专利名称：控制生产低分子量肝素的方法
技术领域：
本发明涉及一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，该方法利用选自肝素酶1、II和III中两种以上的肝素酶来降解肝素从而生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法。
背景技术：
肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以I — 4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖的重复单位的线性链状结构，其分子量在3000-37000Da之间，在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂使用。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，从而大大限制了肝素在临床上的应用。低分子量肝素(低分子量肝素寡糖)(简称LMWH)的分子量通常是指在3000-8000Da 之间，且分子量可以在 4000Da、5000Da、6000Da、7000Da 或其在 3000_8000Da 内的任何组合之间；超低分子量肝素是指(平均)分子量在3000Da以下的肝素。与普通肝素相比，通过体内、体外实验发现，在同等剂量下，(超)低分子量肝素的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。此外，(超)低分子量肝素还具有一些其它优势，如分子量小，生物利用度高，血浆半衰期长；不与肝素结合蛋白结合，因此有更稳定的量效关系，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；较少与血小板结合，不易引起血小板减少。所以(超)低分子量肝素既能有效防止血栓形成，又能 减少出血等不良反应，是一种安全有效的抗血栓药物，可作为肝素的替代物。
发明内容
(超)低分子量肝素制备主要是传统的化学裂解法工艺。肝素酶法制备(超)低分子量肝素除了具备酶工程普遍化的生产条件温和，环境友好，能耗低，效率高等优点外，还有其特殊的优势。肝素酶制备(超)低分子量肝素工艺与传统的化学裂解法的比较如表I所示，除了酶使用成本过于昂贵外，酶法制备明显占据了优势。因此，如何开发高效清洁低成本的酶法制备低分子量肝素工艺关键在于如何降低酶的成本。表I低分子量肝素制备工艺中肝素酶法与传统化学裂解法的比较
权利要求
1.一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，该方法包括向底物肝素中添加两种或两种以上肝素酶，使两种或两种以上肝素酶与底物肝素反应来生产低分子量肝素或超低分子量肝素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述两种或两种以上肝素酶选自肝素酶1、肝素酶II和肝素酶III。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述两种肝素酶为肝素酶I和肝素酶III。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述两种肝素酶为肝素酶II和肝素酶III。
5.根据权利要求2 4中任一项所述的方法，其中所述肝素酶1、肝素酶II或肝素酶III是以融合蛋白形式存在的肝素酶1、肝素酶II或肝素酶III。
6.根据权利要求广5中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素: 重均分子量在8000Da以下，优选在7000Da以下，进一步优选在6000Da以下； 重均分子量小于SOOODa的分子在所有低分子量肝素产物中所占的质量分数不小于60%，优选不小于65%，进一步优选不小于70% ； 低分子量肝素的抗Xa因子大于70IU/mg，优选大于等于80IU/mg，进一步优选大于100IU/mg;以及 抗Xa/抗IIa大于1.5,优选大于1.56,进一步优选大于1.60。
7.根据权利要求广5中任一项所述的方法，其中， 所述超低分子量肝素的重均分子量在3000Da以下，优选在2500Da以下。
8.一种用于生产低分子量或超低分子量的肝素酶的混合物，其包括选自肝素酶1、肝素酶II和肝素酶III中的至少两种。
9.一种控制生产低分子量或超低分子量硫酸乙酰肝素的方法，该方法包括向底物硫酸乙酰肝素中添加两种或两种以上肝素酶，使两种或两种以上肝素酶与底物硫酸乙酰肝素反应来生产低分子量硫酸乙酰肝素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述两种或两种以上肝素酶选自肝素酶1、肝素酶II和肝素酶III。
全文摘要
本文公开一种低分子量肝素或超低分子量肝素的生产方法。该方法利用选自肝素酶I、II和III中两种以上的肝素酶来降解肝素从而生产低分子量肝素或超低分子量肝素。
文档编号C12N9/88GK103173506SQ201210328649
公开日2013年6月26日 申请日期2012年9月6日 优先权日2011年10月9日
发明者邢新会, 李晔, 吴敬君, 张翀, 冯权, 毕鲜荣 申请人:清华大学