外切特异性的淀粉酶多肽、编码那些多肽的核酸及其应用的制作方法

专利名称：：外切特异性的淀粉酶多肽、编码那些多肽的核酸及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及淀粉酶多肽和编码所述多肽的核酸及其应用。本发明的淀粉酶被设计为，具有更多的有益性质。具体来说，本发明的淀粉酶显示了改变的外切特异性(exospecifity)。
背景技术：
：改进的淀粉酶可以改善在某些过程如烘焙中的内在问题。在烘焙后数天，在淀粉颗粒中发生支链淀粉的结晶，这导致面包的坚硬性增加，并引起面包变得不新鲜(staling)。当面包不新鲜时,面包丧失了面包屑(crumb)的软度和面包屑的湿度。结果是，面包屑变得弹性降低，面包变为坚韧的干面包片。支链淀粉侧链的酶促水解(例如，通过淀粉酶)可以减少结晶并增强保鲜能力。结晶取决于支链淀粉侧链的长度侧链越长，结晶越多。大多数淀粉颗粒是由两种聚合物的混合物组成的支链淀粉和直链淀粉，其中大约75%是支链淀粉。支链淀粉是非常大的分支的分子，由通过(1-4)键连接的a-D-吡喃葡萄糖基单位构成的链组成，其中链通过a-(1-6)键进行连接，从而形成分支。直链淀粉是(1-4)键接的a-D-吡喃葡萄糖基单位构成的线性链，几乎不带有a-(1-6)分支。烘焙含淀粉面包产品如白面包、由筛选的黑麦粉和小麦粉制成的面包以及面包卷，是通过烘焙面团完成的，炉温为180至250°C，持续大约15至60分钟。在烘焙过程中，急骤的温度梯度(200—120°C)遍及面团外层，此时，烘焙产品的硬皮生成。然而，由于蒸气，在烘焙过程的末期，面包屑的温度仅为大约100°C。在高于大约85°C的温度，可能发生酶的失活，酶将不具有保鲜特性。因此，只有热稳定的淀粉酶能够在烘焙期间有效地修饰淀粉。由于支链糊精的积累会导致产生粘性的或胶粘的面包屑，内切淀粉酶活性会对最终面包产品的质量产生负面影响。外切淀粉酶活性是优选的，因为其完成了期望的淀粉修饰，所述修饰导致老化(不新鲜化)的延迟，而与内切淀粉酶活性相关的负面效应则较少。内切淀粉酶活性的降低可以导致更高的外切特异性，这可以减少支链糊精并产更高质量的面包。本发明涉及具有改变的外切特异性的多肽。
发明内容在第一方面，本发明提供了包括PS4变异体的多肽，PS4变异体衍生自亲代多肽(parentpolypeptide)。亲代酶可以优选地是嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)的非产麦芽外切淀粉酶(non-maltogenicexoamylase),如具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列的外切淀粉酶。亲代酶可以优选地是施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)的非产麦芽外切淀粉酶，如具有SEQIDNO:7或SEQIDNOll中列出的氨基酸序列的多肽。PS4家族的其它成员可以被用作亲代酶。在优选的实施方案中，亲代多肽是来自嗜糖假单胞菌的非产麦芽外切淀粉酶，其具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列。在其它优选的实施方案中，亲代多肽是来自施氏假单胞菌的非产麦芽外切淀粉酶，其具有SEQIDNO:7或SEQIDN0:11中列出的氨基酸序列。在一种优选的实施方案中，PS4变异体通过包含氨基酸取代而不同于亲代多肽，取代所处的位置包括选自下列的至少一个位置4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中对位置所进行的编号是参照SEQIDNO:I列出的嗜糖假单胞菌序列。在一种优选的实施方案中，PS4变异体通过包含氨基酸取代而不同于亲代多肽，所述取代所处的位置包括选自下列的至少一个位置:4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、131、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405，其中位置编号是参照SEQIDNO:I列出的嗜糖假单胞菌序列。优选地，所述位置是选自下列的至少一个位置:33、34、71、87、121、134、141、157、178、179、223、307、334和343。优选地，PS4变异体包括至少一个取代，其选自:N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。在另一种实施方案中，所述外切淀粉酶还包括至少一个另外的取代，位置选自108、158、171和188。优选地，PS4变异体包括选自下列的至少一个取代:K108R、G158D、Y171S和G188A。优选地，PS4变异体包括选自下列的至少一个取代G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、I157L、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、Y198L、A199V、G223A、V290I、H307L、I315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。优选地，PS4变异体包括下列取代N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L和S334P，带有至少一个另外的取代L178F或A179T。优选地，PS4变异体包括下列取代中的至少一个N33Y、D34N、I157L、L178F、A179T、G223A或H307L。优选地，PS4变异体包括下列取代中的至少一个G87S、G134R、A141P或S334P。在其它优选的实施方案中，PS4变异多肽包括选自下列的组合G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33Y；G134R，A141PI157LG23AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG87SG121DS214NT375A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DY171SG188AN138D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG188A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179T；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PN33YD34NL178FA179T;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG87SG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DE343D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TY33NN34DE343D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179TG121D；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；113F,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A99V,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；Vl131，1157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A199V,D343E,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,H307L；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；Vl131，A141P，Y198F,G223A,A268P,V290I,S399PV113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S399P；V113I,A141P,Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I；Y198F,G223A,V290I；Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