专利名称：甘蓝型油菜中一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因BnBADH-1的制作方法
技术领域：
本发明尤其涉及的是一种甘蓝型油菜中一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因BnBADH-1。
背景技术：
甜菜碱是高等植物体内一种重要的渗透调节剂，可以保护生物大分子在高电解质浓度下不变性，维持细胞的膨压，不干扰细胞的结构和功能，并且在胁迫解除后的恢复期间具有加速蛋白质合成的作用，有利于提高植物对干旱胁迫或盐胁迫的耐受性。甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)是高等植物体内合成甜菜碱的重要的关键酶。甘蓝型油菜是我国最重要的油料作物之一，我国的油菜种植面积和总产量位于世界首位。干旱胁迫往往严重影响油菜的产量。所以研究橄榄形油菜BADH基因就具有重要的理论和实践意义。 与甘蓝型油菜亲缘关系较近的模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)体内BADH基因家族至少有2个基因成员。即BADHl (ALDH10A8)和BADH2 (ALDH10A9)。NCBI数据库上已知的油菜BADH (AY351634)基因，其序列与拟南芥BADH2(ALDH10A9)同源性达到90%以上，认为油菜BADH(AY351634)是拟南芥BADH2(ALDH10A9)的同源基因。但是拟南芥BADHl (ALDH10A8)在油菜体内的同源基因未见报道。
发明内容
从甘蓝型油菜种克隆到了一个新的BADH基因序列命名为BnBADH-1。甘蓝型油菜中一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因BnBADH-1，其核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。我们将从甘蓝型油菜种克隆到了一个新的BADH基因序列命名为BnBADH-I。BnBADH-I与拟南芥BADH I (ALDH10A8)相比对，核酸序列具有90. 24%的同源性，而氨基酸序列具有93. 41 %同源性。BnBADH-I与GeneBank现有的另一个油菜的BADH (AY351634)核酸序列同源性为75. 79%，氨基酸序列同源性为77. 93%。所以这是不同于AY351634的另一个新的基因。
图I为油菜BnBADH-I基因的扩增电泳图。以反转录得到的cDNA为模板做PCR扩增得到的BnBADH-I片段。M DNA marker DL 2000 ；1 :油菜BADH-I基因片段；图 2 为载体 pEASY-T-BnBADH-Ι 的 PCR 检测电泳图。M :DNA marker DL 2000 ; I，2 :挑取的2个阳性菌落的PCR产物。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。①无菌苗的获得将甘蓝型油菜种子经75%乙醇浸泡lmin，O. 1%升汞浸泡8min消毒处理后，用灭菌水反复洗3、次,然后置于MS固体培养基上；于人工气候箱内25° C,相对湿度70%，16h光照/8h黑暗的条件下生长。②油菜总RNA的提取及总cDNA的合成取萌发后约3周左右的油菜叶片，采用Trizol试剂盒提取总RNA ;所得的总RNA用RNase-free DNase I去掉残余DNA后,再用反转录试剂盒生成第一链cDNA :用Oligo (dT) 18引物进行反转录,经42 ° C孵育30 min后，85 ° C加热5 min使酶失活。所得的cDNA在-20° C保存，以备后续PCR使用。③基因全长的扩增PCR体系按cDNA I μ L, dNTP 2 μ L, buffer(含 Mg2+)2 μ L,上下游引物(B-1: 5’ -ATGGCGATTCCGATGCCTACTC-3’ ；B-2:5，-TTAGTTGGGAGATTTGTACCAT-3，)各 I μ L，酶 TansTaq-T O. 2 μ L, ddH20 12. 8 μ L (共20 μ L)混合，其程序为95° C预变性5 min,反应36个循环95° C 30 sec, 53° C 30 sec, 72° C lmin 30 sec,然后72° C终延伸8 min，4° C终止反应并保存。④上一步的PCR产物经由2%琼脂糖凝胶电泳后，回收大小正确的片段(图1)，直接连接在T载体pEASY-Tl Simple上，转化大肠杆菌感受态并涂布LB+Amp固体培养基平板。37° C隔夜培养后，挑取形状规则的白斑，于LB+Amp液体培养基中培养并做菌落PCR，体系和程序同上。将扩增出大小正确条带(图2)的菌液送交测序(SEQ ID N0:1)。序列结果DNAman软件进行分析。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种甘蓝型油菜中一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因BnBADH-1，其核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
全文摘要
本发明公开了甘蓝型油菜中一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因BnBADH-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。我们将从甘蓝型油菜种克隆到了一个新的BADH基因序列命名为BnBADH-1。BnBADH-1与拟南芥BADH 1(ALDH10A8) 相比对，核酸序列具有90.24%的同源性，而氨基酸序列具有93.41 %同源性。BnBADH-1与GeneBank现有的另一个油菜的BADH(AY351634)核酸序列同源性为75.79%，氨基酸序列同源性为77.93%。所以这是不同于AY351634的另一个新的基因。
文档编号C12N9/02GK102816776SQ201210319630
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者蒋梁材, 柴靓, 李浩杰, 蒲晓斌, 张锦芳, 蒋俊 申请人:四川省农业科学院作物研究所