的另一个例子是，共济失调毛细血管扩张Ataxia-telangiectasia (A-T)患者对离子福射十分敏感,体外培养A-T患者的细胞十分困难，依赖高浓度血清，而且很容易衰老。Wood LD等人将hTERT导入A-T患者的成纤维细胞，有效地抑制了细胞衰老。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中无法实现离体传代培养文昌鱼细胞的技术难题，提供一种稳定的青岛文昌鱼细胞系以及建立这种细胞系的方法，为文昌鱼的研究建立良好的实验平台，以利于对遗传、免疫、进化、发育和基因组学的进一步深入的研究。本发明的另一个目的是提供一种用于培养所述青岛文昌鱼细胞系的培养液及其制备方法。本发明所述的青岛文昌鱼细胞系通过人端粒酶催化亚单位hTERT的cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞。本发明提供的青岛文昌鱼细胞系中，所述的人端粒酶催化亚单位hTERT的表达载体为逆转录病毒载体PBABE。本发明提供的青岛文昌鱼细胞系中，所述的原代细胞为淋巴细胞样细胞。
本发明还提供了一种建立所述青岛文昌鱼细胞系的方法，包括以下步骤I)培养青岛文昌鱼腮部原代细胞将青岛文昌鱼冰浴至昏迷，70 75%酒精消毒体表，无菌解剖，取文昌鱼腮部组织，用含青霉素和链霉素的细胞培养液漂洗后，剪切为细小组织块，将其移至六孔细胞培养板，涂布均匀，25 29°C下恒温静置培养使其贴壁，每日观察细胞生长状态，并补加O. 5 Iml细胞培养液；3日后更换1/2体积的细胞培养液；2)将人端粒酶催化亚单位hTERT的cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞转染前24小时选择生长状态良好的293T细胞，胰酶消化后传代后，接种于24孔培养中，每孔4X105个细胞，待细胞覆盖率达到60%后用于转染；转染步骤如下将8 4 1 lipofectamine2000与500 μ I无抗生素、无血清的细胞培养液充分混合并室温静置5分钟；与此同时，将2 μ g包装质粒pCL-Ampho与2 μ g pBABE-hTERT和500 μ I无抗生素无血清的细胞培养液充分混合，5分钟后将上述两种混合液混匀并室温静置20分钟。20分钟后将此混合液加入到293Τ细胞中，补足培养液至2ml，37°C、5%C02中培养，6小时后换为普通培养液，48小时后收集上清液，用O. 45 μ m的滤膜过滤。病毒感染液1/4体积+文昌鱼细胞培养液3/4体积，混合后加入原代细胞；3)获得存活细胞，并进行传代培养转染hTERT的细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长密度较大时，用移液管轻轻吸打的方法稀释传代悬浮细胞，传代稀释比例为I :
4;以后每次传代视细胞生长状态，3 4日传代一次；4)进行细胞生物学鉴定，验证细胞特征。本发明还提供了一种专用于所述建立青岛文昌鱼细胞系的方法的培养液，该培养液以Leiboviz’ s L15培养基为基础培养基,并含有以下组分至少一种必须氨基酸及非必须氨基酸、至少一种维生素、至少一种盐类、至少一种缓冲液及糖类、至少一种酚类化合物；所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；所述的维生素为氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、维生素B6、核黄素、硫胺磷酸酯、无旋光肌醇；所述的盐类为氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸二氢钠、丙酮酸钠；所述的糖类为右旋半乳糖；所述酚类化合物为酚红；所述培养液的渗透压为750-800m0sm / kg ；所述培养液的pH为7. 2-7. 4 ；使用前在所述培养液中加入占体积百分比为10%的胎牛血清。本发明所述的专用于建立青岛文昌鱼细胞系的方法的培养液，各组分含量为甘氨酸为380-420mg/L，L-丙氨酸为400_480mg/L，L-左型精氨酸为800-1100mg/L，L-天冬酰胺酸为450-530mg/L，L-半胱氨酸为200_260mg/L，L-谷氨酰胺为570_620mg/L，L-组氨酸为480-520mg/L，L-异亮氨酸为480_520mg/L，L-亮氨酸为220_270mg/L，L-赖氨酸为120-170mg/L, L-蛋氨酸为120_170mg/L，L-苯丙氨酸为230_280mg/L，L-丝氨酸为360-420mg/L, L-苏氨酸为 550_610mg/L, L-色氨酸为 36_43mg/L, L-酪氨酸为 530_620mg/L, L-缬氨酸为160-220mg/L，氯化胆碱为I. 