I；V113M；V113A；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,G188S,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,L178L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,11701，Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405V；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198L,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K108R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；D34G,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；G4D,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;和A141P,G134R,G223A,H307L,I157L,V113I,V290I,Y198F,G188A；在其它优选的实施方案中，PS4变异体多肽包括选自下列的组合G134R,A141P,1157L,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A，H307L和S334P;G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P。在其它优选的实施方案中，PS4变异体多肽包括选自下列的组合N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P在优选的实施方案中，PS4变异体是包含在SEQIDNO2；SEQIDNO3；SEQIDNO4；SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:8，SEQIDNO9或SEQIDNO10中列出的序列的氨基酸。PS4变异体可以是源自假单胞菌(Pseudomonassp)。在一种实施方案中，假单胞菌某种是选自嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌。PS4变异多肽可以包括除上面列出的那些突变之外的一种或多种突变。也可以包括其它突变，例如在一个或多个其它位点的删除、插入、取代、颠换、转换和倒位(inversions)。同样地,多肽可以缺失上面列出的取代的至少一个。在一种优选的实施方案中，多肽被截短。截短(truncation)可以在N末端或C末端。亲代酶或PS4变异体可以缺少一个或多个部分,例如子序列(sub-sequences)、信号序列、结构域或部分(moieties)，不论其是有活性或是没有活性的。例如，如本文所描述，亲代酶或PS4变异体多肽可以缺乏信号序列。作为选择地，或者附加地，亲代酶或PS4变异体可以缺乏一个或多个催化结构域或结合结构域。在优选的实施方案中，亲代酶或PS4变异体可以缺乏存在于非产麦芽外切淀粉酶中的一个或多个结构域，如淀粉结合结构域。例如，PS4多肽可以仅具有直至位置429的序列，这是相对于SEQIDNO1中列出的嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的编号而言的。在一种优选的实施方案中，提供了PS4变异体pSac-d34(SEQIDNO:15，图8c)、pSac_D20(SEQIDNO:13，图8a)和pSac_D14(SEQIDNO:14，图8b)，所述变异体具有如图中列出的氨基酸序列。PS4变异体也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其与编码PS4变异体多肽酶的核苷酸序列有至少75%、80%、85%或90%是相同的(indentical)，优选地有至少95%、96%、97%、98%或99%是相同的。优选的实施方案也包括功能上的等价物(functionalequivalents)。本文中描述的PS4变异多肽来源于优选地显示出非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽或者是优选地显示出非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽的变异体。优选地，亲代酶本身是非产麦芽外切淀粉酶。优选实施方案中的PS4变异多肽也显示出非产麦芽外切淀粉酶活性。本文描述的PS4变异体将优选地具有外切特异性，例如，由本文所描述的外切特异性指数(exospecificityindices)所量度的,这和它们是外切淀粉酶相一致。而且,与亲代酶或它们的起源多肽相比较，它们优选地具有更高的或增加的外切特异性。因此，例如，PS4变异多肽可以具有20或更大的外切特异性指数，即，其总淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)比其内切淀粉酶活性多20倍或更多。在优选的实施方案中，外切淀粉酶的外切特异性指数是30或更多、40或更多、50或更多、60或更多、70或更多、80或更多、90或更多、或100或更多。在优选的实施方案中，外切特异性指数是150或更多、200或更多、300或更多、或400或更多。优选地，PS4变异体将比亲代更加热稳定。优选地，PS4变异多肽能够在从大约55°C至大约80°C或更高的温度下降解淀粉。优选地，PS4变异体在暴露于高达大约95°C的温度后保持其活性。本文描述的PS4变异多肽相对于亲代酶，具有延长的半衰期，优选地延长10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，这优选地在从55°C至大约95°C或更高的高温下，优选地在大约80°C发生。优选地，将样品在80°C或更高温度下加热1-10分钟。优选地，PS4变异多肽是更加pH稳定的。优选地，它比其同源亲代多肽的pH稳定性高。优选地，PS4变异多肽能够在pH从大约5至大约10.5时降解淀粉。在相同的pH条件下，和它们的亲代多肽相比较时，PS4变异多肽可以具有多出10%、20%、30%、40%、50%、60%,70%,80%,90%,100%,200%或更长的半衰期。在另一种实施方案中，可以通过测定酶在特定PH条件下的活性或比活性来分析pH稳定性的程度。特定的pH条件可以是从pH5至pH10.5的任何pH。在优选的实施方案中，功能上的等价物将和PS4家族成员中的至少一个具有序列同源性。功能上的等价物将和上面提及的嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶中的任一个具有序列同源性，优选地，和两者都具有序列同源性。功能上的等价物也可以和SEQIDNOs:1至12中所示序列的任一个，优选地和SEQIDNO:1或SEQIDNO7或两者具有序列同源性。序列同源性优选地至少是60%、优选地是65%或更多、优选地是75%或更多、优选地是80%或更多、优选地是85%或更多、优选地是90%或更多、优选地是95%或更多。序列同源性可以通过本文列出的任何程序或所有程序生成。在其它的实施方案中，功能性等价物将能够特异地和上面列出的任何序列杂交。在第二方面，本发明提供了核酸，该核酸编码包括PS4变异体的多肽，多肽可以从亲代多肽得到，如上所述。亲代酶可以优选地是SEQIDNO1中列出的或SEQIDNO:5中列出的嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶。亲代酶可以优选地是SEQIDNO:7列出的或SEQIDNO:11中列出的施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶。PS4家族的其它成员可以被用作亲代酶。在优选的实施方案中，亲代多肽是来自嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的非产麦芽外切淀粉酶，其具有如SEQIDNO:I列出的或SEQIDNO5列出的序列。在其它优选的实施方案中，亲代多肽包括来自施氏假单胞菌的非产麦芽外切淀粉酶，其具有如SEQIDNO:7列出的或SEQIDNO:11列出的序列。