专利名称：一种用产酸废水异养培养小球藻的方法
技术领域：
本发明涉及一种培养小球藻的方法。
背景技术：
化石燃料耗尽是全球关注的一个焦点，现有的科技技术也不能解决目前的能源需求问题。对原油的大量应用导致化石燃料价格的增加(其中运输系统是消耗主体)，此外，由于温室气体排放量增加，引起了环境问题。因此对可再生能源的开发成为能源与环境领域的研究热点，例如太阳能、生物质能、地热、水和风能其中，生物质能。因为可再生能源的可再生性、可生物降解性、无毒性，使其成为一种非常具有潜力的能源，并且具有大量的资源来源，例如，农牧业废弃物、市政废弃物、工业废弃物、陆生和水生植物。
目前，可以替代传统柴油的能源是生物柴油。种植陆生作物来提取生物柴油具有很大的吸引力，但是由于土地的限制因素，在理论上很难成立，因为这对经济和能源平衡发展不利(Klass，1979)。在生物能源的研究中，原料的高成本和生态-食物链系统是必须要考虑的因素。与传统作物的油料作物种子不同，微藻可以固定高浓度工业二氧化碳，具有更高的光合效率，更高的生物积累量，生长更快，还具有多样的代谢物，能够在开放式池塘跑道系统和密闭发酵系统中生长，而不必占用耕地和森林。此外研究表明，某些微藻在异养条件或混合培养条件下，与自养条件相比，会生长得更快，并且会积累更多的生物量和油脂含量。所以，微藻产生物柴油成为一个研究的热点。虽然目前国内对于微藻能源的研究很多，但是以工农业废水作为培养基的研究还是近几年才兴起的，系统全面地综述还是空白。生活污水、许多工业排放的废水以及农业废水中留有大量的有机碳、无机盐，这些废水的排放不仅污染环境而且造成资源浪费。将这些蕴藏的潜在的废碳源加以利用，来培养异养藻，就会在废水资源化的同时大大降低了生物柴油制备成本，对商业化具有很大的贡献。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有微藻生产生物柴油成本高的问题，而提供一种用产酸废水异养培养小球藻的方法。本发明的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法是按照以下步骤进行一、产酸废水首先采用中空纤维膜过滤，然后加入氮源、磷源和微量元素，混合均匀后，调节PH值至
6.8，然后进行灭菌处理，得培养液；二、将步骤一得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中按体积百分比为109^20%的接种量接种小球藻至培养液中，然后置于振荡培养箱中培养15(Tl80h，即完成小球藻的培养；其中，步骤一培养液中氮源浓度为20(T300mg/L，培养液中磷源浓度为20(T300mg/L，培养液中微量元素浓度为lmL/L，培养液中产酸废水浓度为500(T6000mg/L，步骤二中所述的培养条件为0 lux、30°C和120rpm。本发明产酸废水为有机废水的产酸发酵废液，其中所述的有机废水为糖蜜废水、食品加工废水、啤酒废水、淀粉加工废水或乳品废水。本发明包含以下有益效果本发明应用的产酸废水含有很多小分子有机酸，主要包括乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，戊酸和异戊酸。小球藻能够利用这些小分子有机酸来进行细胞生长和合成能量物质储存。其中，戊酸、丁酸、乙醇和丙酸量的一半用于小球藻细胞的生长，而丙酸量的一半和所有的乙酸被小球藻用来合成能量物质储存，存储物质的合成是因为异养培养小球藻时有机底物的直接氧化的结果；并且，乙酸和丁酸可以被同化吸收用于细胞生长，乙酸可以作为较理想的碳源，并可转化为脂肪。在小球藻生长过程中，氮磷营养元素也被很好地利用，在小球藻的适应期和对数期利用速率最快，到达稳定期后，基本不再消耗。多糖水解为单糖，蛋白质被小球藻细胞分泌的胞外酶降解为氨基酸，这些单糖和氨基酸被小球藻吸收来生长并合成能量物质进行储存。本发明所用的产酸废水为糖蜜废水、食品加工废水、啤酒废水、淀粉加工废水、乳品废水等有机废水的产酸发酵废液。上述废水均属于中、高浓度有机废水，且废水中不含有毒有害物质，适宜利用厌氧处理技术进行处理。用上述废水的产酸废液异养培养小球藻制备生物柴油，能够节省小球藻的生产成本，为生物柴油的商业化生产提供廉价的原料的同时实现废弃物资源化。
