专利名称：线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，是一种线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术。
背景技术：
作为细胞代谢网络和信号传导网络的重要调控细胞器，线粒体在生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡等多个方面表 现出重要作用。大量的流行病学资料表明，mtDNA突变或拷贝数异常与多个系统、多种疾病的发生密切相关，如线粒体脑肌病、Leger遗传性视神经病、神经退行性疾病、肿瘤、心肌病、糖尿病、先天性失明等。统计学数据显示,0.092%的成年人患有临床线粒体性疾病，0.165%的儿童和成年人易患线粒体性疾病。
发明内容
本发明的目的在于发明一种线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，为更好地了解线粒体数与疾病发病关系提供细胞研究模型，加快线粒体疾病的研究。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，包括以下步骤:
a.线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立
步骤1:将永生化人支气管上皮细胞常规培养在37°C含有5% 二氧化碳的培养箱中，使用线粒体敲除诱导培养基培养9天，2至3天更换一次所述线粒体敲除诱导培养基；
步骤2:使用线粒体拷贝数减少的维持培养基继续培养所述永生化人支气管上皮细胞30天，2至3天更换一次所述线粒体拷贝数减少的维持培养基；
b.real time quantitative PCR检测所述永生化人支气管上皮细胞中线粒体拷贝数 步骤1:参照细胞全基因组提取试剂盒的操作说明，所述永生化人支气管上皮细胞经
胰酶消化，离心后收集，提取所述永生化人支气管上皮细胞全基因组DNA，紫外分光光度计测定吸光度A260、A280值，确定DNA纯度及含量；
步骤2:采用mtDNA编码的16S和NDl扩增mtDNA，核基因编码的18S扩增nDNA，以GAPDH作内参基因；
步骤3:建立25μ I的PCR反应体系，其中2μ I的DNA，0.5 μ M正反引物各I μ 1，12.5μ I 2X SYBR green PCR Master Mix,8.5μ L.每个样品设6个复孔，其中3个孔扩增nDNA，3个孔扩增mtDNA。Real-time PCR的循环参数:预变性95°C 10 min ;变性95°C15s，复性60°C I min，延伸72°C lmin，共40个循环；最后72°C延伸10 min。扩增结束后软件分析计算DNA相对表达量。使用7500Real-Time PCR System的分析软件，将所述永生化人支气管上皮对照组细胞ND1/18S或16S/18S的比值设定为1，利用Comparative Ct方法计算EB处理后所述永生化人支气管上皮细胞的mtDNA相对拷贝数。
进一步的，常规培养基成分为:4.5 g/L的高糖DMEM培养基，10% FBS, 100IU/ml青霉素，100 μ g/ml链霉，所述线粒体敲除诱导培养基是在所述常规培养基中加50ng/ml EB, 100 μ g/ml丙酮酸钠、50 μ g/ml尿喃唳合成,所述线粒体拷贝数减少的维持培养基是在所述常规培养基中加12.5 ng/ml EB, 100 μ g/ml丙酮酸钠、50 μ g/ml尿嘧啶合成。与现有技术相比，本发明具有以下优点:
本发明提供了一种线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，为更好地了解线粒体数与疾病发病关系提供了较好的细胞研究模型，对于阐明线粒体疾病的发病机制、减缓线粒体疾病的进展及阻断继发损害具有重要意义。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施例方式下面将结合实施例，来详细说明本发明。线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，细胞系为永生化人支气管上皮细胞。常规培养基成分:4.5 g/L的高糖DMEM培养基，10% FBS, 100 IU/ml青霉素，100 μ g/ml 链霉。线粒体敲除诱导培养基是在所述常规培养基中加50 ng/ml EB, 100 μ g/ml丙酮酸钠、50 μ g/ml尿嘧啶合成。线粒体拷贝数减少的维持培养基是在所述常规培养基中加12.5 ng/ml EB,100 μ g/ml丙酮酸钠、50 μ g`/ml尿喃唳合成。实验试剂:EB、丙酮酸钠、尿嘧啶:Sigma,USA ；FBS =Hyclone ;高糖 DMEM =Gibco,USA。细胞全基因组提取试剂盒QIAmp DNA Blood Mini Kit:Qiagen, Germany ；Power SYBR Green PCR Master Mix:ABI，USA。线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，包括以下步骤:
