专利名称：可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及植物表达载体的构建，具体地说，涉及一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法。
背景技术：
尽管植物基因组学研究取得了重大进展，很多种植物的基因组序列测序工作已完成，但基因的功能还是知之甚少，对于基因的特定时间和空间、特定发育阶段的功能、不同种植物同源基因的功能进化和分化同样缺乏了解。同样地，虽然对某些植物基因功能、基因间的互作有了较为深入的了解，但是它们在特定条件下的详细功能及互作关系了解甚少。基因的表达量是基因功能体现的第一步，基因表达量的闻低往往决定植物相应表型的强弱。将目标基因限定在特异的条件下表达，是分析基因特异功能的重要方法。目前大多数基因的过表达是采用组成型的启动子(如35S)驱动大多数基因在植物中表达，但是，这些启动子也有很多负效应。如35S启动子产生明显的异位效应，在有些器官组织中或有些植物中35S没有明显活性，甚至对邻近基因会产生不利的效应。同时，现有植物表达载体系统没有考虑在某一特殊的启动子下过表达某一基因，常常是在某一特定启动子直接表达目标基因，而分析增强特定启动子的活性下表达目标基因才是真正意义上的过表达基因；另外，现有基因沉默载体系统采用35S启动子，未涉及在特定启动子指导下沉默目标基因。在自然启动子(nativepromoter)驱动下,分析基因表达量与植物表型之间的关系，方能对基因功能的解析提供真实的、有价值的可靠数据。
基因的功能是多方面，即某一基因往往具有多种受时空特异调节的功能，基因突变也就常常造成植物的多种表型。要研究基因在特殊器官、特殊发育时期、特异生长条件下的功能，通过特异启动子来分析是最重要和最有效的手段。目前，DNA片段(基因和启动子等)克隆方法有酶切连接、同源DNA重组等。同源重组方法虽然高效，但是在植物中的应用常常仅针对基因而设计载体，启动子是固定在植物表达载体上。因而，如果要更换启动子，必须通过酶切连接的方法将新的启动子更换载体上原有的启动子。然而，植物表达载体常常会有酶切位点少、载体不易操作等缺点，导致克隆工作费时、费力。尽管现在已有一些载体将DNA重组克隆同时用于基因和启动子，但因为它们采用多套重组系统，导致重组反应效率很低；并且，不同的研究者根据各自的需求设计不同的载体，这些载体系统之间难于兼容，从而导致这些载体的推广应用受到限制，无法实现同行之间的资源共享，造成不必要的资源浪费，且在一定程度上制约植物功能基因组研究的进展。基因的标记是基因产物蛋白质功能研究的重要手段。现有的同源重组克隆基因方法中，常常将标记分子(如GFP、MYC、HA、FLAG等)放在植物表达双元载体上。这样，通过DNA重组后，虽然目标基因与标记分子产生融合蛋白，但是在目标基因与标记分子之间产生约20个氨基酸的间隔片段，这一间隔片段很有可能导致产生溶解性很差的或结构发生改变的、没有生物学功能的融合分子。
随着研究的不断深入，在实际工作中常常需要对蛋白进行新的、特殊的修饰、标记或增加新的调控元件，或需要对基因的表达进行特殊的调节，这样就需要对目标基因或启动子添加特殊的顺式或反式元件或是特殊标记。现有的入门克隆是将基因或启动子直接克隆到载体上，不能将新的调控元件或标签应用于启动子和基因，更无法将标记蛋白的体系转换为标记其它分子(如RNA)的载体体系，即载体缺乏可塑性，难以实现研究者各种新的、特殊的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法。为了实现本发明目的，本发明的一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体，由三类载体组成基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV ;其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attLl和attL2, PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attRl和attR2,可分别与attLl和attL2进行位点特异的重组,另一套为attR3和attR4,可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组，将GEC、PEC和BDV置于同一反应体系中，通过LR反应，即得。优选地，attLl、attL2、attL3、attL4、attRl、attR2、attR3和 attR4 的核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 1-8所示。所述基因入门克隆载体GEC和启动子入门克隆载体PEC的出发载体优选为PUC19。所述基因入门克隆载体GEC上优选含有下列元件中的一种或多种多克隆位点MCS、AhdI酶切位点 、ccdB基因、细菌筛选标记、蛋白标记。所述启动子入门克隆载体PEC上优选含有下列元件中的一种或多种多克隆位点MCS、AhdI酶切位点、ccdB基因、细菌筛选标记、顺式调控元件(例如，I或2个增强子)、反式调控元件。更优选地，所述多克隆位点MCS含有18个酶切连接位点REL，所述多克隆位点MCS含有27个酶切连接位点REL。所述植物双元目的载体BDV的骨架载体优选为pGreen和pClean。所述植物双元目的载体BDV上优选含有细菌筛选标记和/或两端带有多个酶切连接位点REL的植物筛选标记。