图I为不同灭菌预处理方式培养小球藻的生物量曲线图；其中， 为高压蒸汽灭菌培养小球藻的生物量曲线，《0_为0. 22 ilm微孔过滤器过滤灭菌小球藻的生物量曲线.图2为产酸废水、15g/L葡萄糖SE培养基与5g/L葡萄糖SE培养基异养培养小球藻的生物量曲线图;其中,为15g/L葡萄糖SE培养基培养的小球藻生物量曲线,_q_为5g/L葡萄糖SE培养基培养的小球藻生物量曲线,_0_为产酸废水培养的小球藻生物量曲线.图3产酸废水与15g/L葡萄糖SE培养基、5g/L葡萄糖SE培养基异养培养小球藻的含油量柱状图；为■为15g/L葡萄糖SE培养基培养小球藻含油量柱状图,圖为5g/L葡萄糖SE培养基培养的小球藻含油量柱状图，圖为产酸废水培养小球藻的含油量柱状图；图4为产酸废水中各组分在小球藻生长过程中的消耗曲线图；其中，--为乙醇
消耗曲线，~D-为乙酸消耗曲线，—a—为丙酸消耗曲线，-O-为丁酸消耗曲线，—*—: 戊酸消耗曲线， :为生物量。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法是按照以下步骤进行一、产酸废水首先采用中空纤维膜过滤，然后加入氮源、磷源和微量元素，混合均匀后，调节PH值至6. 8，然后进行灭菌处理，得培养液；二、将步骤一得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中按体积百分比为109^20%的接种量接种小球藻至培养液中，然后、置于振荡培养箱中培养15(Tl80h,即完成小球藻的培养；其中，步骤一培养液中氮源浓度为20(T300mg/L，培养液中磷源浓度为20(T300mg/L，培养液中微量元素浓度为lmL/L，培养液中产酸废水浓度为500(T6000mg/L，步骤二中所述的培养条件为01ux、30°C和120rpm。本实施方式应用的产酸废水含有很多小分子有机酸，主要包括乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，戊酸和异戊酸。小球藻能够利用这些小分子有机酸来进行细胞生长和合成能量物质储存。其中，戊酸、丁酸、乙醇和丙酸量的一半用于小球藻细胞的生长，而丙酸量的一半和所有的乙酸被小球藻用来合成能量物质储存，存储物质的合成是因为异养培养小球藻时有机底物的直接氧化的结果；并且，乙酸和丁酸可以被同化吸收用于细胞生长，乙酸可以作为较理想的碳源，并可转化为脂肪。在小球藻生长过程中，氮磷营养元素也被很好地利用，在小球藻的适应期和对数期利用速率最快，到达稳定期后，基本不再消耗。多糖水解为单糖，
蛋白质被小球藻细胞分泌的胞外酶降解为氨基酸，这些单糖和氨基酸被小球藻吸收来生长并合成能量物质进行储存。本实施方式的产酸废水为糖蜜废水、食品加工废水、啤酒废水、淀粉加工废水、乳品废水等有机废水的产酸发酵废液。用产酸废水异养培养小球藻制备生物柴油，能够节省小球藻的生产成本，为生物柴油的商业化生产提供廉价的原料的同时实现废弃物资源化。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中所述的中空纤维膜过滤的截留分子量为20kDa。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一至二不同的是步骤一中所述的灭菌预处理为采用高压蒸汽灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌压强为121KPa，灭菌时间为30min ;或者采用过滤孔径为0. 22um的微孔过滤器进行灭菌。其它与具体实施方式
一至二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中所述的产酸废水为有机废水的产酸发酵废液。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤一中所述的氮源为硝酸铵、氯化铵、硫酸铵或尿素。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中所述的磷源为磷酸氢盐或磷酸二氢盐。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤一中所述的微量元素是由 286mg/L 的 H3B03、80mg/L 的 CuSO4 *5H20U86mg/L 的 MnCl2 *4H20,390mg/L 的 Na2MoO4 2H20、50mg/L 的 Co (NO3)2 6H20 和 220mg/L 的 ZnSO4 7H20 组成的。其它与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤二中所述的小球藻的吸光度为广2。其它与具体实施方式