a.线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立
步骤1:将永生化人支气管上皮细胞常规培养在37°C含有5% 二氧化碳的培养箱中，使用线粒体敲除诱导培养基培养9天，2至3天更换一次所述线粒体敲除诱导培养基；
步骤2:使用线粒体拷贝数减少的维持培养基继续培养所述永生化人支气管上皮细胞30天，2至3天更换一次所述线粒体拷贝数减少的维持培养基；
b.real time quantitative PCR检测所述永生化人支气管上皮细胞中线粒体拷贝数 步骤1:参照细胞全基因组提取试剂盒的操作说明，所述永生化人支气管上皮细胞经
胰酶消化，离心后收集，提取所述永生化人支气管上皮细胞全基因组DNA，紫外分光光度计测定吸光度A260、A280值，确定DNA纯度及含量；
步骤2:采用mtDNA编码的16S和NDl扩增mtDNA，核基因编码的18S扩增nDNA，以GAPDH作内参基因，引物序列见表I ;
权利要求
1.线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，其特征在于，包括以下步骤 a.线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立 步骤I :将永生化人支气管上皮细胞常规培养在37°C含有5% 二氧化碳的培养箱中，使用线粒体敲除诱导培养基培养9天，2至3天更换一次所述线粒体敲除诱导培养基； 步骤2 :使用线粒体拷贝数减少的维持培养基继续培养所述永生化人支气管上皮细胞30天，2至3天更换一次所述线粒体拷贝数减少的维持培养基； b.real time quantitative PCR检测所述永生化人支气管上皮细胞中线粒体拷贝数 步骤I :参照细胞全基因组提取试剂盒的操作说明，所述永生化人支气管上皮细胞经胰酶消化，离心后收集，提取所述永生化人支气管上皮细胞全基因组DNA，紫外分光光度计测定吸光度A260、A280值，确定DNA纯度及含量； 步骤2 :采用mtDNA编码的16S和NDl扩增mtDNA，核基因编码的18S扩增nDNA，以GAPDH作内参基因； 步骤3 :建立25μ I的PCR反应体系，其中2μ I的DNA，O. 5 μ M正反引物各I μ 1，.12. 5μ I 2 X SYBR green PCR Master Mix，8. 5 μ 1，每个样品设6个复孔，其中3个孔扩增nDNA，3 个孔扩增 mtDNA，Real-time PCR 的循环参数预变性 95°C 10 min;变性 95°C 15s,复性60°C lmin，延伸72°C lmin，共40个循环；最后72°C延伸10 min，扩增结束后软件分析计算DNA相对表达量，使用7500 Real-Time PCR System的分析软件，将所述永生化人支气管上皮对照组细胞ND1/18S或16S/18S的比值设定为1，利用Comparative Ct方法计算EB处理后所述永生化人支气管上皮细胞的mtDNA相对拷贝数。
2.根据权利要求I所述的线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，其特征在于常规培养基成分为4. 5 g/L的高糖DMEM培养基，10% FBS, 100 IU/ml青霉素，100 μ g/ml链霉，所述线粒体敲除诱导培养基是在所述常规培养基中加50 ng/ml EB,.100 μ g/ml丙酮酸钠、50 μ g/ml尿嘧啶合成，所述线粒体拷贝数减少的维持培养基是在所述常规培养基中加12. 5 ng/ml EB, 100 μ g/ml丙酮酸钠、50 μ g/ml尿嘧啶合成。
全文摘要
本发明公开了一种线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，包括步骤为线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立,永生化人支气管上皮细胞中线粒体拷贝数的测定,线粒体数目减少的人支气管上皮细胞的长期培养。本发明提供了一种线粒体数目减少的人支气管上皮细胞株的建立和鉴定技术，为更好地了解线粒体数与疾病发病关系提供了较好的细胞研究模型，对于阐明线粒体疾病的发病机制、减缓线粒体疾病的进展及阻断继发损害具有重要意义。
文档编号C12N5/071GK103255100SQ20121024607
公开日2013年8月21日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者李冰燕, 童建, 尉红, 薛莲 申请人:苏州大学