专利名称：微生物发酵补料生产恩拉霉素的方法
技术领域：
本发明为微生物发酵补料生产恩拉霉素的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术：
恩拉霉素(Enramycin)，又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由土壤中分离出来的放线菌fungicidious NO. B5477发酵产生的一种多肽类抗生素。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。1993年，我国农业部批准该药在我国注册。2005年，国内生产企业与美国先灵德雅动物保健品有限公司(Schering Plough Animal Health Corp.
)开始合作生产恩拉霉素预混剂。由于恩拉霉素具有优良的促生长和改善饲料利用率的作·用，因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂。目前恩拉霉素发酵主要采用分批发酵方式，由于发酵周期过长且不补料，发酵水平达不到理想效果，因此通过发酵补料工艺的开发来提高恩拉霉素发酵水平是必经之路。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵过程中补料生产恩拉霉素的方法，该方法简单可行，通过在发酵过程中补料来提高恩拉霉素的生产水平，效果显著。本发明采用发酵菌株在发酵培养基中恒温培养过程中向发酵液中补料的方式增强发酵过程中的养份供给，以提高恩拉霉素的发酵水平。具体技术方案如下
微生物发酵补料生产恩拉霉素的方法，以杀真菌素链霉菌为菌种发酵生产恩拉霉素，其特征是在发酵过程中向发酵液中补加营养成分，以提高恩拉霉素发酵水平，所述营养成分为玉米浆、玉米蛋白粉和玉米淀粉。本发明方法中，玉米浆的补加量(吨)为原始发酵液体积(m3)的O. 3-0. 5%，玉米蛋白粉的补加量(吨)为原始发酵液体积(m3)的O. 5-1. 0%，玉米淀粉的补加量(吨)为原始发酵液体积(m3)的 3. 0-5. 0%。本发明方法中，自发酵60_90h时开始补加营养成分，至210_230h时停止。本发明方法中，营养成分优选以流加的方式加入发酵液中。在本公司工业化大生产中，所用发酵液体积一般在SO-Slm3之间，补加玉米浆、玉米蛋白粉和玉米淀粉的量分别为240-405kg、400-810kg、2400-4050kg，将补加的营养成分加水配制并蒸汽灭菌至19-20m3的体积，流加补入发酵罐。本发明方法中，所用杀真菌素链霉菌为杀真菌素链霉菌isti'eptomycesfugicidicus) SDSL1205 CGMCCNo. 3933，即专利 201010226506. 6 (一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法)中公开的菌种。本发明方法中，发酵生产恩拉霉素的温度为28-30°C，搅拌转速为50-120r/min、通气量为O. 5-1. 2vvm、培养时间为280-300hr。本发明方法中，发酵所用的发酵培养基组成为酵母浸膏O. 5-0. 8wt%、葡萄糖3. 8-4. 4 wt%、玉米淀粉 3. 0-3. 5 wt%、玉米衆 2. 0-2. 5 wt%、玉米蛋白粉 I. 0-1. 5 wt%、菜杆油 O. 5-1. O wt%、花生饼粉 O. 5-1. O wt%、氯化钠 I. 5-2. O wt%、氯化铵 O. 3-0. 8 wt%、轻质碳酸钙 I. 0-1. 5 wt%、泡敌 O. 02-0. 05 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 5。本发明方法中，杀真菌素链霉菌进行斜面培养和种子培养，以达到发酵所需的菌种量；斜面培养所用的斜面培养基组成为可溶性淀粉I. 0-1. 2 wt%、硫酸铵2. O -2. 5 wt%、磷酸氢二钾 O. 08-0. 12 wt%、氯化钠 O. 9-1. 4 wt%、轻质碳酸钙 2. 5-3. O wt%、琼脂 2. 0-2. 5wt%，水余量，pH6. 5-7. O，斜面培养条件为28-30°C培养6_7天。种子培养所用的种子培养基组成为玉米淀粉2. 0-3. O wt%、葡萄糖I. 5-2. O wt%、玉米浆2. 0-2. 5 wt%、花生饼粉I. 0-1. 5 wt%、玉米蛋白粉O. 3-0. 6 wt%、酵母浸膏O. 3-0. 8wt%、氯化铵O. 4-0. 8 wt%、磷酸氢二钾O. 03-0. 08 wt%、轻质碳酸钙O. 3-0. 5 wt%、泡敌
