断肠草鉴别的引物及pcr方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能够特异鉴定断肠草的PCR扩增方法及其特异引物。使用此方法鉴别断肠草与金银花，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于断肠草与金银花之间的快速鉴定。
【专利说明】断肠草鉴别的引物及PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能够特异鉴定断肠草的PCR扩增方法及其特异引物。
【背景技术】
[0002]断肠草为马前科植物钩吻Gelsemium elegans (Gardn.el Champ) Benth.的莖藤。
又名胡蔓藤、野葛、水莽草、大茶叶、烂肠草，是一种剧毒草药。有祛风攻毒、消肿、止痛之功效。可治湿疹、痈肿、风湿痹痛等。
[0003]近年来由于误服断肠草而中毒的事故在各地不断发生，对其也进行了许多研究，证实断肠草的根、茎、叶子的主要成分为钩吻素子、钩吻素寅、钩吻素卯等。调查发现误将断肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒的事件时有发生，在断肠草中毒的78例临床事件中，发现43例为因误将断肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒，18例为将断肠草根为其他草药煮水喝而中毒(李文升.急性断肠草中毒78例临床分析，医学信息，2011,24(9):5872)。因此，建立一种用于鉴别钩吻和金银花的方法非常重要。
[0004]黄伟雄等采用色谱的方法通过分析钩吻碱成分对断肠草中进行鉴定(黄伟雄，李汴生，范山湖，等.应用TLC法鉴定断肠草中钩吻碱，华南预防医学，2008，34(1):60),但这种方法比较繁琐，不利于推广。近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如DNAbarcoding和位点特异性PCR等克服了药材传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点。对断肠草与金银花之间的分子鉴别还尚未见报道，本发明通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花的快速、准确鉴别。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR方法及引物。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种断肠草的PCR引物及其鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、样品量少，能快速、准确的将断肠草从其易混淆的金银花样品中鉴定出来，为断肠草鉴定提供了一种实用的技术。
[0006]1、一种鉴定断肠草的特异引物F1、F2，其序列为:
[0007]Fl:5’ -TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3’，
[0008]F2:5’ -GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3,。
[0009]2、一种断肠草的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤:
[0010]a)从所述材料中提取到DNA样品；
[0011]b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括=IOXbuffer缓冲液 2yL，dNTPl.6μ L，引物各 0.5μ L，EX Tap 酶 0.2 μ L，DNA0.5 μ L，灭菌蒸馏水 14.7 μ L0反应条件:解链温度95°C，时间5min，退火温度57°C，时间30s，复性温度72°C，时间为lmin40s，35个循环后72°C延伸，时间为7min ；
[0012]c)电泳所述扩增产物，如果存在分子量约为300bp的单一条带，则确定所检材料为断肠草。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1:断肠草、金银花、山银花及水银花PCR鉴别结果
[0014]1.断肠草(广西)；2.断肠草(贵州)；3.空白对照；4.金银花(河南)；5.金银花(广西)；6.金银花(江苏)；7.金银花(北京)；8.山银花(广西)；9.山银花(云南)；10.山银花(贵州)；11.水银花(贵州)；M.DNA分子量标准:从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp
【具体实施方式】
[0015]I 材料
[0016]所用材料如表1所示，包括:
[0017]表1样品来源表
【权利要求】
1.一种鉴定断肠草的特异引物F1、F2，其序列为:F1:5’-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3’，F2:5’ -GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3’。
2.一种断肠草的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤: a)从所述材料中提取到DNA样品； b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括=IOXbuffer缓冲液2μ L，dNTPl.6μ L，引物各 0.5μ L，EX Tap 酶 0.2 μ L，DNA0.5 μ L，灭菌蒸馏水 14.7 μ L ;反应条件:解链温度95°C，时间5min，退火温度57°C，时间30s，复性温度72°C，时间为lmin40s，35个循环后72°C延伸，时间为7min ； c)电泳所述扩增产物 ，如果存在分子量约为300bp的单一条带，则确定所检材料为断肠草。
【文档编号】C12Q1/68GK103820529SQ201210464624
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月19日 优先权日:2012年11月19日
【发明者】黄璐琦, 袁媛, 李旻辉, 崔占虎, 蒋超 申请人:中国中医科学院中药研究所