专利名称：一种糖化酶及其重组表达菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种糖化酶及用于表达该糖化酶的重组表达工程菌。
背景技术：
糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase),它能把淀粉从非还原性未端水解α -1. 4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1. 6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。 我国高转化率糖化酶市场发展迅速，产品产出持续扩张，国家产业政策鼓励高转化率糖化酶产业向高技术产品方向发展。2011年国内糖化酶的市场容量为5亿元人民币，而且市场以每年20%速度在增长。预计2012年市场容量不低于6亿元。糖化酶价格则自2007年起不断上涨，由2元/公斤涨到2. 7元/公斤。因此，国内企业新增糖化酶投资项目也逐渐增多。目前常用的糖化酶均是来自黑曲霉。自70年代中期开始，中科院微生物所筛选获得了高产糖化酶菌株AS. 3. 4309。该菌株国内许多大型抗生素制药厂、酒精厂、酿酒厂进行了生产规模试验，均获得成功。该项目的成功为我国发酵行业节约了大量的粮食，产生了巨大的经济效益和社会效益。市场越来越密切关注高转化率糖化酶，这使得克隆和表达高转化率糖化酶成为研究的热点之一。蛋白表达系统是黑曲霉，其产酶量(蛋白量)较高，但是受到糖化酶本身性质的影响，黑曲霉表达糖化酶的比活比较低，不能适应市场的需求。因此，开发性能优良、比活高的糖化酶越来越受到各方的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型糖化酶及其重组表达工程菌，并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行表达,为实现糖化酶的高密度发酵生产奠定了基础。本发明一方面提供一种新型的糖化酶，所述的糖化酶包括I)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶；2)在I)限定的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖化酶功能的，由I)衍生的蛋白质。用于编码上述糖化酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID N0:2。本发明另一方面提供了一种表达载体，其包含上述编码糖化酶的核苷酸。本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述糖化酶基因的表达载体。上述表达宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到196U/mL。所述糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α -1, 4-糖苷键，因此，能将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。
图1 :构建的表达载体质粒图谱。图2 :里氏木霉工程菌发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指为重组表达的糖化酶。
具体实施例方式以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 实施例1绳状青霉(Penicillium funiculosum)糖化酶基因的克隆1.1总DNA的提取将绳状青霉(购自中国普通微生物囷种保减管理中心，囷株编号3. 3791)过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400 μ I抽提缓冲液(100mM Tris-HCl, IOOmMEDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；651水浴201^11后，加入20(^1 IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm离心IOmin,取上清；加入2倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ；13000 rpm离心IOmin,弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。1. 2基因克隆以绳状青霉基因组为模板,采用Genome Walking方法克隆基因。Genome WalkingKit购自TaKaRa公司。本实验根据已知的部分序列设计了六条SP引物，分别扩增5’端和3’端未知序列。SP引物如下其中5R-SP-l、5R-SP-2和5R-SP-3为扩增5’端SP弓丨物；而3F-SP-U3F-SP-2和3F-SP-3为扩增3’端SP引物。SP系列引物的具体序列如下表所示
5R-SP-1 Igatggggtmatggagcggaag
5R-SP-2~GCAAGGCTGGAAAGTAGAGTCATC 5R-SP-3~CAATGGTGMGAACGACGAGCC 3F-SP-1 ~CTCATCTCCAAACCGTGTCTAATCC 3F-SP-2~TACGGCTTTGATTGCCTATGGT 3F-SP-3~CTGATTATGCTCCAGGACAACGG第一轮反应组成基因组 DNA O. 5μ I ；dNTP 4μ I ； 10 X buffer 5 μ I ;AP 引物I μ I ；SP1 引物 I μ I ;Taq 酶 2μ I ；ddH20 36. 5 μ I。
第一轮反应条件为
权利要求
1.一种糖化酶，所述的糖化酶包括 1)氨基酸序列为SEQID NO:1的糖化酶； 2)在I)限定的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖化酶功能的，由I)衍生的蛋白质。
2.用于编码上述糖化酶的基因，其核苷酸序列为SEQID N0:2。
3.一种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的糖化酶。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体包含有权利要求2所述的基因。
5.一种用于表达权利要求1所述的糖化酶的表达宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞携带有权利要求3所述的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的表达宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
全文摘要
本发明提供了一种新型糖化酶及其重组表达工程菌，并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行表达，构建了里氏木霉工程菌株。本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到196U/mL，能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，因此，有望将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。
文档编号C12R1/885GK103013956SQ201210500500
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者黄亦钧, 刘士成, 王华明, 张慧丹 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司