O.02-0. 04 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 3，种子培养条件为28_30°C培养2-3天。·本发明采用在发酵过程中补料的方式提高恩拉霉素的发酵水平，该方法简单易行，恩拉霉素的发酵水平能够得到显著提高，最高可达10%以上。
具体实施例方式以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明所用的杀真菌素链霉菌为杀真菌素链霉菌fugicidicus)SDSL1205 CGMCCNo. 3933，已于2010年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，在专利201010226506. 6中已经公开。实施例I
将杀真菌素链霉菌LStreptomyces /i/^/cii/iciAsOSDSLlZOS接种于斜面培养基,28°C培养7天后，利用19-20ml无菌水将斜面孢子洗下，接种于装有800-810L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为2m3)，28°C培养3天后，转入装有80_81m3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为130m3)，28 °C培养。发酵培养至60小时时开始补料，补料所用物料为玉米浆、玉米蛋白粉、玉米淀粉，各物料分别按照240-245kg、400-405kg、2400-2405kg加入，将补加的物料加水配制并蒸汽灭菌成体积为19-20m3,流加的方式补入,补料至210hr (小时,下同),结束补料后继续培养至发酵280h后停止发酵。发酵结束，采用HPLC进行定量分析，放罐效价为8710 μ g/ml。所用斜面培养基组分及组分浓度为可溶性淀粉I. O wt%、硫酸铵2. 5 wt%、磷酸氢二钾O. 08wt%、氯化钠I. 4 wt%、轻质碳酸钙2. 5 wt%、琼脂2. 5 wt%，水余量，ρΗ6· 5-7. 0，斜面培养条件为28°C培养7天。所用种子培养基组分及组分浓度为玉米淀粉2. 0wt%、葡萄糖2. O wt%、玉米衆
2.0wt%、花生饼粉I. 5 wt%、玉米蛋白粉O. 3 wt%、酵母浸膏O. 8 wt%、氯化铵O. 4 wt%、磷酸氢二钾O. 08 wt%、轻质碳酸钙O. 3wt%、泡敌O. 04 wt%,水余量，pH6. 8-7. 3，种子培养条件为28°C培养3天。所用发酵培养基组分及组分浓度为酵母浸膏O. 5wt%、葡萄糖4. 4 wt%、玉米淀粉
3.O ^%、玉米衆2.5 wt%、玉米蛋白粉I. 0wt%、菜籽油I. O ^%、花生饼粉0.5 wt%、氯化钠
2.O wt%、氯化铵 O. 3 wt%、轻质碳酸钙 I. 5 wt%、泡敌 O. 02 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 5。
实施例2
将杀真菌素链霉菌(5 -印fugicidicus^ SDSL1205接种于斜面培养基，30°C培养6天后，利用19-20ml无菌水将斜面孢子洗下，接种于装有800-810L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为2m3)，30°C培养2天后，转入装有80-8Im3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为130m3)，30°C培养。发酵培养至70小时开始补料，补料所用物料为玉米浆、玉米蛋白粉、玉米淀粉，各物料分别按照395-405kg、635-645kg、3195-3205kg加入,配制并蒸汽灭菌体积为19_20m3,流加的方式补入，补料至220hr，结束补料后继续培养至280-300hr。发酵结束，采用HPLC进行定量分析，放罐效价为8950 μ g/ml。所用斜面培养基组分及组分浓度为可溶性淀粉I. 2 wt%、硫酸铵2. O wt%、磷酸氢二钾 O. 12 wt%、氯化钠 O. 9 wt%、轻质碳酸钙 3. O wt%、琼脂 2. 0wt%jjC余量，ρΗ6· 5-7·. 0，斜面培养条件为30°C培养6天。所用种子培养基组分及组分浓度为玉米淀粉3. O 丨％、葡萄糖1.5 wt%、玉米衆2.5 wt%、花生饼粉I. O wt%、玉米蛋白粉O. 6 wt%、酵母浸膏O. 3 wt%、氯化铵O. 8 wt%、磷酸氢二钾O. 03wt%、轻质碳酸钙O. 5 wt%、泡敌O. 02wt%，水余量，pH6. 8-7. 3，种子培养条件为:30°C培养2天。所用发酵培养基组分及组分浓度为酵母浸膏O. 8wt%、葡萄糖3. 8 wt%、玉米淀粉
3.5 wt%、玉米衆2. 0wt%、玉米蛋白粉I. 5 wt%、菜籽油O. 5 wt%、花生饼粉I. O wt%、氯化钠
