一种尿苷三磷酸的制备方法
【专利摘要】本发明一种尿苷三磷酸的制备方法属于生物合成及生物转化领域。本发明的方法为湿酵母，在低于-20℃下放置72h以上，所得到的高渗透性酵母细胞，其可以高效地转化尿苷酸为尿苷三磷酸。本发明制备渗透酵母的方法可以保持酵母细胞的完整性，无需复杂的处理过程，非常适合大规模的工业化生产。
【专利说明】一种尿苷三磷酸的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物合成及生物转化领域，具体涉及一种尿苷三磷酸的制备方法。
【背景技术】
[0002]尿苷三磷酸(Uridine triphosphate,UTP)为生物细胞内重要的生物活性物质,参与体内多种生化反应。如多糖(糖原或淀粉)的合成，即需要UTP首先与葡萄糖-1-磷酸反应生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，并以此为底物合成糖原或淀粉链；又如核糖核酸(RNA)的合成即需要UTP直接参与。
[0003]近年来，UTP作为药物在临床上也有一些发展。如，UTP及其衍生物可用于治疗肺部囊状纤维疾病，促进肺病患者痰的咳出(USP 5292498，Richard C.Boucher, 1994)；Theodore Page 将其用于泛自闭症儿童的治疗(Theodore P., Pr0.Neuro-Psych0.Biol0.Psyh.,2002,26:397-400)。另外，在细胞的信号转导方面也发现UTP表现出重要的功能(Christopher M.A.，etc,TiPS,1997，18:387-392)。
[0004]UTP不但可以直接用于药物研究，也可作为中间体大量用于合成UDPG，并在糖生物学研究中扮演着的作用。多年来，研究者对于UTP的合成具有极大的热情。
[0005]UTP的合成主要采用生物法，其中常见的有利用酵母细胞进行UTP的合成或利用基因工程菌合成UTP。
[0006]酿酒酵母细胞具有高活力的糖酵解能力，其各种菌种在酿酒、酒精、食品等方面应用广泛。将糖酵解与腺苷三磷酸(ATP)再生相偶合，可以合成ATP或其它核苷酸类物质，如合成ATP、胞二磷胆碱等。其中，邱蔚然等应用固定化酵母合成得到了 ATP(邱蔚然，上海化工，1994，5)和CTP (邱蔚然，精细与专用化学品，2002，17)。对酵母进行固定，并经过一系列处理，虽然可以增加酵母的反应次数及方便固液分离，但是由于反应过程中随着反应次数的增加，一些小分子的辅酶等物质随着反应液流失，在反应后期反而需要添加这些昂贵的物质；而固液分离近年来发展较快，对于酵母细胞来说也可以很方便的解决；另外，由于使用卡拉胶作为固定化载体，固定化温度在50度左右，造成大量酵母失活，反应过程中需要添加50%以上的固定化颗粒，且固定化成本居高不下，已失去已有的意义。
[0007]利用基因工程菌合成生物类物质也是近年来发展的重点。Jozef N.利用过表达的聚磷酸激酶的大肠杆菌，可以很方便的合成UTP，活性要比使用产氨短杆菌效果好(JozefN.,Biotech.Lett.，2002，24:925-930)。但是文中除了比较了一下活性外，并没有涉及到具体的UTP合成。
[0008]在有关核苷三磷酸的合成中，利用酵母细胞作为催化剂仍具有非常好的便利性，因为酵母细胞可以从如啤酒厂、生物乙醇厂或面包酵母厂方便的获得，且数量不受限制。但是直接使用酵母细胞会出现一个严重的障碍，即核苷酸类物质不能直接进出细胞，虽然用固定化的方法可以解决，但是大量酵母进行固定化，工艺十分复杂且不实用；而添加有机溶剂的方法在实际生产中也有大量使用，但是添加的有机溶剂在合成后并不进行回收，这会增加环境污染，且对糖酵解酶系的活力也有很大的影响。
【发明内容】
[0009]本发明的构思是这样:
[0010]制备通透性改善的酵母，其以葡萄糖为能源进行糖酵解再生ATP的能力明显得以提高；将渗透性改善的酵母细胞，加入含有葡萄糖、磷酸盐、硫酸镁、尿苷酸(或腺苷)的反应液中，将尿苷酸(或腺苷)转化成相应的尿苷三磷酸(或腺苷三磷酸)；回收尿苷三磷酸(或腺苷三磷酸)。 [0011]本发明所要解决的技术问题之一是:提供一种高渗透酵母的制备方法。
[0012]本发明所要解决的技术问题之二是:提供一种利用高渗透酵母制备尿苷三磷酸的方法。
[0013]因此，本发明提供了:
[0014]1.一种高渗透酵母的制备方法，其特征在于，其特征在于，将湿酵母在低温下处理，条件是:湿酵母含水量20% -80%重量比(w/w)，处理温度约-200°C -约-15°C，和处理时间 24-480h。
[0015]2.根据I所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量30%-80%重量比(w/w)。
[0016]3.根据2所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量40 % -70 %重量比(w/w)。
[0017]4.根据3所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量50 % -60 %重量比(w/w)。
[0018]5.根据4所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量50%重量比(w/w)。
[0019]6.根据I所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理温度约-100°C -约
20。。。
