专利名称：离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法
技术领域：
本发明属于酶法合成食品添加剂领域，具体涉及一种离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法。
背景技术：
现有技术异槲皮苷(Isoquercitrin),即槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖苷(Quercetin-3-glucose),是自然界中非常罕见的一种具有显著的抗氧化性、抗肿瘤等生物活性的黄酮类化合物，是国际上各大医药食品公司竞相开发的高级食品添加剂、辅助药物或药物有效成分，也是国际上新型多功能食品添加剂EMIQ (Enzymatically ModifiedIsoquercitrin)的合成原料(Toxicology, 2010, 268 (3) :213_218)。从天然植物中分离提取异槲皮苷，这类方法通常需要使用大量的有机溶剂，且耗时费力，生产效率低。酸水解产生的大量酸性废水严重污染环境，且芦丁酸水解过程中槲皮素和异槲皮苷并存，这也增加了后期分离纯化的成本(African Journal of Biotechnology, 2011,10 (8) :1460_1466)。目前建立的生物转化芦丁定向合成异槲皮苷的酶促水解工艺(Journal ofMolecularCatalysis B =Enzymatic, 2012,81 :34_42)是公认的制备异槲皮苷最具前景的生产工艺。因而，提高糖苷酶酶促反应的速度和效率是提高芦丁转化率和异槲皮苷得率的关键技术之
O离子液体(Ionic Liquids, ILs)是由带正电荷的离子和带负电荷的离子构成，在-100°c和200°C间呈液体状态。ILs具有蒸汽压小、溶解性好、不挥发等传统溶剂所没有的优点。离子液体具有很强的可塑性，即可以组合不同的阴阳离子来适应反应底物的极性，从而提高底物的溶解性和酶促反应速率(Journal of MolecularCatalysis B Enzymatic, 2010,65 :68_72)。嗜热蛋白酶在离子液体中有较高的热稳定性(BiotechnologyProgress, 2000,16 :1129-1131), 80°C 条件下，在离子液体[BMIM] [PF6]水浴20h后，酶活性增加了 20% (Green Chemistry，2002，4 :147-151 )。脂肪酶经离子液体[Bmim] [PF6]、[Emim] [Tf2N]、[Bmim] [BF4]和[Emim] [BF4]处理后，活性分别增加 I. 81、I.66、1. 56 和 I. 6 倍(JournaI ofMolecular Catalysis BEnzymatic,2007,45 (3-4)118-121)。离子液体中的阴离子是影响酶活的重要因素，[NO3], [CF3CO2], [CH3CO2]等比[PF6]具有更高的亲核性，使得它们能更好地与脂肪酶中带正电荷的位点结合，影响酶的构象从而影响酶的活性(Journal of the American Chemical Society, 2003,125 (14)4125-4131)。专利US2008299623A1中报道了在酶催化反应中，含有离子液体的反应介质可以提高底物溶解性，提高酶的活性及选择性，减少产物抑制和副反应的发生。脂肪酶CALB在离子液体[EMIM] [BF4]中催化葡萄糖的酯化反应具有很高的选择性，在[Μ0ΕΜΙΜ] [BF4]中反应迅速，且55°C时葡萄糖的溶解度可达5g/L,是丙酮中的100多倍(Current Opinionin Biotechnology, 2003,14 :432-437)。β -半乳糖苷酶催化N-乙酰葡萄糖胺生产乳糖的反应中，由于产物N-乙酰乳糖胺的竞争性二级水解使产率受到抑制。此反应在[MMIm][MeSO4] /水(V/V25 75)中进行时，产率达58%，而在水-缓冲液体系中进行时，产率仅为 30% (Biotechnology and bioengineering, 2006,95 (6) :1093_1100)。然而，尚未见以离子液体作共溶剂强化酶促合成异槲皮苷的报道。以缓冲水溶液为介质的传统反应体系中，芦丁的溶解度低，且酶促反应效率差。本专利中，在传统的水溶液反应体系中加入离子液体，有利于提高底物溶解度，提高酶促反应效率，且操作简便，对环境友好。
发明内容
解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明提供了一种离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，该方法可大大地提高了酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应效率。技术方案离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，包括橙皮苷酶或柚皮苷酶水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系，该反应体系中包括以磷酸氢二钠-朽1檬酸缓 冲液配制芦丁母液，以及橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，在该反应体系中含有离子液体，所述离子液体由阳离子和阴离子配合而成，阳离子类型为[Emim]、[Bmim]、[TOMA]、[Hmim]、[Nmim]或[EMPY]，阴离子类型为[BF4]、[PF6]、[Tf2N]、[HSO4]、[Tf0]或[C4F9SO3]，阴阳离子比例为I 1，芦丁母液与离子液体混合后芦丁的浓度为0. 