7-2. 2mg/L, D-泛酸钙为I. 8-2. 3mg/L,叶酸为I. 7-2. 2mg/L，烟酰胺为 I. 6-2. 2mg/L，维生素 B6 为 I. 8-2. 3mg/L，核黄素为 O. 18-0. 22mg/L，硫胺磷酸酯为I. 9-2. lmg/L，无旋光肌醇为3. 6-4. 3mg/L，氯化钙为250_300mg/L，氯化镁为170-198mg/L，硫酸镁为 180_200mg/L，氯化钾为 770_810mg/L，磷酸二氢钾为 110_130mg/L，氯化钠为19500-20100mg/L，磷酸二氢钠为370_390mg/L，丙酮酸钠为1050-1120mg/L，右旋半乳糖为 1650-1900mg/L，酚红为 18_21mg/L。本发明还提供了一种制备所述培养液的方法，其包括以下步骤将各组分加入O. 8升电阻率为18. 2 Ω的超纯水中，将渗透压调配至750-800m0sm / kg，将酸碱度调至7. 0-7. 2，用电阻率为18. 2 Ω的超纯水将培养液的总体积调至I升，充分混匀，过滤灭菌后4°C保存；使用前加入占体积百分比为10%的胎牛血清。本发明通过上述建系方法及其专用培养液提供了一种青岛文昌鱼细胞系，成功地解决了离体传代培养文昌鱼细胞的技术难题，有利于对青岛文昌鱼的科学研究，并相应的促进遗传、免疫、进化、发育和基因组学等领域的深入研究。
图I :将文昌鱼的腮部组织进行原代培养，12小时后细胞游离出组织块。图2 :部分细胞在贴壁的状态下可以伸出长长的触角。图3 :利用本发明建立的文昌鱼细胞系的第三代传代细胞。图4 :利用本发明建立的文昌鱼细胞系的第六代传代细胞。图5 :利用本发明建立的文昌鱼细胞系的第八代传代细胞。图6 :Wright_Gimsa 染色结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。本发明提供的的青岛文昌鱼细胞系通过人端粒酶催化亚单位hTERT的cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞。所述的人端粒酶催化亚单位hTERT的表达载体为逆转录病毒载、体pBABE。所述的原代细胞为淋巴细胞样细胞。实施例I本发明提供的建立所述青岛文昌鱼细胞系的具体步骤如下I)培养青岛文昌鱼腮部原代细胞将青岛文昌鱼冰浴至昏迷，70 75%酒精消毒体表，无菌解剖，取文昌鱼腮部组织，用含青霉素和链霉素的细胞培养液漂洗后，剪切为细小组织块，将其移至六孔细胞培养板，涂布均匀，25 29°C下恒温静置培养使其贴壁，每日观察细胞生长状态，并补加O. 5 Iml细胞培养液；3日后更换1/2体积的细胞培养液。如图I所示，利用文昌鱼腮部组织进行原代培养后，可见贴壁细胞和悬浮细胞从组织中游离出来，悬浮细胞呈圆形，贴壁细胞呈多角形，但原代细胞不分裂。 2)将人端粒酶催化亚单位hTERT的cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞。所述的人端粒酶催化亚单位hTERT的表达载体为逆转录病毒载体pBABE (购自Addgene公司，Plasmidl771#)。转染前24小时选择生长状态良好的293T细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，胰酶消化后传代后，接种于24孔培养中，每孔4X105个细胞，待细胞覆盖率达到60%后用于转染；转染步骤如下将8 4 1 1丨 0作(^&1^1^2000与50(^1无抗生素、无血清的细胞培养液充分混合并室温静置5min ;与此同时,将2 μ g包装质粒pCL_Ampho(购自Imgenex公司)与2 μ g pBABE-hTERT和500 μ I无抗生素无血清的细胞培养液充分混合，5分钟后将上述两种混合液混匀并室温静置20分钟。20分钟后将此混合液加入到293Τ细胞中，补足培养液至2ml，37°C、5%C02中培养，6小时后换为普通培养液，48小时后收集上清液，用O. 45 μ m的滤膜过滤。病毒感染液1/4体积+文昌鱼细胞培养液3/4体积，混合后加入原代细胞。对贴壁细胞和悬浮细胞同时进行hTERT转染5天后，悬浮细胞开始出现分裂，并有大部分细胞逐渐趋于半贴壁状态，少部分细胞贴壁，与细胞培养皿底部粘着紧密。半贴壁和贴壁的细胞形态与原代的悬浮细胞基本相同。在倒置显微镜下观察，细胞虽然大小不一，但均呈圆形，细胞核位于细胞的中央。如图2所示，贴壁细胞有时会伸出长长的触角，但最长持续2天，之后触角会逐渐消失，细胞恢复原状。随着传代次数的增加，细胞的大小差异有逐渐缩小的趋势，但细胞大小不等的现象仍然存在。转染后贴壁多角形细胞死亡，只有圆形的悬浮细胞生存下来。3)获得存活细胞，并进行传代培养。