在一种优选的实施方案中，编码PS4变异体的核酸通过编码氨基酸取代而不同于亲代核酸，所述取代所处的位置包括至少一个位置，其选自:4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中对位置所作的编号是参照SEQIDN01列出的嗜糖假单胞菌序列。优选地，所述位置选自下列的至少一个位置33、34、87、121、134、141、157、178、179、223、307和334。优选地，编码PS4变异体的核酸包括编码多肽中至少一个取代的核酸，所述取代选自:N33Y、D34N、G87S、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L^PS334P。优选地，编码PS4变异体的核酸包括下列取代N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L和S334P，并带有至少一个另加的L178F或A179T取代。优选地，编码PS4变异体的核酸包括下列取代中的一个N33Y、D34N、I157L、L178F、A179T、G223A*H307L。优选地，编码PS4变异体的核酸包括下列取代中的一个G87S、G134R、A141P或S334P。在另一种实施方案中，编码PS4变异体的核酸包括编码下列取代中的至少一个的核酸K71R、K108R、G158D、Y171S、G188A和D343E。在另一种实施方案中，编码PS4变异体的核酸包括这样的核酸，其编码下列的至少一个组合G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33Y；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG87SG121DS214NT375A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DY171SG188AN138D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG188A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179T；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PN33YD34NL178FA179T;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG87SG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DE343D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TY33NN34DE343D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179TG121D；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；113F,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A99V,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A199V,D343E,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,H307L；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,A141P,Y198F,G223A,A268P,V290I,S399PV113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S399P；V113I,A141P,Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I；Y198F,G223A,V290I；Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I；V113M；V113A；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,G188S,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,L178L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,11701，Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405V；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198L,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K108R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；D34G,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；G4D,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;和A141P,G134R,G223A,H307L,I157L,V113I,V290I,Y198F,G188A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A，H307L和S334P;G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P。在优选的实施方案中，编码PS4变异体的核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQIDNO2；SEQIDNO3；SEQIDNO4；SEQIDNO:13；SEQIDNO:14；SEQIDNO15；SEQIDNO8,SEQIDNO:9或SEQIDNO:10。在一种优选的实施方案中，核酸编码截短的多肽。截短可以在N末端或C末端。亲代酶或PS4变异体可以缺少一个或多个部分，如子序列、信号序列、结构域或部分(moieties)，不论是有活性的或是没有活性的。例如，亲代酶或PS4变异多肽可以缺乏信号序列。替代地，或附加地，亲代酶或PS4变异体可以缺乏一个或多个催化结构域或结合结构域。在一种优选的实施方案中，亲代酶或PS4变异体可以缺乏存在于非产麦芽外切淀粉酶中的一个或多个结构域，如淀粉结合结构域。例如，PS4多肽可以具有仅至位置429的序列，这是相对于SEQIDNO:1中显示的嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的编号而言的。在一种优选的实施方案中，核酸编码如图中列出的PS4变异体pSac-d34、pSac-D20和pSac_D14。编码PS4变异多肽的核酸可以包括除上面列出的那些突变之外的一个或多个突变。也可以包括其它突变，例如在一个或多个其它位置的删除、插入、取代、颠换、转换和倒位。同样地，核酸编码的多肽可以缺少至少一个在上面列出的取代。编码PS4变异体的核酸也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其与编码PS4变异多肽酶的序列是至少75%、80%、85%或90%相同的，优选的是至少95%、96%、97%、98%或99%相同的。优选的实施方案也包括编码多肽的核酸，所述多肽是PS4变异体的功能上的等价物。编码本文中描述的PS4变异多肽的核酸衍生自这样的核酸或是这样的核酸的变异体，所述核酸优选地编码具有非产麦芽外切淀粉酶活性的酶。优选地，由核酸编码的亲代酶本身是非产麦芽外切淀粉酶。优选实施方案中由核酸编码的PS4变异多肽也显示出非产麦芽外切淀粉酶活性。如本文描述，由核酸编码的PS4变异体将优选地具有外切特异性，例如，由外切特异性指数所量度的。而且，优选地，在相同条件下，与亲代酶或它们的起源多肽相比较，它们优选地具有更高的或增加的外切特异性。因此，例如，PS4变异多肽可以具有10%、20%、30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%或更高的外切特异性指数。优选地在相同条件下，当和它们的亲代多肽相比较时，它们具有I.5x或更高、2x或更高、5x或更高、IOx或更高、50x或更高、IOOx或更高的外切特异性。优选地，由核酸编码的PS4变异体将比亲代更加热稳定。优选地，PS4变异多肽能够在从大约55°C至大约80°C或更高的温度下降解淀粉。