本发明进一步提供上述植物表达载体的构建方法将基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV置于同一反应体系中，通过LR反应获得；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attLl和attL2, PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attRl和attR2,可分别与attLl和attL2进行位点特异的重组,另一套为attR3和attR4,可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组。本发明巧妙地整合常规酶切连接技术和DNA重组技术，创建可灵活置换调控元件的高效多功能载体体系。该体系在DNA片段(基因和启动子)克隆、蛋白标记、任意组装启动子和基因以及引入各种顺式或反式调控元件(cis or trans-elements)等方面具有显著的优势。本发明采用的MCS位点如
图1和图2所示，适合于现有通用的内切酶。DNA重组事件发生在相互作用的DNA分子上的特异附属序列位点(specificattachment sites,att site)之间。本发明采用DNA重组位点是Invitrogen公司设计的attLl 和 attL2、attL3 和 attL4、attRl 和 attR2、attR3 和 attR4。attL 位点总是与 attR位点发生重组反应，并产生attB和attP位点。只有相应编码的重组位点(att)之间(如attLl 与 attRl 之间、attL2 与 attR2 之间、attL3 与 attR3 之间或 attL4 与 attR4 之间)可以发生重组[13_14]，从而保证重组位点的特异性和DNA重组的定向性。本发明的载体系统主要有三类载体组成基因入门克隆(gene entry clone, GEC,图1和表I)、启动子入门克隆(promoter entry clone, PEC,图2和表2)以及植物双元目的载体(binary destination vector, BDV,图 3-图 6 以及表 3)。GEC 和 PEC 分别携带一套位点特异的重组序列(site-specific recombination, SSR) :GEC所携带的SSR为attLl和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4。BDV上则携带两套SSR位点，其中attRl和attR2与attLl和attL2相匹配，attR3和attR4与attL3和attL4相匹配，相互匹配的位点可以进行位点特异的重组，以确保重组位点的特异性。将GEC、PEC和BDV放在同一反应体系中，通过LR反应，就可以将基因和启动子同时组装到一个植物双元表达载体。本发明的基因入门克隆和启动子入门克隆是基于PUC19上构建而成。pUC19载体是一个常用的基因克隆中间载体，并以其易操作著称。本发明在GEC中引入含有18个酶切/连接位点(restriction enzyme/ligase,REL)的多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)(图1),目标基因或其标记基因是通过酶切/连接的方法进行克隆的；并且各GEC的MCS保持一致，这样目标基因或其标记基因就很容易通过酶切/连接的方法进行克隆构建，并可以很容易在不同的GEC之间进行克隆操作。本发明的GEC中含有AhdI酶切位点，可用于目标基因的TA克隆。本发明在GEC中引入了 ccdB基因，作为基因连 接产物转化的负筛选标记。本发明的GEC由一组载体构成(表1)，该组载体的各成员分别在不同的部位带有不同的标签，从而可以提供目标蛋白在N端或C端进行各种标签的标记。因为标签插在紧挨着SSR位点内的MSC内，这样就有可能实现蛋白与标签之间的距离最小化。由于常规的DNA重组连接技术(如GATEWAY技术)是将蛋白标签放在双元载体上，从而在经过DNA重组后常常导致蛋白与标签之间产生一个含22个氨基酸的间隔，而这段间隔可能导致产生的蛋白没有功能。本发明的载体可避免这一负效应。本发明的所有GEC中所含MCS位点后都有终止密码，这样在进行基因克隆时就不必加上终止密码，而不含终止密码的基因可用于N端和C端进行标记。传统的DNA重组技术(如GATEWAY技术)必须分别构建用于N端或C端的入门载体。因而，本体系简化了载体构建流程。本发明的所有GEC的MCS位点含有大量的REL位点，可以用于对载体进行各种改造。如在SSR内侧加上RNA结合的序列(16X BoxB或6X MS2)后的载体可用于标记RNA，跟踪 RNA。本发明在PEC中引入含有27个REL的MCS (图2)，目标启动子或其调控元件是通过酶切/连接的方法进行克隆的；并且各PEC的REL保持一致，这样目标启动子或其调控元件也就很容易进行克隆构建，并可以很容易在不同的PEC之间进行克隆操作。本发明的PEC中含有AhdI酶切位点，可用于目标启动子的TA克隆。本发明在PEC中引入了 ccdB基因，作为启动子连接产物转化的负筛选标记。本发明有3种PEC (表2):即没有插入增强子的、插入I个增强子和插入2个增强子3种PEC。这样可以确保目标基因在不同强度的启动子驱动下进行表达，并且避免类似强启动子(如35S)带来的各种不利效应。本发明的所有BDV是基于pGreen骨架设计完成(图3)，并采用pClean的高效插A T-DNA序列。为确保转基因材料始终携带目标基因，本发明的所有BDV将在植物中的选择标记基因放在紧挨着左边界(left border)区。本发明在BDV中引入了 ccdB基因，作为LR反应产物转化的负筛选标记。本发明的BDV骨架来源于pGreen和pClean,而pGreen和pClean适合于单子叶植物和双子叶植物的遗传转化。