一种嗜热栖热菌utm802及其应用的制作方法

专利名称：一种嗜热栖热菌utm802及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物领域，具体地，涉及嗜热栖热菌UTM802及其应用。
背景技术：
嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)是ー类在40°C以下不能生长,最适生长温度为65-70 V，最高生长温度80°C，好氧、革兰氏阴性、非芽孢杆菌，具有特殊的细胞壁结构。栖热菌是高温菌的典型代表，是高温生物学基础研究和应用研究的重点菌群，与水热环境关系密切，广泛存在于各地地热温泉，海底火山ロ及人工水热环境(如热水管道和高温好氧堆肥)。
传统堆肥一般是利用堆肥物料中的土著微生物，往往存在发酵时间长，臭气污染严重且腐熟度低等问题，通过在堆肥初期接种微生物制剂的办法可以提高堆肥效率和成品质量。接种微生物促进堆肥腐熟的机理有1)提高堆肥初期微生物的群体，增强微生物的降解活性；2)缩短达到高温期的时间；3)接种分解有机物质能力强的微生物。ー些从堆肥中分离出来的高温菌、中温菌、放线菌和真菌常作为堆肥接种剂加速细胞壁和木质素、纤维素水解，促进腐殖化过程。目前，高温堆肥采用的微生物接种剂主要是中温好氧菌。沈根祥等(1999)在蘑菇培养料上筛选出能促进冷性牛粪高温发酵的微生物菌群(Hsp菌剂)；顾希贤(1995)从22个垃圾堆肥、畜粪、土壤等样品中分离获得198株纤维分解菌，从中筛选出2株繁殖速度快、粗纤维分解能力強的制成菌剂，并以O. 05%-0. 1%的比例接种到垃圾堆肥的二次发酵中；李季等(2000)筛选出近10个具有不同功能作用、繁殖速度快的细菌、真菌、酵母均等，按照不同比例组合，筛选出能广泛用于畜禽粪便、市政污泥等有机废物堆肥的VT菌剂；席北斗(2003)利用从环境中分离的微生物，通过诱变培育出活性较高的纤维素分解菌株，并将康氏木霉、白腐菌、变色栓菌与EM菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌按一定比例组合成高效复合微生物菌剂。申请号为201010514582. 7的中国专利介绍了ー种将铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小芽孢杆菌和珊瑚色诺卡氏菌以及将绿色木霉、脱氮副球菌、黄曲霉、黄孢原毛平革菌和圆褐固氮菌制备成两种堆肥接种剂，用于堆肥发酵的不同阶段。专利号为CN 101486969A、CN101186879A、CN101696391A 等中国专利也公布了将多种芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、乳酸菌、光合菌、固氮菌、霉菌等组合制备的堆肥复合菌剂。这些微生物接种剂中的活性成分在50°C -80°C的堆肥高温期环境中常常受到抑制甚至失活，大大降低了接种剂的功效。嗜热栖热菌较常温菌相比，具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率，在固体有机废物处理领域具有广阔的应用前景和科学价值。栖热菌还具有热稳定性的降解酶，可以将堆肥温度維持在70°C -80°C或更高的温度，可以更加有效的杀死病原微生物，达到无害化的要求，同时栖热菌酶不仅耐热，而且对不良化学环境也具有高度的耐受性，能抵抗ー些有毒害作用的污染物或代谢产物的抑制作用，提高处理效率，缩短生产周期。栖热菌的应用，可为有机固体废物更好实现减量化、无害化、稳定化和资源化利用的エ业化生产创造有利条件。