一至七之一相同。通过以下试验验证本发明的效果本试验的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法是通过以下步骤进行的一、取厌氧产酸反应器(CSTR :continuous-flow stirred tank reactor)的产酸废水采用过滤孔径为0. 22um的中空纤维膜过滤，加入终浓度为250mg/L的氮源、终浓度为250mg/L的磷源和终浓度为lmL/L的微量元素，混合均匀后，调节pH至6. 8，然后在121 °C，12IKPa条件下进行高压锅蒸汽灭菌30min，得培养液；二、将步骤一得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中按体积百分比为15%的接种量接种对数生长后期，OD值在f 2的小球藻至培养液中，然后置于振荡培养箱中，在培养条件为01uX，30°C，120rpm的条件下，进行培养168h，即完成小球藻的培养；其中，产酸废水的终浓度为5300mg/L。本试验的小球藻(Chlorella Protothecoides)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，保藏编号为FACHB-3，来源于捷克布拉格大学。将按照上述步骤培养得到的小球藻进行油脂提取和生物柴油制取采用离心法收集小球藻，在60°C温度下烘干至恒重，采用溶液浸提法，用有机溶剂在180rpm转速下反应8h，提取小球藻的油脂(为了做到没有气体挥发，盛有有机溶剂的锥形瓶瓶口需要用铝箔纸密封);再加入40mL蒸馏水作为诱导两相稳定的引导，然后放入恒定的温度振动箱中，采用脂肪酶进行酯交换反应，酯交换反应后将反应物通过分液漏斗分层，将上层的物质分离出后，用50°C蒸馏水洗涤至pH为7.0，即得生物柴油；其中，酯交换反应是指加入75%脂肪酶(基于油重)和10%的蒸馏水(基于油重)，然后按甲醇与油脂的摩尔比 为3:1的比例均分为3次加入甲醇，在温度为38°C，pH值为7. 0，转速为180rpm反应4h。本试验中的有机溶剂是由正己烷异丙醇按体积比为3:2的比例混合而成。本试验的脂肪酶是购买得到的。通过气相色谱和质谱(GC-MS法)确定本试验得到的生物柴油成分为烷酸甲酯和油酸甲酯。说明采用本试验产酸废水异养培养的小球藻能够有效地制备生物柴油。同时，在不同培养条件下，检测小球藻生长过程中的生物量和含油量的变化情况。分别采用高压锅蒸汽灭菌、0.22 Pm微孔过滤器过滤灭菌后，采用本发明的方法培养小球藻,检测小球藻生长过程中的生物量变化。结果如图I所示，由图I可知高压锅蒸汽灭菌能够杀灭所有微生物，0. 22um微孔滤膜可以过滤掉大部分细菌，培养液中可能会残存少量的小于0. 22un的细菌、病毒、孢子，会与小球藻竞争营养物，最优的预处理方式为高压锅蒸汽灭菌；同时，将本发明中的产酸废水培养液与15g/L葡萄糖SE培养基和5g/L葡萄糖SE培养基作为对照，其中，15g/L的葡萄糖浓度是最佳培养小球藻的浓度，5g/L的葡萄糖浓度与产酸废水具有与本发明产酸废水相同的COD浓度。另外，在超净工作台中按体积百分比为1(T20%的量将小球藻接种到上述三种培养基中，在培养条件为01ux，30°C，120rpm下，进行培养小球藻168h，检测小球藻的生物量变化。结果如图2所示，由图2可知在小球藻生长过程中的所有时间里，利用产酸废水培养获得的生物量要比利用5g/L葡萄糖溶液培养获得的生物量优越，含油量相当，表明，利用产酸废水作为有机碳源来培养小球藻是可行的；同时检测了小球藻的含油量变化，结果如图3所示，由图3可知在稳定期末期，产酸废水、15g/L葡萄糖溶液、5g/L葡萄糖溶液培养获得的小球藻的含油量分别为25. 37%，31. 05%, 22. 54%，产酸废水的含油量低于最佳培养条件15g/L葡萄糖溶液时的含油量，高于相同COD (5g/L葡萄糖溶液)葡萄糖培养基的含油量，表明产酸废水培养小球藻制备生物柴油可行。对本发明产酸废水培养液的小分子酸消耗情况进行检测，结果如图4所示，由图4可知戊酸、丁酸、乙醇和丙酸量的一半用于小球藻细胞的生长，而丙酸量的一半和所有的乙酸被小球藻用来合成能量物质储存(结合小球藻的生物量图 2)。
