专利名称：一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法。
背景技术：
酯酶(Esterase, EC3. I. I. I)是一类能够催化酯键水解形成相应的酸和乙醇的酶类，广泛分布于动植物和微生物(Bronscheuer，2002)。微生物能够产生多种具有酯解活力的酶类，包括酯酶(Esterase)和脂肪酶(Lipase)。酯酶能够水解或者合成酰基碳链长度小于10的甘油酯类，对于酰基碳链长度大于10的甘油酯类则没有催化活性。酯酶催化反应具较广的底物范围，在催化底物反应时不需要辅助因子，在一些变形剂，如有机溶剂中有很高的稳定性，此外酯酶催化反应具有立体特异性和区域专一性的 特点。由于酯酶以上优点，使得酯酶在很多领域有着广泛的应用。近年来，全球市场工业用酶市场不断扩大，而酯酶是其中一种被广泛使用的生物催化剂，在全球工业用酶市场占据很高的很高比例。随着日益高涨的能源成本、石油煤炭等不可再生资源的衰竭、环境污染以及经济全球化，大规模的可再生的，环保的生物处理工艺来代替或者互补传统不可再生，高能耗，高污染的工业生产工艺是刻不容缓。在食品加工方面，利用酯酶分解底物后产物为呈香化合物，将酯酶己应用于奶制品的增香、改善稻米和发酵类饮料的香味等方面，如用酯酶处理过的奶制品比未处理的具有更好的香味和可接受性；在农业生产方面，人工合成的有机磷化物广泛用于杀虫剂，这些物质的残留将危害环境并且最终危害人类健康，来自号Brevundimonas diminuta和Alteromonas sp.酯酶被证明能有效降解这类物质,广泛应用于清除有机磷杀虫剂的污染；在医药合成方面，酯酶主要用于拆分手性药物。来自于sp.的酯酶被应用于抗炎药物布洛芬的生产，来U子Bacillus cogulans的酯酶广泛应用于生物活性物质DL-甘油醇缩丙酮的生产；在轻化工业方面，酯酶广泛应用于制浆造纸、纺织品、皮革处理等。来自于Ophiostorm piceae的酯酶能够有效的水解甘油三酯和幽醇酯，酯酶能够显著降低制浆造纸过程中的树脂，因而能够显著提高机器的运行效率并改善纸张的品质，因而广泛应用于制浆造纸工业；化工日用品方面，碱性酯酶具有明显的助洗作用，加入后使得洗涤剂朝低磷或无磷的方向反应，有利于降低水体中无机磷含量，从而减少环境水体富营养化。酯酶除了在上述的食品加工、农业生产、医药合成以及轻化工业等行业广泛使用外，酯酶还被认为在环保型燃料、生物柴油等生物能源的开发具有广泛的前景。微生物酯酶是一类重要的工业酶类，国内外上从20世纪90年代到现在，相继开发出各种酯酶，但是依旧无法满足现代工业需求。我国真菌产酯酶的相关研究起步较晚，在期刊杂志上鲜有报道，覃拥灵等人利用诱变裂褶菌ZM37. 8，获得稳定的正突变高产菌株E1，其产酯酶量为87. 56U/mL(覃拥灵等，2007)。真菌发酵有别于细菌发酵，真菌在发酵过程中可以随时取样接种于LB培养基，检测是否染杂菌；也可通过添加抗生素减少染菌，且真菌发酵条件温和，易于控制等鲜明特点。因此真菌发酵法生产的独特优势，有利于真菌酯酶更广泛地工业化应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法。本发明首先提供了一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，所述培养基的原料含有酵母粉 l-3w%, D-山梨醇 1-4 w %, Ba2+ O. 01-0. 04 mol/L, VB4O. 005-0. 02 w %，三醋酸甘油酯2w%,培养基初始pH=6. 6-7. 5。
更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，含有酵母粉2%，D-山梨醇3%，BaCl2 · 2H20 O. 24%，VB4O. 01%，三醋酸甘油酯 2%，培养基初始 pH=6. 9。其次，本发明还提供了一种绿僵菌发酵产酯酶的方法，所述方法包含以下步骤
(a)将绿僵菌接种种子培养基，制得发酵种子液；
(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求I或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为125mL，接种量10%，于27°C，转速160 r/min下培养。所述种子培养基的原料含有按培养基重量计，牛肉膏2.0%，蔗糖2.0%，蛋白胨O. 2%，酵母粉 O. 2%, (NH4)2SO4 O. 5%, K2HPO4 O. 1%，MgSO4 7H20 O. 05%, ρΗ5· 5。
本发明采用的绿僵菌为绿僵菌M a Y D T R 03 (以下简称绿僵菌Ma_3)(何学友等，应用绿僵菌和白僵菌林间防治木麻黄毒蛾的初步研究，福建林业科技，2011年6月)。采用本发明优化后的培养基，菌龄4d，发酵周期54h，发酵产生结果绿僵菌Ma-3产酯酶为45U/mL以上。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，具有酯酶产率高，酯酶活力高等优点。
图I为对硝基苯酚标准曲线。
具体实施例方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。实施例I
单因素实验确定培养基最优成分
(I)种子培养基配制牛肉膏20. 0g，蔗糖20. 0g，蛋白胨2. 0g, (NH4)2SO4 5. 0g，酵母粉
2.Og7K2HPO4 I. Og ,MgSO4 ·7Η20 O. 5g，蒸馏水定容到 IOOOmL, il pH 至 5. 5，分装于 250mL 的三角瓶，每个三角瓶含150mL。O. IMPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。(2)发酵种子的制作将绿僵菌Ma-3接种于马铃薯琼脂培养基上，于27°C下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，27°C，转速160 r/min下培养24h，即为发酵液。(3)酶液的制备取步骤(2)下的发酵液在4°C下，5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长405nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mL0(4)酯酶酶活测定根据Westlake K等人的酯酶酶活测定方法，进行改进，取I mLlmmol/L的对硝基苯酯酸酯(p_NPC2)溶液、2 mL 50mM Tris-HCl (pH 7.2)缓冲液加人试管中,放人恒温水浴器中，40°C保温15 min，再加I mL酶液振荡反应4. 5 min，立即加入2 mL95%乙醇终止反应，在波长405nm处测定吸光值。另以在沸水浴中失活的酶液代替原酶液为空白。