[0020]7.根据6所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理温度约_40°C。
[0021]8.根据I所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间约48_480h。
[0022]9.根据8所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间约48_240h。
[0023]10.根据9所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间约72_96h。
[0024]11.根据10所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间约96h。
[0025]12.根据I所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，其特征在于，将湿酵母在低温下处理，条件是:湿酵母含水量50%重量比(w/w)，处理温度约_40°C，和处理时间96h。
[0026]13.一种尿苷三磷酸的制备方法,其特征在于,将根据1-12任一所述的方法制备的高渗透酵母和含有尿苷的溶液混和、反应，然后回收尿苷三磷酸，条件是:酵母的用量为3% -60% (湿酵母重量/反应液的重量)；含有尿苷的溶液为50mmol/L尿苷酸、150mmol/L的葡萄糖、lOmmol/L硫酸镁、250mmol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液；反应温度30°C ;反应时间1.0-1Oh0
[0027]14.根据13所述的尿苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量为10%-30%
(湿酵母重量/反应液的重量)。
[0028]15.根据根据14所述的尿苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量为15%(湿酵母重量/反应液的重量)。
[0029]16.根据13-15任一所述的尿苷三磷酸的制备方法，其特征在于，反应时间为2h。
[0030]17.根据13-15任一所述的尿苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母为根据12的方法制备的。
[0031]18.一种腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，将根据1-12任一所述的方法制备的高渗透酵母和含有腺苷的溶液混和、反应，然后回收腺苷三磷酸，条件是:酵母的用量为3% -60% (湿酵母重量/反应液的重量)；含有腺苷的溶液为30mmol/L腺苷、150mmol/L的葡萄糖、lOmmol/L硫酸镁、250mmol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液；反应温度30°C ;反应时间
1.0-1Oh0
[0032]19.根据18所述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量为10%-30%
(湿酵母重量/反应液的重量)。
[0033]20.根据根据19所述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量为15%
(湿酵母重量/反应液的重量)。
[0034]21.根据18-20任一所述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，反应时间为2h。
[0035]22.根据18-20任一所 述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母为根据12的方法制备的。
[0036]本发明中所使用的酵母细胞选自啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、酿酒酵母或其它来源的可以用于制备核苷三磷酸的生物细胞。
[0037]使用本发明的方法制备的高渗透化酵母，具有显著的技术进步，至少解决了以下一个技术问题:提高了酵母细胞通透性的问题，使得核苷酸类物可以自由地进出细胞，保留了原有细胞的活性，大大减少了酵母细胞的处理步骤，降低了操作的复杂性及生产成本，可用于尿苷三磷酸等核苷三磷酸的制备。
[0038]由于渗透化酵母并没有完全破坏细胞壁和细胞膜，细胞内大分子物质并不流失到反应液中，极大的减轻了后续处理的压力。且反应结束后可以方便地使用一些低速的离心设备，如三足式离心机、转鼓式离心机等快速地将酵母细胞与反应液分离，特别适合于大规模的生产应用。
[0039]本发明中核苷酸的转化率采用HPLC法测定。方法如下:
[0040]安捷伦液相色谱仪，柱YWG-C18(250_X4.6mm);流动相:5 %乙腈+50mmol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液；流速:1.0ml/min ;波长:254nm ;温度:室温。
[0041]以下结合【具体实施方式】详细说明本发明，但必须理解所有的这些实施方式都仅仅是说明性，不以任何方式限制本发明的范围。本发明的范围由权利要求的法律结构确定。
【具体实施方式】:
[0042]实施例1