1.5wt%、氯化铵 O. 8 wt%、轻质碳酸钙 I. 0wt%、泡敌 O. 05 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 5。实施例3
将杀真菌素链霉菌LStreptomyces /i/^/cii/iciAsOSDSLlZOS接种于斜面培养基,29°C培养7天后，利用19-20ml无菌水将斜面孢子洗下，接种于装有800-810L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为2m3)，29°C培养3天后，转入装有80_81m3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为130m3)，29 °C培养。发酵培养至90小时，开始补料，补料所用物料为玉米浆、玉米蛋白粉、玉米淀粉，各物料分别按照395-405kg、795-805kg、3995-4005kg加入，配制并蒸汽灭菌体积为19-20m3，流加的方式补入，补料至210-230hr，结束补料后继续培养至280_300hr。发酵结束，采用HPLC进行定量分析，放罐效价为9469 μ g/ml。所用斜面培养基组分及组分浓度为可溶性淀粉I. lwt%、硫酸铵2. 2wt%、磷酸氢二钾O. 10wt%、氯化钠I. 2 wt%、轻质碳酸钙2. 8 wt%、琼脂2. 2 wt%，水余量，ρΗ6· 5-7. 0，斜面培养条件为29°C培养7天。所用种子培养基组分及组分浓度为玉米淀粉2. 5 丨％、葡萄糖1.7 wt%、玉米衆
2.2 wt%、花生饼粉I. 2 wt%、玉米蛋白粉O. 4 wt%、酵母浸膏O. 5 wt%、氯化铵O. 6wt%、磷酸氢二钾O. 05 wt%、轻质碳酸钙O. 4 wt%、泡敌O. 03 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 3，种子培养条件为29°C培养3天。所用发酵培养基组分及组分浓度为酵母浸膏O. 6wt%、葡萄糖4. O wt%、玉米淀粉
3.3 wt%、玉米衆2. 3 wt%、玉米蛋白粉I. 2 wt%、菜籽油O. 7 wt%、花生饼粉O. 8wt%、氯化钠
I.8wt%、氯化铵 O. 5wt%、轻质碳酸钙 I. 2wt%、泡敌 O. 03 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 5。实施例4将杀真菌素链霉菌LStreptomyces /i/^/cii/iciAsOSDSLlZOS接种于斜面培养基,29°C培养7天后，利用19-20ml无菌水将斜面孢子洗下，接种于装有800-810L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为2m3)，29°C培养3天后，转入装有80_81m3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为130m3)，29°C培养。发酵培养至80小时，开始补料，补料所用物料为玉米浆、玉米蛋白粉、玉米淀粉，各物料分别按照395-405kg、795-810kg、3995-4050kg加入，配制并蒸汽灭菌体积为19-20m3，流加的方式补入，补料至230hr，结束补料后继续培养至290hr。发酵结束，采用HPLC进行定量分析，放罐效价为9647 μ g/ml。所用斜面培养基组分及组分浓度为可溶性淀粉I. lwt%、硫酸铵2. 2wt%、磷酸氢二钾O. 10wt%、氯化钠I. 2 wt%、轻质碳酸钙2. 8 wt%、琼脂2. 2 wt%，水余量，ρΗ6· 5-7. 0，斜面培养条件为29°C培养7天。
·
所用种子培养基组分及组分浓度为玉米淀粉2. 5 丨％、葡萄糖1.7 wt%、玉米衆
2.2 wt%、花生饼粉I. 2 wt%、玉米蛋白粉O. 4 wt%、酵母浸膏O. 5 wt%、氯化铵O. 6wt%、磷酸氢二钾O. 05 wt%、轻质碳酸钙O. 4 wt%、泡敌O. 03 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 3，种子培养条件为29°C培养3天。所用发酵培养基组分及组分浓度为酵母浸膏O. 6wt%、葡萄糖4. O wt%、玉米淀粉
3.3 wt%、玉米衆2. 3 wt%、玉米蛋白粉I. 2 wt%、菜籽油O. 7 wt%、花生饼粉O. 8wt%、氯化钠
I.8wt%、氯化铵 O. 5wt%、轻质碳酸钙 I. 2wt%、泡敌 O. 03 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 5。对比例