酶活力单位的定义为在本实验测定条件下，以每分钟催化产生I μ mol的对硝基苯酚所需的酶量为I个酶活力单位(U)。酶活力(U/g或U/mL)=AXKXVXn/(tXm) (A为样品的吸光度；K为吸光常数；V为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL)。(5)标准曲线的制作精确配制对硝基苯酚2mmol/L标准溶液；首先在试管中加入不同体积50mmol/L Tris-Hcl pH7. 2，在40°C保温15 min，在加入不同体积的对硝基苯酚标准液。反应4. 5min后立即加入2mL95%乙醇。反应体系为6mL (对硝基苯酚和缓冲液4mL，终止液为2mL)。每个浓度做3平行实验，为空白对照。在波长405 nm处测定吸光值。 以吸光值为纵坐标，标准溶液溶度为横坐标，经统计处理得到的线性回归方程，y=0. 0025x,R2=O. 9976，结果见图I。(6)不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产酯酶的影响
(a)碳源对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v)(经细菌过滤器除菌后加入，下同)、蛋白胨 1%、KH2PO4 O. 1%,MgSO4 7H20 O. 05%,NaCl O. l%、FeS04 7H20 O. 001%、ρΗ7· O 的培养基中分别添加2%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、L(+)_阿拉伯糖、海藻糖、D-山梨醇、可溶性淀粉，O. IMPa，灭菌20min (下同)，接入相同的绿僵菌菌液，在27°C、160r/min的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表I。(b)金属离子对产酶的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v)、蔗糖2%、蛋白胨1%、PH7.0的培养基分别添加0.02mol/L (以6 (a)中含有的金属离子按其浓度换算得来)FeCl3 · 6H20、NaCUMgCl2 · 6H20、CaCl2、MnCl2 · 4H20、KCl、BaCl2 · 2H20、ZnCl2'CuCl2 · 2H20、FeCl2 · 4H20，灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在27°C、160r/min的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表2。(C)氮源对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v)、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4- 7H20 O. 05%,NaCl O. 1%,FeSO4 7H20 O. 001%、pH7. O 的培养基中分别添加 1% 的酵母粉、蛋白胨、甘氨酸、(NH4) 2HP04、(NH4)2S04、NaN03、NH4N03、KN03、胰蛋白胨、叶酸、酸水解蛋白胨，灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在27°C、160r/min的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表3。(d)维生素对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v)、蛋白胨1%，蔗糖2%、KH2PO4 O. 1%,MgSO4 7H20 O. 05%、NaCl O. 1%,FeSO4 7H20 O. 001%、ρΗ7· O 的培养基中分别添加O. 01%硫胺素VB1、核黄素VB2、氨基嘌呤VB4、吡哆醇类VB6、烟酸、叶酸、抗坏血酸V。、生育酚脂VE ^〃乂卩灭菌’接入相同的绿僵菌菌液’在〗？！、“。!·/!^!!的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表4。
表I不同碳源对酶产量的影响
权利要求
1.一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有酵母粉l-3w%, D-山梨醇 1-4 w %, Ba2+ O. 01-0. 04 mol/L，VB4O. 005-0. 02 w %，三醋酸甘油酯 2w%，培养基初始pH=6. 6-7. 5。
2.—种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料按重量分数计，含有酵母粉2%，D-山梨醇3%，BaCl2 · 2H20 O. 24%，VB4O. 01%，三醋酸甘油酯2%，培养基初始ρΗ=6· 9。
3.—种绿僵菌发酵产酯酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤 (a)将绿僵菌接种种子培养基，制得发酵种子液； (b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求I或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为125mL，接种量10%，于27°C，转速160 r/min下培养。
4.如权利3所述绿僵菌发酵产酯酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料含有按培养基重量计，牛肉膏2. 0%，蔗糖2. 0%，蛋白胨O. 2%，酵母粉O. 2%，(NH4) 2S04 O. 5%，K2HPO4O. 1%，MgSO4- 7H20 O. 05%, ρΗ5· 5。
全文摘要
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有酵母粉1-3w%，D-山梨醇1-4w%，Ba2+0.01-0.04mol/L，VB40.005-0.02w%，三醋酸甘油酯2w%，培养基初始pH=6.6-7.5。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为125mL，接种量10%，于27℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，具有酯酶产率高，酯酶活力高等优点。
文档编号C12R1/645GK102839161SQ20121031922
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者邱君志, 苏礼超, 涂洁, 宋飞飞, 关雄, 邱云锋, 李小霞, 郭庆丰, 何肖云, 吴国辉 申请人:福建农林大学