26-0. 97g / L，pH为3-10，反应体系中按体积比加入5-50%的离子液体、45-90%的芦丁母液和5-45%的橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，反应温度范围为20-60°C，振荡转速为50-300r / min，反应时间范围为l_40h。缓冲液配制的芦丁母液与离子液体混合后芦丁的浓度为0. 72g / L0缓冲液配制的芦丁母液与离子液体混合后的pH为5。反应体系中按体积比加入10%的离子液体、72%的芦丁母液和18%的橙皮苷酶液。反应体系的反应温度范围为40°C。反应体系的振荡转速为120r / min。反应体系的反应时间范围为7h。反应结束后HPLC检测表明，离子液体共溶剂体系中异槲皮苷的得率要高于相同反应条件下缓冲液体系的得率。有益效果在离子液体共溶剂体系中酶催化水解芦丁制备异槲皮苷，反应速率增大，产物得率比传统水溶液体系要高，因此，离子液体共溶剂体系为异槲皮苷的生产提供了新的反应介质。该方法操作简单，反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明进行任何改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所述权利要求书所限定的范围。本发明实施例中使用HPLC法同时检测芦丁和异槲皮苷，色谱条件:Alltima C18(250X4. 6mm，5 μ m)，流动相0. 02%磷酸-乙腈(80 20，V / V);检测波长360nm ;流速1. OmL / min ;进样量:20 μ L。使用HPLC法检测槲皮素，色谱条件=Alltima C18C250X4.6_，5μπι)，流动相0. 5mol / LpH4. O醋酸胺缓冲液-乙腈(73 27, V / V);检测波长360nm ;流速1. OmL / min ;进样量20 μ L。其中，芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率的计算方法如下
芦丁转化率=^^^^yxl00%
+ 初始芦丁量
异槲皮苷摩尔麵 初始原料芦丁的摩尔量·
槲臟獅勝&越称取O. Ig橙皮苷酶或柚皮苷酶，加水溶解，定容至10mL，得O. Olg / mL的橙皮苷酶液或柚皮苷酶液。实施例I以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制pH=3. O的O. 26g/L的芦丁母液，以体积比5%的离子液体[Emim] [BF4]，阴阳离子比例为I : 1、90%的芦丁母液和5%的橙皮苷酶液构成反应体系，在60°C条件下，300r / min振荡反应lh。反应结束后，HPLC检测芦丁、异槲皮苷和槲皮素。芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率分别为30^^23%和O.5%，与同样条件下的缓冲液体系相比，异槲皮苷摩尔得率提高了 O. 8%。实施例2以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制PH=IO. O的O. 41g/L的芦丁母液，以体积比50%的离子液体[Bmim] [BF4]，阴阳离子比例为I : I、45%的芦丁母液和5%的橙皮苷酶液构成反应体系，在20°C条件下，50r / min振荡反应40h。反应结束后，HPLC检测芦丁、异槲皮苷和槲皮素。芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率分别为30%、15%和
I%，与同样条件下的缓冲液体系相比，异槲皮苷摩尔得率提高了 2 %。实施例3以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制pH=5. O的O. 82g/L的芦丁母液，以体积比10%的离子液体[Emim] [BF4]，阴阳离子比例为I : 1、72%的芦丁母液和18%的橙皮苷酶液构成反应体系，在40°C条件下，120r / min振荡反应7h。反应结束后，HPLC检测芦丁、异槲皮苷和槲皮素。芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率分别为94^^96%和11%,与同样条件下的缓冲液体系相比，异槲皮苷摩尔得率提高了 89%。实施例4以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制pH=7. O的O. 29g/L的芦丁母液，以体积比50%的离子液体[Bmim] [Tf2N],阴阳离子比例为I : I、40%的芦丁母液和10%的橙皮苷酶液构成反应体系，在40°C条件下，120r / min振荡反应24h。反应结束后，HPLC检测芦丁、异槲皮苷和槲皮素。芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率分别为98 %、53 %和2%，与同样条件下的缓冲液体系相比，异槲皮苷摩尔得率提高了 5%。实施例5
以甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制pH=9. O的O. 97g/L的芦丁母液，以体积比10%的离子液体[Bmim] [BF4]，阴阳离子比例为I : I、72%的芦丁母液和18%的橙皮苷酶液构成反应体系，在40°C条件下，120r / min振荡反应12h。反应结束后，HPLC检测芦丁、异槲皮苷和槲皮素。芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率分别为98^^99%和2%,与同样条件下的缓冲液体系相比，异槲皮苷摩尔得率提高了 60 %。实施例6以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制pH=7. O的O. 29g/L的芦丁母液，以体积比5%的离子液体[Emim] [BF4]，阴阳离子比例为I : 1、50%的芦丁 母液和45%的橙皮苷酶液构成反应体系，在30°C条件下，50r / min振荡反应40h。反应结束后，HPLC检测芦丁、异槲皮苷和槲皮素。芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率分别为82^^48%和10%，与同样条件下的缓冲液体系相比，异槲皮苷摩尔得率提高了 3%。实施例7以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制pH=7. O的O. 29g/L的芦丁母液，以体积比5%的离子液体[Emim] [BF4]，阴阳离子比例为I : I、50%的芦丁母液和45%的柚皮苷酶液构成反应体系，在30°C条件下，120r / min振荡反应40h。反应结束后，HPLC检测芦丁、异槲皮苷和槲皮素。芦丁转化率、异槲皮苷摩尔得率和槲皮素摩尔得率分别为65%、37%和9%，与同样条件下的缓冲液体系相比，异槲皮苷摩尔得率提高了 2%。
权利要求
1.离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，包括橙皮苷酶或柚皮苷酶水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系，该反应体系中包括以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制芦丁母液，以及橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，其特征在于在该反应体系中含有离子液体，所述离子液体由阳离子和阴离子配合而成，阳离子类型为[Emim]、[Bmim]、[TOMA]、[Hmim]、[Nmim]或[EMPY]，阴离子类型为[BF4]、[PF6]、[Tf2N]、[HSO4]、[TfO]或[C4F9SO3]，阴阳离子比例为I 1，芦丁母液与离子液体混合后芦丁的浓度为O. 26-0. 97g / L，pH为3-10，反应体系中按体积比加入5-50%的离子液体、45-90%的芦丁母液和5-45%的橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，反应温度范围为20-60°C，振荡转速为50-300r / min，反应时间范围为l_40h。
2.根据权利要求I所述的离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于缓冲液配制的芦丁母液与离子液体混合后芦丁的浓度为O. 72g / L0
3.根据权利要求I所述的离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于缓冲液配制的芦丁母液与离子液体混合后的pH为5。
4.根据权利要求I所述的离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于反应体系中按体积比加入10%的离子液体、72%的芦丁母液和18%的橙皮苷酶液。
5.根据权利要求I所述的离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于反应体系的反应温度范围为40°C。
6.根据权利要求I所述的离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于反应体系的振荡转速为120r / min。
7.根据权利要求I所述的离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于反应体系的反应时间范围为7h。
全文摘要
离子液体共溶剂效应强化酶促合成异槲皮苷的方法，包括橙皮苷酶或柚皮苷酶水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系，该反应体系中包括以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制芦丁母液，以及橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，在该反应体系中含有离子液体，所述离子液体由阳离子和阴离子配合而成。在离子液体共溶剂体系中酶催化水解芦丁制备异槲皮苷，反应速率增大，产物得率比传统水溶液体系要高，因此，离子液体共溶剂体系为异槲皮苷的生产提供了新的反应介质。该方法操作简单，反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。
文档编号C12P17/06GK102876746SQ20121038328
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者王俊, 吴福安, 孙国霞 申请人:江苏科技大学