因而，本发明的所有BDV适用于各种植物的遗传转化，用于所有相关领域的研究，如研究基因组基因表达、蛋白编码区(CDS)表达、标记蛋白基因表达、蛋白互作、基因沉默、乙醇诱导表达等方面的研究。本发明的BDV含有多种细菌筛选标记以及多种植物筛选标记(表3)，可用于多个基因的共转化。 本发明的BDV上的筛选标记两端有多个酶切位点(图3)，可用于根据实际需要更换新的筛选标记。本发明的所有入门克隆上的重组位点是通用性的，具有很高的兼容性，可用于目前已有的植物、细菌、真菌等GATEWAY表达载体。本发明的启动子入门克隆可用于构建启动子文库，基因入门克隆可用于构建基因文库。本发明的启动子入门克隆和基因入门克隆具有大量的酶切/连接位点，因而都可以作为中间载体用于任何DNA片段的克隆。本发明涵盖表1、表2及表3的所有载体以及在本系统所有载体基础上进行改造或修饰后获得的植物表达载体。表I 基因入门克隆载体(Gene entry clones, GEC)
权利要求
1.可灵活置换调控元件的高效植物表达载体，其特征在于，由三类载体组成基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV ;其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attLl和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attRl和attR2，可分别与attLl和attL2进行位点特异的重组,另一套为attR3和attR4,可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组，将GEC、PEC和BDV置于同一反应体系中，通过LR反应，即得。
2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，attLl、attL2、attL3、attL4、attRl、attR2、attR3和attR4的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1-8所不。
3.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述基因入门克隆载体GEC和启动子入门克隆载体PEC的出发载体为pUC19。
4.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述基因入门克隆载体GEC上含有下列元件中的一种或多种多克隆位点MCS、Ahd I酶切位点、ccdB基因、细菌筛选标记、蛋白标记。
5.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述启动子入门克隆载体PEC上含有下列元件中的一种或多种多克隆位点MCS、AhdI酶切位点、ccdB基因、细菌筛选标记、顺式调控元件、反式调控元件；优选所述顺式调控元件为I或2个增强子。
6.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于，所述多克隆位点MCS含有18个酶切连接位点REL。
7.根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述多克隆位点MCS含有27个酶切连接位点REL。
8.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物双元目的载体BDV的骨架载体为pGreen和pClean。
9.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物双元目的载体BDV上含有细菌筛选标记和/或两端带有多个酶切连接位点REL的植物筛选标记。
10.权利要求1-9任一项所述植物表达载体的构建方法，其特征在于，将基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV置于同一反应体系中，通过LR反应获得；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attLl和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attRl和attR2,可分别与attLl和attL2进行位点特异的重组，另一套为attR3和attR4,可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组。
全文摘要
本发明涉及一种可灵活置换调控元件的高效植物表达载体及其构建方法，该高效植物表达载体由三类载体组成基因入门克隆载体GEC、启动子入门克隆载体PEC以及植物双元目的载体BDV；其中，GEC和PEC分别携带一套位点特异的重组序列SSR，GEC携带的SSR为attL1和attL2，PEC携带的SSR为attL3和attL4，BDV上携带两套SSR位点，其中一套为attR1和attR2，可分别与attL1和attL2进行位点特异的重组，另一套为attR3和attR4，可分别与attL3和attL4进行位点特异的重组，将GEC、PEC和BDV置于同一反应体系中，通过LR反应获得。本发明的高效植物表达载体具有通用性，可快速、高效组合任意启动子、基因及各种调控元件，实现各种研究目的。
文档编号C12N15/82GK103060370SQ201210500978
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者傅永福, 王旭, 朱金龙, 张晓玫 申请人:中国农业科学院作物科学研究所