优选地，PS4变异体在暴露于高达大约95°C的温度后保持其活性。本文描述的PS4变异多肽相对于亲代酶，具有延长的半衰期，优选地延长10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，这优选地在从55°C至大约95°C或更高的高温下，优选地在大约80°C发生。优选地，将样品在80°C或更高的温度下加热1-10分钟。优选地，由核酸编码的PS4变异多肽是pH稳定的。优选地，它比其亲代多肽的pH稳定性高。优选地，PS4变异多肽能够在pH从大约5至大约10.5时降解淀粉。具体的pH条件可以是从PH5至pH10.5的任何pH。在相同的条件下，和亲代多肽相比较时，该核酸编码的PS4变异多肽可以具有更长的半衰期或更高的活性(取决于分析方法)。在相同的pH条件下，和亲代多肽相比较时，PS4变异多肽可以有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更长的半衰期。替代地，或附加地，在相同的pH条件下，和亲代多肽相比较时，它们可以具有更高的活性。在一种优选的实施方案中，该核酸编码的功能上的等价物将和PS4家族成员中的至少一个具有序列同源性。功能上的等价物将和上面提及的嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶中的任一个具有序列同源性，在一种优选的实施方案中，优选地和两者都具有序列同源性。功能上的等价物也可以和SEQIDNOs:1至12中的任何一个，优选地和SEQIDNO:1或SEQIDNO:7或两者具有序列同源性。序列同源性优选地至少是60%、优选地是65%或更多、优选地是75%或更多、优选地是80%或更多、优选地是85%或更多、优选地是90%或更多、优选地是95%或更多。在其它实施方案中，提供了核酸，所述核酸和编码本文列出的任意PS4变异体的核酸互补。此外，提供了能够和该互补序列杂交的核酸。在一种优选的实施方案中，编码功能上等价物的核酸将能够特异地和上面列出的任意序列杂交，它和它的互补物提供于此。在一种优选的实施方案中，用于本文描述的方法和组合物的序列是合成序列。其包括但不限于，利用宿主生物体的最佳密码子使用所形成的序列，宿主生物体如甲基营养酵母毕赤酵母(Pichia)和汉逊酵母(Hansenula)。本发明的第三方面提供了组合物，其包括至少一种PS4变异多肽和另一组分。另一组分可以是酶，其选自氧化还原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂加氧酶。在一种优选的实施方案中，组合物包括至少一种PS4变异体和来自杆菌的产麦芽淀粉酶，如W091/04669中所公开的。优选的实施方案包括PS4变异体和面粉。另外的酶可以和任何面团成分共同加入，面团成分包括面粉、水或任选的其它组分或添加剂或面团改良组合物(doughimprovingcomposition)。可以在面粉、水或任选的其它组分或添加剂或面团改良组合物之前或之后加入另外的酶。另外的酶可以是液体制备物，或干燥组合物的形式。第四方面提供了包括PS4变异多肽的载体、包括PS4变异多肽的细胞和表达PS4变异多肽的方法。在一种优选的实施方案中，本发明涉及重组的可复制载体，其带有编码PS4变异多肽的核酸。载体可以附加地包括本文列出的任何兀素。另一种优选的实施方案提供了宿主细胞，其包含编码PS4变异体的核酸。宿主细胞可以是本文列出的任何细菌、真菌或酵母细胞。在一种优选的实施方案中，如本文所提供，本发明涉及表达PS4多肽的方法。本发明的其它方面可以在相关申请中找到，其律师案卷编号为674510-2007和GC806P，它们在此并入作为参考，包括任何图表、参考文献和附图。图I显示了PS4变异体的热稳定性改善。PS4ccl是表达的对照酶，其来自嗜糖假单胞菌，不带有信号序列并缺乏淀粉结合结构域。对PS4ccl、pSac-D3、pSac-D20和pSac_D14，以半衰期对温度作图，半衰期以分钟表示，温度以摄氏度表示。图2显不了在模型面团体系试验(modeldoughsystemtrial)中，PSac_D34的剂量效应。面包屑的固体含量是通过NMR测定的。对于对照、D340.5、l、2ppm，以通过固体含量来量度的坚硬度对烘焙后的天数作图。图3显示了烘焙试验(bakingtrial)的结果,结果显示了以每kg面粉Img的剂量加入PSac_D3和Psac_D14时，降低的坚硬性和坚硬速度。对对照组，以通过hPa量度的坚硬性对烘焙后的天数作图。图4显示了烘焙试验，显示了相比于不带有N33Y、D34N、K71R、L178F、A179T的PSac-D3,PSac-D3(G134R、A141P、I157L、G223A、A307L、S334P、K71R、D343E、N33Y、D34N、L178F、A179T)的增加软化的效应，在75C时，和PSac_D3的9，3分钟相比，其t1/2_75是3，6。图5显示了PS4(SEQIDNO1)参照序列，来自嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列。图6显示了PS4变异体的序列(SEQIDNO2);嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F和A179T取代。图I显示了PS4变异体的序列(SEQIDNO3);嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T和G121D取代。图8A显示了PS4变异体的序列(SEQIDNO4);嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有G134R、A141P、1157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T、G121D和G87S取代。图8B显示了PSac_D20序列(SEQIDNO13);嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有13个取代和淀粉结合结构域的删除。图8C显示了PSac_D14序列(SEQIDNO:14);嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有14个取代和淀粉结合结构域的删除。图8D显示了PSac_D34序列的序列(SEQIDNO15);嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶氨基酸序列，其带有11个取代和淀粉结合结构域的删除。图9显示了嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。嗜糖假单胞菌葡聚糖l，4-a-麦芽四糖水解酶前体(EC3.2.I.60)(G4-淀粉酶)(麦芽四糖形成淀粉酶)(外切麦芽四糖水解酶)(麦芽四糖形成外切淀粉酶)。SWISS-PROT登记号(accessionnumber)是P22963。图IOA和IOB显示了嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶的核酸序列(SEQIDNO6)。编码麦芽四糖水解酶的嗜糖假单胞菌mta基因(EC登记号=3.2.I.60)。GenBank登记号是X16732。图11显示了施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQIDNO7)。图12显示了PStu-D34的序列(SEQIDNO8);施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N取代。图13显示了PStu-D20的序列(SEQIDNO9);施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N和G121D。图14显示了PStu_D14的序列(SEQIDNO10);施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶的氨基酸序列，其带有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、G121D和G87S。图15显不了施氏假单胞菌(Pseudomonasperfectomarina)的序列(SEQIDNO:11)。葡聚糖1，4-a-麦芽四糖水解酶前体(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(麦芽四糖形成淀粉酶)(外切麦芽四糖水解酶)(麦芽四糖形成外切淀粉酶)。SWISS-PR0T登记号P13507。图16显示了施氏假单胞菌麦芽四糖水解酶核酸序列的序列。