将嗜热栖热菌作为接种剂应用于堆肥，可提高有机物质的降解速率，缩短エ艺运行时间，在有机废物资源化利用领域中具有潜在的应用价值。但目前还未见到关于嗜热栖热菌作为接种剂应用于高温堆肥的报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种嗜热栖热菌及其在高温堆肥中的应用。本发明从高温期污泥堆肥中，经高温富集、分离纯化得到嗜热栖热菌Thermusthermophilus UTM802菌株。UTM802于2012年6月4日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号=CGMCC No. 6186。所述嗜热栖热菌Thermus thermophilus UTM802的鉴定特征是(I)为革兰氏阴性、无鞭毛、菌体呈短杆状、无芽孢、专性好氧、菌落光滑、边缘平整；最适生长温度65-70°C，最高80°C，最低40°C ;最适pH值7. 5-7. 8，最高9. 5，最低6. O。(2)利用引物(27f):5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和(1492r):5' -GGTTAC CTT GTT ACG ACT T-3/经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，基因序列如SEQ ID NOI所示，获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对,结果显示与Thermus thermophilus HB8(T)的相似性最高，为98. 9%。(3)65_70°C下，在复合培养基(O. 8%蛋白胨，O. 4%酵母膏，O. 2%NaCl,0. 05%微量元素，用NaOH调pH到7. 2，固体培养基加I. 5%琼脂。微量元素营养液组成为(25g MgCl2 ·6Η20，5g CaCl2, 2g MgSO4 · 6Η20，0· 5g ZnSO4 · 7Η20，0· 5g H3BO3, 5g FeCl3 · 6H20,15mg CuSO4, 25mgNaMoO4 *2H20,20mg NiNO3 *6H20, 50mgCoN03 *6H20,80mg 盐酸吡哆醇，IOmg 叶酸，0. 5mL 硫酸，IOOmg盐酸硫胺素,40mg核黄素，80mg烟酰胺，80mg对氨基苯甲酸甲酷，IOmg生物素,O. 4mg氰钴胺，80mg泛酸，20mg硫辛酸，200mg肌醇，50mg氯化胆碱，50mg乳清酸，IOOmg亚精胺，IOOOmL蒸馏水)上生长良好。本发明还提供ー种含有所述嗜热栖热菌UTM802的高温菌剂。所述高温菌剂含有嗜热栖热菌UTM802的有效活菌个数I X IO4^l X IO6个/克。其中，所述高温菌剂还含有载体，所述载体为腐熟堆肥，所述腐熟堆肥含水率30%以下。所述高温菌剂的制备方法包括以下步骤I)菌种发酵将UTM802斜面菌种接种改良YTPG固态斜面上培养；将活化的菌种接种于改良YTPG液态培养基中培养,制备发酵种子液；将发酵种子液接种至发酵罐培养基中发酵培养，得发酵菌液；2)制备高温菌剂发酵液与腐熟堆肥混匀，干燥、粉碎、筛分得到。其中，步骤(I)中所述菌种活化的方法是取4°C保存的UTM802斜面菌种转接至改良YTPG固态斜面上，在65°C 70°C下培养至丰厚。所述改良YTPG固态斜面的配方是酵母提取物I. 5^2. 5g/L，蛋白胨I. 5^2. 5g/L，葡萄糖 I. 5 2. 5g/L，PIPES 4. 5 7. 5g/L，浸提液 IOOOmL, pH 7. 2 7· 4 (用固态 NaOH 调节)，植物凝胶8 12g/L，琼脂15 20g/L ；所述浸提液制备方法称取50g 100g —次发酵后腐熟堆肥(含水率小于30%)，カロ入250mL蒸馏水，在室温下，15(T200rpm振荡8 16小时；取振荡液在300(T4000rpm下离心5 20min，收集上清液，得浸提液母液，在4°C保存备用；使用吋，用蒸馏水稀释广3倍即为培
养基浸提液。所述发酵种子液制备的方法是取步骤(I)中活化培养至丰厚的斜面I个，用无菌水冲洗菌落至IOOOmL改良YTPG液态培养基中，在恒温摇床上振荡培养，得发酵种子液。所述改良YTPG液态培养基与上述步骤(I)改良YTPG固态斜面配方的区别是不含 有植物凝胶和琼脂。所述发酵种子液的培养条件是温度65 70°C，转速12(T200rpm，恒温摇床上振荡培养广3天。所述发酵菌液制备的方法是按5% 15%的接种量将发酵种子液接种至发酵罐中，在罐温28 35°C、罐压O. 02 O. 06MPa、通气量I: I. O I. 5v/v/min、搅拌速度200 300转/分钟、发酵时间3 8天，得到发酵液；发酵罐中所用的培养液组成为按200_400g/L的浓度将腐熟堆肥(含水率小于30%)溶解在水中，在室温下，15(T200rpm搅拌4 8小吋，然后静置过滤，收集上清液，得发酵母液；使用时，在发酵母液中加入1°/Γ3%的糖蜜或红糖，1°/Γ3%的碳铵、尿素、蛋白胨中的一种或多种制备成发酵罐培养基。