权利要求
1.一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于用产酸废水异养培养小球藻的方法是按照以下步骤进行一、产酸废水首先采用中空纤维膜过滤，然后加入氮源、磷源和微量元素，混合均匀后，调节PH值至6. 8，然后进行灭菌处理，得培养液；二、将步骤一得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中按体积百分比为109^20%的接种量接种小球藻至培养液中，然后置于振荡培养箱中培养15(Tl80h,即完成小球藻的培养；其中，步骤一培养液中氮源浓度为20(T300mg/L，培养液中磷源浓度为20(T300mg/L，培养液中微量元素浓度为lmL/L，培养液中产酸废水浓度为500(T6000mg/L，步骤二中所述的培养条件为Olux、30°C 和 120rpm。
2.根据权利要求I所述的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤一中所述的中空纤维膜过滤的截留分子量为20kDa。
3.根据权利要求I所述的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤一中所述的灭菌预处理为采用高压蒸汽灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌压强为121KPa，灭菌时间为30min ;或者采用过滤孔径为0. 22um的微孔过滤器进行灭菌。
4.根据权利要求I所述的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤一中所述的产酸废水为有机废水的产酸发酵废液。
5.根据权利要求I所述的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤一中所述的氮源为硝酸铵、氯化铵、硫酸铵或尿素。
6.根据权利要求I所述的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤一中所述的磷源为磷酸氢盐或磷酸二氢盐。
7.根据权利要求I所述的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤一中所述的微量元素是由 286mg/L 的 H3B03、80mg/L 的 CuSO4 5H20、186mg/L 的 MnCl2 4H20、390mg/L 的 Na2MoO4 2H20、50mg/L 的 Co (NO3)2 6H20 和 220mg/L 的 ZnSO4 7H20 组成的。
8.根据权利要求I所述的一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤二中所述的小球藻的吸光度为广2。
全文摘要
一种用产酸废水异养培养小球藻的方法，它涉及一种培养小球藻的方法。本发明要解决现有微藻生产生物柴油成本高的问题。本发明的方法为一、产酸废水首先采用中空纤维膜过滤，然后加入氮源、磷源和微量元素，混合均匀后，调节pH至6.8，灭菌得培养液；二、按体积百分比为10%~20%的接种量接种小球藻至培养液中，在培养条件为0lux，30℃，120rpm的条件下，进行培养150~180h，即完成小球藻的培养。本发明异养培养微藻制备生物柴油提供了廉价的原料，降低了原料成本的同时实现了废弃物资源化。本发明应用于生物柴油制备领域。
文档编号C12N1/12GK102746991SQ201210244498
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者李硼飞, 温沁雪, 陈志强, 韩宇驰 申请人:哈尔滨工业大学