施氏假单胞菌麦芽四糖形成淀粉酶(_yP)基因的全长编码序列(completecds.)GenBank登记号M24516(SEQIDNO:12)。具体实施例方式如无其它指明，本发明的实践将采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术，这些都包含在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术在文献中得到阐述。参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等(1995和定期增刊；CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,和16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,和A.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,JohnWiley&Sons；J.M.Polak和James0'D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(编者)，1984,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.I,作者是EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManual,作者是EdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855,Lars-IngeLarsson"ImmunocytochernistryTheoryandPractice",CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988,ISBN0-8493-6078-1,JohnD.Pound(ed)；"ImmunochemicalProtocols,vol80"，来自系列"MethodsinMolecularBiology",HumanaPress,Totowa,NewJersey,1998,ISBN0-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,由RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes编辑(2001，NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)JPLabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。这些普通文献中的每一个在此并入，作为参考。如本文所应用，“PS4”是指有关嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶的家族成员，或与嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶具有序列同源性或功能上同源性的家族成员，嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶如具有SEQIDNO1或SEQIDNO5列出的氨基酸序列的外切淀粉酶，施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶如具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:11列出的氨基酸序列的多肽。其它的家族成员在表I中列出。对来源于嗜糖假单胞菌外切淀粉酶的PS4变异体的位置编号是参照SEQIDN01IDQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPNDffYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPff61RDFSSffTDGGKSGGGEGYFffHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNR121GYPDKEINLPAGQGFffRNDCADPGNYPNDCDD⑶RFIGGESDLNTGHPQIYGMFRDELAN181LRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKGPSEYPSffDffRNTASffQQ241IIKDffSDRAKCPVFDFALKERMQNGSVADffKHGLNGNPDPRffREVAVTFVDNHDTGYSPG301QNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYffSHMYDffGYGDFIRQLIQVRRTAGVRAD361SAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQYRVffRSGS421⑶GGGNDGGEGGLVNVNFRCDNGVTQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPASAVRLTDTSSYPTff481KGSIALPDGQNVEffKCLIRNEADATLVRQffQSGGNNQVQAAAGASTSGSF参照序列来自嗜糖假单胞菌序列，其SWISS-PR0T登记号是P22963，但是没有信号序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA。尽管是用特定的序列作为基本参照点，但该编号系统也可以适用于所有相关的同源序列。例如，该位置编号可以被用于来自其它假单胞菌种的同源序列，或来自其它细菌的同源序列。优选地，这种同源序列有60%或更多的同源性，例如70%或更多、80%或更多、90%或更多或95%或更多的同源性，这是相对于参照序列SEQIDNO:1而言的。可以用本文描述的公知的联配程序和杂交技术确认蛋白之间的序列同源性。对来源于施氏假单胞菌的PS4变异体的位置进行的编号是参照SEQIDNO7IDQAGKSPNAVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPNDffYNILRQQAATIAADGFSAIWMPVPff61RDFSSffSDGSKSGGGEGYFffHDFNKNGRYGSDAQLRQAASALGGAGVKVLYDVVPNHMNR121GYPDKEINLPAGQGFffRNDCADPGNYPNDCDD⑶RFIGGDADLNTGHPQVYGMFRDEFTN181LRSQYGAGGFRFDFVRGYAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPNWDffRNTASffQQ241IIKDffSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADffKHGLNGNPDPRffREVAVTFVDNHDTGYSPG301QNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYffSHMYDffGYGDFIRQLIQVRRAAGVRAD361SAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLVVALNSDLGNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVffRSGT421GSGGGEPGALVSVSFRCDNGATQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPAAALRLTDTSGYPTffKGS481IALPAGONEEWKCLIRNEANATQVRQffQGGANNSLTPSEGATTVGRL如本文所应用，“PS4变异核酸”(PS4variantnucleicacids)是指编码PS4多肽的核酸，所述多肽是PS4家族成员的变异体。如本文所应用，“PS4变异多肽”(PS4variantpolypeptides)或“PS4变异体”(PS4variant)是指多肽，所述多肽是PS4家族成员的变异体。如本文所应用，“亲代酶”(parentenzymes)、“亲代序列”(parentsequence)、“亲代多肽”(parentpolypeptide)、“亲代多肽”(parentpolypeptides)是指酶和多肽，PS4变异多肽是基于所述的酶和多肽。