转染hTERT的细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长密度较大时，用移液管轻轻吸打的方法传代悬浮细胞，传代稀释比例为I : 4;以后每次传代视细胞生长状态，3 4日传代一次。图3为第三代传代细胞，图4为第六代传代细胞，图5为第八代传代细胞。由此可见，第一代至第八代的细胞形态没有十分明显差另IJ，但证明了此细胞成功实现了传代培养，是可以传代培养的文昌鱼细胞系。至目前已传到了第16代，细胞增殖旺盛。4)进行细胞生物学鉴定，验证细胞特征。将细胞悬浊液滴至载玻片上进行涂片，干燥后进行Wright-Gimsa染色。结果如图6所示。从染色结果上判断,此细胞系为淋巴细胞样细胞。实施例2 5本发明提供的专用于上述建立青岛文昌鱼细胞系的方法的培养液组分优选
权利要求
1.ー种青岛文昌鱼细胞系培养液，以Leiboviz’ s L15培养基为基础培养基，其特征在于还含有以下组分至少ー种必须氨基酸及非必须氨基酸、至少ー种维生素、至少ー种盐类、至少ー种缓冲液及糖类、至少一种酚类化合物； 所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸； 所述的维生素为氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、维生素B6、核黄素、硫胺磷酸酷、无旋光肌醇； 所述的盐类为氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、磷酸ニ氢钾、氯化钠、磷酸ニ氢钠、丙酮酸钠； 所述的糖类为右旋半乳糖； 所述酚类化合物为酚红； 所述培养液的渗透压为750-800m0sm / kg ； 所述培养液的PH为7. 2-7. 4 ； 使用前在所述培养液中加入占体积百分比为10%的胎牛血清。
2.根据权利要求I所述的培养液，其特征在于其各组分含量为甘氨酸为380-420mg/L, L-丙氨酸为400-480mg/L，L-左型精氨酸为800-1100mg/L, L-天冬酰胺酸为450_530mg/L，L-半胱氨酸为200-260mg/L，L-谷氨酰胺为570_620mg/L，L-组氨酸为480_520mg/しL-异亮氨酸为480-520mg/L, L-亮氨酸为220_270mg/L，L-赖氨酸为120_170mg/L，L-蛋氨酸为 120-170mg/L，L-苯丙氨酸为 230_280mg/L，L-丝氨酸为 360_420mg/L，L-苏氨酸为550-610mg/L, L-色氨酸为36_43mg/L, L-酪氨酸为530_620mg/L, L-缴氨酸为160-220mg/L,氯化胆碱为 I. 7-2. 2mg/L，D-泛酸钙为 I. 8-2. 3mg/L，叶酸为 I. 7-2. 2mg/L，烟酰胺为I. 6-2. 2mg/L,维生素B6为I. 8-2. 3mg/L,核黄素为0. 18-0. 22mg/L，硫胺磷酸酯为 I. 9-2. lmg/L，无旋光肌醇为 3. 6-4. 3mg/L，氯化钙为 250_300mg/L，氯化镁为 170_198mg/し硫酸镁为180-200mg/L，氯化钾为770_810mg/L，磷酸ニ氢钾为110_130mg/L，氯化钠为19500-20100mg/L，磷酸ニ氢钠为370_390mg/L，丙酮酸钠为1050_1120mg/L，右旋半乳糖为1650-1900mg/L，酚红为 18_21mg/L。
3.制备权利要求I或2所述的培养液的方法，其特征在于包括以下步骤将各组分加入0.8升电阻率为18. 2 Q的超纯水中，将渗透压调配至750-800m0sm / kg，将酸碱度调至`7.0-7. 2，用电阻率为18. 2 Q的超纯水将培养液的总体积调至I升，充分混匀，过滤灭菌后`4°C保存；使用前加入占体积百分比为10%的胎牛血清。
全文摘要
本发明属于细胞生物学领域。本发明采用青岛文昌鱼腮部原代细胞，通过用人端粒酶催化亚单位hTERT的cDNA转染来实现细胞的成功传代，建立了青岛文昌鱼细胞系。本发明提供了一种用于建系的细胞培养液，该培养液以Leiboviz’s L15培养基为基础培养基，含有以下组分至少一种必须氨基酸及非必须氨基酸、至少一种维生素、至少一种盐类、至少一种缓冲液及糖类、至少一种酚类化合物。本发明还提供了一种制备该培养液的方法。本发明成功地解决了离体传代培养文昌鱼细胞的技术难题，有利于促进遗传、免疫、进化、发育和基因组学等领域的深入研究。
文档编号C12N5/10GK102757939SQ20121024452
公开日2012年10月31日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者张雁, 王华敏, 蔡晓青 申请人:中山大学