采用实施例4的方法通过斜面培养、种子培养和发酵培养生产恩拉霉素，不同的是在发酵过程中不进行补料操作，仅将菌种在发酵培养基中进行培养生产恩拉霉素。发酵培养至290小时，结束后采用HPLC进行定量分析，放罐效价为8430 μ g/ml。从对比例和实施例4的对比可以看出，本发明在发酵过程中进行补料可以大大提高恩拉霉素的产量，提高比例达到14%。以上实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
权利要求
1.微生物发酵补料生产恩拉霉素的方法，以杀真菌素链霉菌为菌种发酵生产恩拉霉素，其特征是在发酵过程中向发酵液中补加营养成分，以提高恩拉霉素发酵水平，所述营养成分为玉米浆、玉米蛋白粉和玉米淀粉。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是玉米浆的补加量(吨)为原始发酵液体积Cm3)的O. 3-0. 5%，玉米蛋白粉的补加量(吨)为原始发酵液体积(m3)的O. 5-1. 0%，玉米淀粉的补加量(吨)为原始发酵液体积(m3)的3. 0-5. 0%。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征是营养成分以流加的方式加入发酵液中。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征是发酵液体积为80-81m3，补加玉米浆、玉米蛋白粉和玉米淀粉的量分别为240-405kg、400-810kg、2400-4050kg，将补加的营养成分加水配制至19-20m3的体积，并蒸汽灭菌，流加补入发酵罐。
5.根据权利要求I、2或3所述的方法，其特征是自发酵60-90h时开始补加营养成分，至210-230h时停止。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征是所用杀真菌素链霉菌为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fugicidicus) SDSL1205 CGMCCNo. 3933。
7.根据权利要求I或6所述的方法，其特征是发酵生产恩拉霉素的温度为28-30°C，搅拌转速为50-120r/min、通气量为O. 5-1. 2vvm、培养时间为280_300hr。
8.根据权利要求I或6所述的方法，其特征是发酵所用的发酵培养基组成为酵母浸膏 O. 5-0. 8wt%、葡萄糖 3. 8-4. 4 wt%、玉米淀粉 3. 0-3. 5 wt%、玉米衆 2. 0-2. 5 wt%、玉米蛋白粉 I. 0-1. 5 wt%、菜籽油 O. 5-1. O wt%、花生饼粉 O. 5-1. O wt%、氯化钠 I. 5-2. O wt%、氯化铵 O. 3-0. 8 wt%、轻质碳酸钙 I. 0-1. 5 wt%、泡敌 O. 02-0. 05 wt%，水余量，ρΗ6· 8-7. 5。
9.根据权利要求I或6所述的方法，其特征是杀真菌素链霉菌进行斜面培养和种子培养，以达到发酵所需的菌种量；斜面培养所用的斜面培养基组成为可溶性淀粉I. 0-1. 2wt%、硫酸铵2.0 -2.5 wt%、磷酸氢二钾O. 08-0. 12 wt%、氯化钠O. 9-1. 4 wt%、轻质碳酸钙2.5-3. O wt%、琼脂 2. 0-2. 5 wt%，水余量，ρΗ6· 5-7. 0，斜面培养条件为28_30°C培养 6-7天; 种子培养所用的种子培养基组成为玉米淀粉2. 0-3. O被％、葡萄糖1.5-2.0 wt%、玉米浆 2. 0-2. 5 wt%、花生饼粉 I. 0-1. 5 wt%、玉米蛋白粉 O. 3-0. 6 wt%、酵母浸膏 O. 3-0. 8 wt%、氯化铵O. 4-0. 8 wt%、磷酸氢二钾O. 03-0. 08 wt%、轻质碳酸钙O. 3-0.5 wt%、泡敌O. 02-0. 04wt%，水余量，pH6. 8-7. 3，种子培养条件为28-30°C培养2_3天。
全文摘要
本发明公开了一种微生物发酵补料生产恩拉霉素的方法，以杀真菌素链霉菌为菌种发酵生产恩拉霉素，其特征是在发酵过程中向发酵液中补加营养成分，以提高恩拉霉素发酵水平，所述营养成分为玉米浆、玉米蛋白粉和玉米淀粉。本发明采用在发酵过程中补料的方式提高恩拉霉素的发酵水平，该方法简单易行，恩拉霉素的发酵水平能够得到显著提高，最高可达10%以上。
文档编号C12P21/02GK102787153SQ20121032884
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者张翠芬, 景巍, 朱传峰, 李玉清, 王向前, 马生龙 申请人:山东胜利生物工程有限公司