亲代酶可以是前体酶(即，实际上被突变的酶)或其可以被从头制备。亲代酶可以是野生型的酶。如此处所应用，“变异体”(variant)意味着衍生自亲代分子的分子。变异体将包括多肽以及核酸。其中，变异体将包括在一个或多个位点处的取代、插入、颠换和倒位。变异体也将包括截短。变异体将包括亲代分子的同源衍生物和功能衍生物。变异体还包括这样的序列，其与能够杂交于本文列出的核苷酸序列的序列互补。例如，变异体序列互补于这样的序列，所述序列能够在严紧条件下(例如50°C和0.2xSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015M柠檬酸三钠pH7.0})和本文出现的核苷酸序列杂交。更优选地，术语变异体包括互补于下述序列的序列，其能够在高度严紧的条件下(例如，65°C和0.IxSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015M柠檬酸三钠pH7.0})和本文出现的核苷酸序列杂交。如本文所应用，“前体”(precursor)是指用于产生修饰的酶的酶。前体可以是通过突变被修饰的酶。同样地，前体可以是野生型的酶、变异的野生型酶或已经突变的酶。如本文所应用，亲代酶的“功能上的等价物"(functionalequivalent)是指,和亲代分子有相似或相同功能的分子。亲代分子可以是嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶或从其它来源得到的多肽。功能上等价的酶可以有不同的氨基酸序列但具有非产麦芽外切淀粉酶活性。本文描述了确定功能的分析的实例，这对本领域的技术人员是已知的。如本文所应用，“分离的”(isolated)是指，序列至少基本上游离于至少一种其它组分，所述组分是与所述序列天然联系的并在天然中发现的。如本文所应用，“纯化的”(purified)是指，序列处于相对纯的状态——例如，至少大约90%纯度，或至少大约95%纯度或至少大约98%纯度。如本文所应用，“淀粉酶”(amylase)是指这样的酶，其尤其能够催化淀粉的降解。淀粉酶是水解酶，其切割淀粉中的a-D_(l—4)0-糖苷键。通常地，a-淀粉酶(E.C.3.2.I.I,a-D-(I—4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为，以随机方式切割淀粉分子中的a-D-(l—4)0-糖苷键的内作用酶(endo-actingenzymes)。与之对照,外作用淀粉分解酶(exo-actingamylolyticenzymes)如3-淀粉酶(E.C.3.2.I.2,a-D-(I—4)-葡聚糖麦芽水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽a-淀粉酶(E.C.3.2.I.133)，从底物的非还原末端切割淀粉分子。P-淀粉酶、a-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.I.20,a-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.I.3，a-D-(I—4)-葡聚糖葡糖水解酶)，和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦芽寡糖。如本文所应用，“非产麦芽外切淀粉酶”(non-maltogenicexoamylaseenzyme)是指这样的酶，其起初并不降解淀粉为实质量的麦芽糖。用于实施这种确认的分析方法提供于本文。如本文所应用，“线性的麦芽寡糖”(linearmalto-oligosaccharide)是指，由a-(I-4)键连接的2-20个单位的a-D-吡喃型葡萄糖。如本文所应用，“热稳定的"(thermostable)涉及酶暴露于升高的温度之后保持活性的能力。酶如非产麦芽外切淀粉酶的热稳定性是通过其半衰期来测定的。半衰期(t1/2)是以分钟表示的时间，在此时间期间内，在限定的条件下，酶活性的一半丧失。半衰期值是通过测定残留的淀粉酶活性而计算的。半衰期分析如实施例中更详细的描述而进行。如本文所应用，“pH稳定的”(pHstable)是指酶在宽范围的pHs下保持活性的能力。PH分析如实施例所描述而进行。如本文所应用，“外切特异性的”(exo-specific)涉及改进的，例如，增加的“外切特异性指数”(exo-specificityindex),如与未取代的外切淀粉酶的外切特异性比率相比较时。如本文所应用，“外切特异性指数”(exo-specificityindex)是指总淀粉酶活性与总内切淀粉酶活性的比率。测定淀粉酶和内切淀粉酶活性的分析方法提供于本文。如本文所应用，“食物”将包括制备好的食物以及食物的成分，如面粉。如本文所应用，“食物成分”(foodingredient)将包括配方(制剂)，其可以是功能食品(functionalfoods)或食品原料(foodstuffs)或可以被加入功能食品或食品原料，并包括以低水平应用于宽范围产品中的配方，所述产品需要例如酸化或乳化。食物成分可以是溶液的形式或固体形式——这取决于用途和/或应用的方式和/或给予的方式。如本文所应用，“功能食品”是指这样的食品，其不仅能够提供营养效果和/或味觉上的满足，也可以向消费者传递进一步的有益效果。如本文所应用，“氨基酸序列”和术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”和术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”和术语“酶”同义。如本文所应用，“类肽形式”(peptoidform)是指变异的氨基酸残基，其中a-碳取代基是在残基的氮原子上而不是在a-碳上。制备类肽衍生物形式的肽的方法在本领域中是已知的，例如，SimonRJetal.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和HorwellDC,TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。如本文所应用，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其变异体，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因组来源或合成来源或重组来源，其可以是双链或单链，不论代表正义链或反义链。如此处所应用，术语核苷酸序列包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，它是指DNA，更优选地，是编码PS4变异多肽的cDNA序列。如本文所应用，“淀粉”是指淀粉本身或其组分，特别是支链淀粉。术语“淀粉介质”(starchmedium)是指包括淀粉的任何合适的介质。术语“淀粉产物”(starchproduct)是指包含淀粉或基于淀粉或来自淀粉的任何产物。优选地，淀粉产物包含或基于或来自从小麦粉得到的淀粉。如本文所应用，“面粉”是指小麦或其它谷物的细磨粉末(finely-groundmeal)。例如，面粉可以从小麦本身而不是从其它谷物得到。小麦粉一般指小麦粉本身以及存在于介质如面团中的小麦粉。如本文所应用，“烘焙的含淀粉的面包产品”(bakedfarinaceousbreadproduct)是指基于面团的任何烘焙产品，所述面团可以在形成面团的条件下，通过混合面粉、水和发酵剂得到。可以向面团混合物中加入其它的成分。如本文所应用，“同源物”(homologue)和“同源”(homology)是指这样的实体,它和目标氨基酸序列(subjectaminoacidsequence)和目标核苷酸序列有一定程度的同一性(identity)。同源序列被认为包括与目标序列有至少75%、80%、85%或90%同一性的氨基酸序列，优选地有至少95%、96%、97%、98%或99%是同一的。典型地，同源物将包括和目标氨基酸序列相同的活性位点。如本文所应用，“杂交”将包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。PS4核酸可以作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链或RNA/DNA共聚物而存在。如本文所应用，“共聚物”(copolymer)是指这样的单条核酸链，其包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。PS4核酸甚至可以是被密码子最优化以进一步增加表达。如本文所应用，“合成的”是指通过体外化学合成或酶合成产生的物质。