其中，步骤(2)中所述高温菌剂的制备方法是将所得到的发酵菌液均匀喷洒在含水率30%以下的腐熟堆肥上，接种量约为5%-10%，然后经烘干、粉碎、过筛，制备成高温菌剂成品，高温菌剂中有效活菌个数I X IO4^l X IO6个/克。所述腐熟堆肥为利用有机固体废弃物经过高温好氧发酵制备的物料，有机固体废弃物包括农作物秸杆、畜禽粪便、食品エ业下脚料、城市污泥、生活垃圾、枯枝落叶、菇渣等，所述腐熟堆肥的标准为物料经过高温发酵后(55°C以上高温持续一周以上)温度下降到环境温度，含水率30%以下，种子发芽指数大于60%。高温菌剂在有机固废堆肥化中的应用方法是按重量比19Γ5%与待发酵物料混合即可。所述有机固废堆肥初始含水率45% 55%、C/N 20 30、ρΗ 7 8。本发明的有益效果是本发明所提供的嗜热栖热菌UTM802在堆肥达到60-80°C的高温环境中均生长良好，具有稳定的降解性能，能快速降解有机物质，加快堆肥进程。本发明菌株以有机废物为载体，制备固态微生物堆肥接种剂，成本低，应用于堆肥时不会对物料水分产生影响。利用本发明固态微生物堆肥接种剂进行高温堆肥，可避免接种剂中的活性微生物在高温发酵期失活，具有性能稳定、使用方便的特点。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I嗜热栖热菌UTM802的筛选称取5g高温期污泥堆肥样品于装有15个玻璃珠与50mL无菌水的150mL三角瓶中，置于摇床上160rpm振荡I小时，使样品充分散开，然后放置70°C下，静置3小吋。
取无菌平皿，吸取ImL高温富集液和低倍稀释液，接入已作好标记的平皿中；将已融化并冷却至55°C左右的改良YTPG培养基倒入无菌培养皿中，每皿约30mL，前后左右轻轻摇动培养皿，与富集液充分混匀，待凝固。将凝固后的平板倒置于密闭容器中，同吋，每密闭容器中放置一个装有蒸馏水的培养皿，置于培养箱中70°C培养。每天观察，待长出菌落后，仔细观察菌落特征，确定不同类型菌株，继续采用改良YTPG培养基平板上进行划线分离纯化，从平板上菌落形态特征和简单染色后显微镜下多视野确认菌体形态一致后得到纯菌，并继续在70°C下传代培养5代，淘汰生长不稳定的菌株，得到嗜热栖热菌UTM802。将UTM802转接转至改良YTPG培养基斜面，培养至丰厚，在4°C保藏备用。其中，改良YTPG培养基的配制方法是(I)浸提液制备先称取50g —次发酵后的腐熟污泥堆肥，加入250mL蒸懼水,在室温下，180rpm振荡过夜；取振荡液在4000rpm下离心lOmin，收集上清液，在4°C保存备用；使用吋，用蒸馏水稀释2倍即为培养基浸提液。 (2)按培养基配方(酵母提取物2. Og，蛋白胨2. 0g，葡萄糖2. 0g，PIPES 6. 0g，培养基浸提液IOOOmL, pH 8. O (用固态NaOH调节)，植物凝胶10g，琼脂15g)配制，在121°C下灭菌25分钟。实施例2嗜热栖热菌UTM802的鉴定将实施例I所得到的嗜热栖热菌UTM802在改良YTPG培养基平板上，70°C下培养24小时，观察其特征，结果它是革兰氏阴性、好氧菌且不形成孢子，菌体呈短杆状。以本发明菌株UTM802的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA序列，引物为(27f)5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3/ 和(1492r):5' -GGT TAC CTT GTTACG ACT T-3/ 。PCR反应程序为95°C预变性5min，95°C变性30s，53°C退火45s，72°C延伸90s，30个循环，72°C延伸lOmin。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID NO. I所示。