专利名称：用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及人乳头瘤病毒检测的试剂盒领域，尤其涉及用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针及其试剂盒。
背景技术：
人乳头瘤病毒(Hyman papillomvir μ s，HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性，人类是它唯一的宿主。目前已经确定HPV型别已经超过了 120种，约30余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，从而导致尖锐湿疣以及宫颈病变，甚至可能引起宫颈癌的发生。不同亚型的HPV感染导致不同病变，根据病变的程度高低，将HPV亚型分为高危型和低危型。低危型与性传播疣或尖锐湿疣有关，一般不诱发癌变，常见的型有6、
11、42、43、44 ;高危型与子宫颈癌及子宫上皮内瘤变的发生有关，常见的高危型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，2004 年发布的 HPV handbook 中国际上公认的导致宫颈癌的 HPV 高危型为 HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82等18种型。研究显示HPV感染存在多样性和地区差异性，各国各地区型别不同，国际癌症研究协会(IARC)的研究显示，在全世界范围内最常见亚型为HPV16，其次往往是HPV18。除了这两个基因型外，其他HPV基因型的分布存在明显的地域差异，非洲较为流行的是HPV45和HPV33，欧洲较为流行的是HPV45，南、北美洲是HPV31、33和45。在亚洲相对较为流行的是HPV58和52。HPV的型别还与宫颈癌的病理类型有关，在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16为主(占51%)，而在宫颈腺癌和宫颈腺鳞细胞癌中HPV分别占56%和39%。高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV感染使得宫颈癌的相对危险性增加250倍，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展宫颈癌大约需要5-10年。因此，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。目前常见的HPV检测方法包括测序法、杂交捕获法、导流杂交法及荧光PCR法。测序法的结果相对准确，但操作繁琐，且对操作者的要求较高，灵敏度低，不适于临床应用；杂交捕获法假阳性高、操作时间长、无法区分具体型别、成本较高，不宜在经济较不发达的发展中国家推广；导流杂交法在市场上虽仍有一定占有量，但该方法无法避免因产物污染造成的假阳性现象，这也就限制了其在临床上的大规模应用；荧光PCR法不但灵敏度高特异性强，而且自动化程度高，成本适中，几乎不会造成污染，为人乳头瘤病毒的早期诊断提供优势。目前国内市场已批准上市的HPV检测试剂有多种，有表面等离子谐振法(SPR)、PCR-荧光偏振技术、基因芯片法、流式荧光杂交技术即液态芯片法、PCR+膜杂交法、杂交捕获法、PCR-反向点杂交法、实时荧光PCR法等多种平台技术的产品共34个。生产厂家主要有QIAGEN、潮州凯普生物化学有限公司、亚能生物技术(深圳)有限公司、港龙生物技术(深圳)有限公司、凯杰生物工程(深圳)有限公司、上海之江生物科技有限公司、中山大学达安基因股份有限公司、北京金菩嘉医疗科技有限公司、上海透景生命科技有限公司、上海科华生物工程股份有限公司、泰普生物科学(中国)有限公司等。目前荧光PCR产品共计19个，均使用Taqman探针，不同的产品检测的型别各不相同，其中有6个产品只能检测低危型，检测高危型产品中最多只能检测13中常见的高危型。分别是港龙生物技术(深圳)有限公司、潮州凯普生物化学有限公司、上海之江生物科技有限公司、泰普生物科学(中国)有限公司生产的产品。目前市面上还没有同时检测18种高危型HPV的荧光PCR产品。PCR检测中，同一试剂盒检测的型别越多，对引物和探针的灵敏度、特异性的要求就越高，现有技术的探针没有办法实现18种高危型HPV同时检测。表1.与本发明相关的已经公开的专利申请相关统计对比
权利要求
1.用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针，所述18种高危型人乳头瘤病毒是指 HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 和 HPV82，其特征在于，所述引物为一组通用引物，序列如SEQ ID NO 1—SEQ ID NO :4所示，所述探针为特异探针，序列如SEQ IDNO :7— SEQ ID NO 24 所示 检测HPV16型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:7所示； 检测HPV18型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:8所示； 检测HPV26型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:9所示； 检测HPV31型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 10所示； 检测HPV33型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 11所示； 检测HPV35型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 12所示； 检测HPV39型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 13所示； 检测HPV45型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 14所示； 检测HPV51型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 15所示； 检测HPV52型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 16所示； 检测HPV53型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 17所示； 检测HPV56型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 18所示； 检测HPV58型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 19所示； 检测HPV59型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:20所示； 检测HPV66型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:21所示； 检测HPV68型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:22所示； 检测HPV73型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:23所示； 检测HPV82型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO: 24所示； 所述分子信标探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、ROX、JOE、HEX和TAMRA中的一种或几种，所述淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2和DABCYL中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物还包括SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示序列中的一种或两种。
4.一种利用权利要求1所述引物和探针的高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO=1-SEQ ID NO :4所示的引物，以及序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID N0:24所示的探针序列中的一种或几种。
5.一种利用权利要求3所述引物和探针的高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含的引物序列如SEQ ID NO =1-SEQID NO :4所示，以及包括SEQID NO :5和SEQ ID NO :6所示序列中的一种或两种，探针序列如SEQ ID NO:7—SEQ IDNO:24所示序列中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测18种高危型人乳头瘤病毒，包含的引物序列如SEQID NO 1—SEQ ID NO :6所示，探针序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID N0:24所示。
全文摘要
本发明公开了用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针及其试剂盒，通过添加不同的特异性探针达到检测不同分型试剂盒，能一次检测国际公认和宫颈癌密切相关的常见的18种高危型人乳头瘤病毒DNA，并对HPV16、18型进行分型检测。本申请提供6条通用引物和18条特异的分子信标探针，该6条通用引物能将18种高危型人乳头瘤病毒DNA扩增出来，而18条探针是针对18种高危型设计的特异的分子信标探针，可以根据检测的需求添加不同型的探针，从而组合成针对不同高危型检出需求的试剂盒，同时对所添加的探针进行不同报告基团的标记达到对高危型HPV进行分型检测的目的。
文档编号C12Q1/70GK102994651SQ201210497179
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者江春琴, 高清云 申请人:英科新创(厦门)科技有限公司