它包括但不限于由宿主生物体如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母的最佳密码子使用而生成的PS4核酸。如本文所应用，“转化的细胞”包括应用重组DNA技术被转化了的细胞。转化通常通过向细胞内插入一个或多个核苷酸序列而发生。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即，该序列对于欲被转化的细胞不是天然的)。此外，或替代地，插入的核苷酸序列可以是同源核苷酸序列(即，该序列对于欲被转化的细胞是天然的)。由此细胞接受一个或多个额外的核苷酸序列拷贝，所述序列已存在于细胞内。如本文所应用可操作地连接的”(operablylinked)是指,所描述的组分处于一种关联中，所述关联允许它们以其所期望的方式起作用。可操作地连接于编码序列的调节序列以这样的方式被连接在和该调控序列相容的条件下，编码序列的表达被实现。如本文所应用生物学上有活性”(biologicallyactive)是指这样的序列，它和天然发生的序列具有相似的结构功能(但是不一定是相同的程度)，和/或相似的调节功能(但是不一定是相同的程度)，和/或相似的生物化学功能(但是不一定是相同的程度)。I.对本发明多肽的详述在第一方面，本发明通提供了包括PS4变异体的多肽，PS4变异体来自亲代多肽。亲代酶可以优选地是非产麦芽外切淀粉酶，优选地是细菌非产麦芽外切淀粉酶。亲代酶可以优选地是显示出非产麦芽外切淀粉酶活性的多肽。亲代酶可以是嗜糖假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶，如SEQIDNO:1或SEQIDNO5列出的外切淀粉酶。亲代酶可以是施氏假单胞菌非产麦芽外切淀粉酶，如SEQIDN0:7或SEQIDNO:11列出的多肽。PS4家族的其它成员可以被用作亲代酶，如下面的表I所列出。优选地，PS4家族成员将通常地和SEQIDNOUSEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:11列出的外切淀粉酶相似、同源或功能上等价，并可以用标准方法鉴定，如用探针对合适的文库进行杂交筛选，或用基因组测序分析。鉴定方法如下列出。权利要求1.具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶，其选自以下组成的组(a)包含序列表SEQIDNO:15列出的氨基酸序列的具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶；和(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的由(a)的非产麦芽外切淀粉酶衍生的具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶；其中与亲本多肽或野生型多肽相比，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的热稳定性。2.具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶，其选自以下组成的组(a)包含序列表SEQIDNO:15列出的氨基酸序列的具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶；和(b)由以下核苷酸序列编码的具有淀粉酶活性的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述核苷酸序列与能够在严格条件(例如50°C和0.2xSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015M柠檬酸三钠pH7.0})下与编码序列表SEQIDNO:15所示非产麦芽外切淀粉酶的核苷酸序列杂交的核苷酸序列互补；其中与亲本多肽或野生型多肽相比，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的热稳定性。3.非产麦芽外切淀粉酶，(a)其中，所述非产麦芽外切淀粉酶包含与SEQIDNos:24或1315之一至少90%是相同的氨基酸序列，并且包含157位点的取代，其中对位置所进行的编号是參照SEQIDNO:I列出的嗜糖假单胞菌序列，且所述氨基酸序列具有157位点的I157L取代，并且其中与由SEQIDNO:1列出的氨基酸序列组成的亲本多肽相比，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的热稳定性；或(b)其中，所述非产麦芽外切淀粉酶包含与SEQIDNos810之一至少90%是相同的氨基酸序列，并且包含157位点的取代，其中对位置所进行的编号是參照SEQIDN0:1列出的嗜糖假单胞菌序列，且所述氨基酸序列具有157位点的I157L取代，并且其中与由SEQIDNO7列出的氨基酸序列组成的亲本多肽相比，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的热稳定性。4.如权利要求I或2所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述非产麦芽外切淀粉酶(b)具有157位点的氨基酸取代，其中对位置所进行的编号是參照SEQIDNO:1列出的嗜糖假单胞菌序列。5.如权利要求I或2所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述非产麦芽外切淀粉酶(b)的157位氨基酸被L取代，其中对位置所进行的编号是參照SEQIDNO1列出的嗜糖假单胞菌序列。6.如前述任一项权利要求所述的外切淀粉酶，其还包含选自以下的至少ー个取代G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、A199V、G223A、V290I、H307L、I315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。7.如前述任一项权利要求所述的外切淀粉酶，其还包括至少ー个另外的取代，位置选自:33、34、71、87、121、134、141、178、179、223、307、334和343。8.权利要求7所述的外切淀粉酶，其中所述至少ー个另外的取代选自N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。9.权利要求7所述的外切淀粉酶，其进ー步包括至少ー个另外的取代，位置选自108、158,171和188。10.权利要求9所述的外切淀粉酶，其中所述至少ー个另外的取代选自K108R、G158D、Y171S和G188A。11.如前述任一项权利要求所述的外切淀粉酶，其包含选自以下取代的组合G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G87S,G121D,S214N,T375A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D,Y171S,G188A,N138D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G188A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,K71R,L178F,A179T；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,L178F,A179T；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,L178F,A179T；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,L178F,A179T,G87S,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,L178F,A179T,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D,E343D；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,Y33N,N34D,E343D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,K71R,L178F,A179T,G121D；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