获得的16S rDNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.eztaxon.org/)进行比对，同源性在97%以上的菌株只有Thermus thermophilus HB8 (T)(相似度98. 95%)，故将UTM 802 鉴定为 Ther mus thermophilus HB8(T)。配制复合培养基(O. 8%蛋白胨，O. 4%酵母膏，O. 2%NaCl，0. 05%微量元素，用NaOH调pH到7. 2，固体培养基加I. 5%琼脂。微量元素营养液组成为(25g MgCl2 · 6H20，5gCaCl2, 2g MgSO4 · 6H20，0. 5g ZnSO4 · 7H20，0. 5g H3B03，5g FeCl3 · 6H20，15mg CuSO4, 25mgNaMoO4 · 2H20, 20mg NiNO3 · 6H20, 50mg CoNO3 · 6H20,80mg 盐酸吡哆醇，IOmg 叶酸，O. 5mL 硫酸，IOOmg盐酸硫胺素,40mg核黄素，80mg烟酰胺，80mg对氨基苯甲酸甲酷，IOmg生物素，O. 4mg氰钴胺，80mg泛酸，20mg硫辛酸，200mg肌醇，50mg氯化胆碱，50mg乳清酸，IOOmg亚精胺，IOOOmL蒸馏水)，接种UTM802，发现在50°C _80°C下均能生长。结合文献报道，将该菌株鉴定为Thermus thermophilus HB8 (T),命名为Thermusthermophilus UTM 802，并于2012年6月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏,分类命名为嗜热栖热菌Thermus thermophilus,保藏号为CGMCCNo.6186。实施例3嗜热栖热菌UTM802生长的温度范围将UTM 802菌株接种于改良YTPG培养基平板上在70°C下活化培养24小吋。然后接种于改良YTPG培养基上，在培养温度40 V、50°C、60 V、70°C、80 V下培养。根据温度标记，分别放入不同的恒温箱中培养，在24小时后观察菌株长势，辨别菌株的生长情況。将观察结果填入下表I。“一”表示不生长；“ + ”表示微生长；“++”表示中度生长；“+++”表示生长良好。表I不同温度对微生物生长的影响
权利要求
1.嗜热栖热菌(Thermusthermophilus) UTM802，其保藏号为CGMCC No. 6186。
2.含有权利要求I所述嗜热栖热菌UTM802的高温菌剂。
3.根据权利要求2所述的高温菌剂，其特征在于，含有嗜热栖热菌UTM802的有效活菌个数I X IO4 IO6个/克。
4.根据权利要求2或3所述的高温菌剂，其特征在于，还含有载体，所述载体为腐熟堆肥。
5.根据权利要求4所述的高温菌剂，其特征在于，所述腐熟堆肥含水率30%以下。
6.权利要求2-5任一项所述高温菌剂的制备方法，包括以下步骤 1)菌种发酵将嗜热栖热菌UTM802活化，制备发酵种子液，之后进行发酵培养，得发酵菌液； 2)制备高温菌剂将发酵菌液与腐熟堆肥混匀，干燥、粉碎、筛分得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述菌液与腐熟堆肥的质量百分比为5% 10%。
8.权利要求I所述端嗜热菌UTM802菌株或权利要求2-5任一项所述高温菌剂在有机固废堆肥化中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在干，所述高温菌剂与有机固废混合的重量百分比为1% 5%。
全文摘要
本发明涉及嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)UTM802，其保藏号为CGMCC No.6186。本发明菌株以有机废物为载体，制备固态微生物堆肥高温菌剂，成本低，应用于堆肥时不会对物料水分产生影响。利用本发明固态微生物堆肥高温菌剂进行高温堆肥，可避免接种剂中的活性微生物在高温发酵期失活，具有性能稳定、使用方便的特点。
文档编号C12N1/20GK102851246SQ201210343220
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者刘永跃, 周顺桂, 许宜北, 汪涌 申请人:大地绿源环保科技(北京)有限公司