[0043]称取含水量约为50%的酵母细胞各100g，置于表1中各温度下冷冻4天后，取出作为酶源合成ATP。反应液配比为:30mmol/L腺苷、150mmol/L的葡萄糖、10mmol/L硫酸镁、250mmol/LpH7.5的磷酸盐缓冲液，温酵母加入量为15%，于30°C振荡反应2小时，取ImL反应液，离心去除酵母细胞，反应液用去离子水稀释10000倍，用HPLC测定所生成的ATP。结果如表1。
【权利要求】
1.一种高渗透酵母的制备方法，其特征在于，其特征在于，将湿酵母在低温下处理，条件是:湿酵母含水量重量比20% -80%，处理温度-200°c —15°C，和处理时间24_480h。
2.根据权利要求1所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量30% -80%重量比。
3.根据权利要求2所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量重量比40% -70%。
4.根据权利要求3所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量重量比50% -60%。
5.根据权利要求4所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，湿酵母含水量重量比50%。
6.根据权利要求1所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理温度-1OO0C -200C O
7.根据权利要求6所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理温度_40°C。
8.根据权利要求1所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间48-480h。
9.根据权利要求8所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间48-240h。
10.根据权利要求9所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间72-96h。
11.根据权利要求10所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，处理时间96h。·
12.根据权利要求1所述的高渗透酵母的制备方法，其特征在于，其特征在于，将湿酵母在低温下处理，条件是:湿酵母含水量重量比50%，处理温度-40°C，和处理时间96h。
13.—种尿苷三磷酸的制备方法,其特征在于,将根据权利要求1-12任一所述的方法制备的高渗透酵母和含有尿苷的溶液混和、反应，然后回收尿苷三磷酸，条件是:酵母的用量湿酵母重量/反应液的重量为3% -60%;含有尿苷的溶液为50mmol/L尿苷酸、150mmol/L的葡萄糖、lOmmol/L硫酸镁、250mmol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液；反应温度30°C;反应时间1.0-1Oh0
14.根据权利要求13所述的尿苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量湿酵母重量/反应液的重量为10% -30%。
15.根据权利要求根据权利要求14所述的尿苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量湿酵母重量/反应液的重量为15%。
16.根据权利要求13-15任一所述的尿苷三磷酸的制备方法,其特征在于,反应时间为2h。
17.根据权利要求13-15任一所述的尿苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母为根据权利要求12的方法制备的。
18.—种腺苷三磷酸的制备方法,其特征在于,将根据权利要求1-12任一所述的方法制备的高渗透酵母和含有腺苷的溶液混和、反应，然后回收腺苷三磷酸，条件是:酵母的用量湿酵母重量/反应液的重量为3% -60% ;含有腺苷的溶液为30mmol/L腺苷、150mmol/L的葡萄糖、lOmmol/L硫酸镁、250mmol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液；反应温度30°C ;反应时间1.0-1Oh0
19.根据权利要求18所述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量湿酵母重量/反应液的重量为10% -30%。
20.根据权利要求根据权利要求19所述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母的用量为湿酵母重量/反应液的重量15%。
21.根据权利要求18-20任一所述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，反应时间为2h。
22.根据权利要求18-20任一所述的腺苷三磷酸的制备方法，其特征在于，酵母为根据权利要求12的方法 制备的。
【文档编号】C12P19/30GK103540537SQ201210247342
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月17日 优先权日:2012年7月17日
【发明者】欧伶, 张广宇, 邹志, 颜炳坤 申请人:上海汇远生物科技有限公司