；113F,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A99V,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A199V,D343E,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,G188S,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,L178L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I，G134R，A141P,I157L,11701，Y198F，G223A,V290I，H307L，G313G,S334P,D343E；V113I，G134R，A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I，H307L，G313G,S334P,D343E；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405V；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198L,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K108R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；D34G,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；G4D,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,G134R,G223A,H307L,I157L,V113I,V290I,Y198F和G188A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P。12.如权利要求I5中任一项所述的外切淀粉酶，其中所述淀粉酶包括选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:8、SEQIDNO9和SEQIDNO10的氨基酸序列。13.如前述任一项权利要求所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中所述外切淀粉酶具有选自下列的ー个或多个位置:4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405的氨基酸取代，其中位置编号是參照SEQIDNO1列出的嗜糖假单胞菌序列。14.如权利要求1-13中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其缺乏存在于非产麦芽外切淀粉酶中的一个或多个结构域。15.如权利要求1-14中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其缺乏淀粉结合结构域，其中所述淀粉结合结构域对应于429位之后的氨基酸，其中的位置编号是參照SEQIDNOI列出的嗜糖假单胞菌序列。16.一种制备食物产品的方法，其包括(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质中加入权利要求I15中任一项所述的外切淀粉酶。17.ー种食物产品，其由权利要求16所述的方法制备。18.—种非产麦芽外切淀粉酶,其用于权利要求16所述的方法。19.一种制备面包产品的方法，包括(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质加入权利要求I15中任一项所述的外切淀粉酶；和(c)在步骤(b)期间或之后向所述淀粉介质施加热，以产生面包产品。20.ー种面包产品，其由权利要求19所述的方法制备。21.—种非产麦芽外切淀粉酶,其用于权利要求19所述的方法。22.—种延迟或阻止或减慢食物产品中淀粉的有害退化的方法，其中向面团中添加权利要求I15中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶、23.ー种食物产品，其由权利要求22所述的方法制备。24.—种非产麦芽外切淀粉酶,其用于权利要求22所述的方法。25.权利要求I15、18、21或24所述的非产麦芽外切淀粉酶用于增加烘焙产品的体积的应用。26.权利要求I15、18、21或24所述的非产麦芽外切淀粉酶用于食物产品以延迟或阻止或减慢淀粉的有害退化的应用。27.如权利要求I15、18、21或24所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中在从55°C至95°C或更高的高温下，所述非产麦芽外切淀粉酶的半衰期相对于亲代酶延长10%或更多，延长50%或更多，或延长100%或更多。28.如权利要求27所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中高温为80°C。29.如权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其与亲本多肽相比具有更高的PH稳定性。30.如权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中在相同的PH条件下，与其亲代多肽相比较时，所述非产麦芽外切淀粉酶具有多出10%或更长，多出50%或更长，或多出100%或更长的半衰期。31.如权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中与其亲代酶相比较，所述非产麦芽外切淀粉酶具有更高的外切特异性。32.如权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶，其中在相同条件下，与其亲代多肽相比较，所述非产麦芽外切淀粉酶具有高出10%或更高，高出50%或更高，或高出100%或更高的外切特异性指数。33.核酸，其编码权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶。34.载体，其包含权利要求33所述的核酸。35.宿主细胞，其包含权利要求34所述的载体。36.用于制备食品产物的组合物，其包含权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶。37.如权利要求36所述的组合物，其包含另外的成分或另外的酶或两者。38.如权利要求37所述的组合物，其中所述另外的酶选自以下组成的组氧化还原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂加氧酶。39.如权利要求37所述的组合物，其中所述酶是来自杆菌的产麦芽淀粉酶。40.如权利要求3739中任一项所述的组合物，其中所述非产麦芽外切淀粉酶是EP120693中公开的来自杆菌的产麦芽a-淀粉酶，或其具有a-淀粉酶活性的变异体、同源物或突变体，或具有所述产麦芽a-淀粉酶或其具有a-淀粉酶活性的变异体、同源物或突变体的组合物。41.权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶在制备食物产品或作为食品成分中的应用。42.如权利要求41所述的应用，其中所述食物产品包括面团产品。43.如权利要求41或42所述的应用，其中所述食物产品包括煎的、油炸的、烤的、烘焙的、蒸的和煮的面团产品。44.如权利要求41所述的应用，其中所述食物产品包括烘焙产品。45.面团改良组合物，其包含权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶和至少ー种其他面团成分或面团添加剤。46.—种表达权利要求I15、18、21或24中任一项所述的非产麦芽外切淀粉酶的方法,所述方法包括将权利要求34所述的载体导入相容性宿主细胞，并使所述宿主细胞在载体可复制的条件下生长。全文摘要本发明涉及淀粉酶多肽和编码所述多肽的核酸及其用途。本发明的淀粉酶被设计为具有更多的有益性质。具体来说，本发明的淀粉酶显示了改变的外切特异性。文档编号C12N15/74GK102796717SQ201210244518公开日2012年11月28日申请日期2004年7月7日优先权日2003年7月7日发明者C·T·贝尔格,K·博伊森,P·M·F·德克斯,C·费奥雷西,G·赫里兹,K·M·克拉,W·刘,A·肖,C·R·索达尔申请人:金克克国际有限公司,杜邦营养生物科学有限公司