专利名称：一种多克隆位点的人工设计与合成方法
技术领域：
本发明涉及多克隆位点的人工设计与合成方法，具体涉及适用于多种表达载体的多克隆位点(MCS)的合成、克隆与验证。
背景技术：
多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)是包含多个限制性内切酶酶切位点的长度为几十个碱基的DNA序列，也称为多位点接头，是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS序列中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次，在不破坏质粒基本组成结构的基础上，用一种或两种内切酶进行酶切反应，在MCS特定的识别位点形成缺口，以此将外源基因或者序列克隆至表达载体中，对于研究和分析基因功能是必需的。MCS广泛应用于分子克隆和亚克隆工程中，是应用分子生物学、生物工程、分子遗传学等研究的重要实验工具。常用的克隆载体、表达载体等质粒中均含有MCS序列。然而，由于基因结构的复杂性和多样性，在将外源基因插入含有MCS的载体中时，MCS序列包含的酶切位点的种类有时难以满足特定研究需求，导致特定基因功能分析无法顺利进行，形成分子生物学研究领域的瓶颈。因此，迫切需要一种简单有效的MCS序列的人工设计与合成方法，以此满足不同的科研工作需求。
本发明的目的是人工设计并合成一段符合特定需求的MCS序列，将其克隆至表达载体验证其有效性，以此解决大多数外源目的基因编码序列无法插入到一些商业化载体中进行基因功能验证的不足。发明内容
本发明是要解决MCS序列包含的酶切位点的种类有时难以满足特定研究需求，导致特定基因功能分析无法顺利进行的难题，由此提供了一种多克隆位点的人工设计与合成方法。
本发明的一种多克隆位点的人工设计与合成方法按以下步骤实现
一、选择在表达载体及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位点；
_■、将两两酶切位点之间以ATAT喊基结构串联，在串联后的喊基序列两端各添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点后得到序列；
三、在步骤二中的序列两末端再随机添加2飞个GC或AT碱基，然后送至测序公司合成，即完成了多克隆位点的人工设计与合成。
本发明有益效果
本发明设计并合成的多克隆位点序列中的两两酶切位点是由ATAT结构串联，并且在序列两末端添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点后得到满足特定研究需求的序列，并且GC或AT序列为随机添加，以此平衡上下游PCR扩增引物之间的退火温度和GC 含量，便于后续的PCR扩增，基因功能分析顺利进行。
以表达载体Tol2及报告基因EGFP插入序列为例，两端分别添加HinaIII和SalI酶切位点，SalI端再增加6个碱基(GGAACC)形成一段含有HindIII和SalI酶切位点，长度为115bp便于进行PCR扩增的MCS序列。合成的MCS序列中添加的ATAT结构能够防止各不同内切酶对酶切位点的识别错误，同时也防止了较多GC碱基所引起的甲基化作用。GGAACC 序列为随机添加，能够平衡上下游PCR扩增引物之间的退火温度和GC含量，利于后续扩增。 经分子生物学软件Primer premier5. O验证,新引入的序列对序列酶切位点的识别没有影响。图I是试验I中MCS序列的人工合成结果；图2是试验I中表达载体pTol2-EFl a -MCS-EGFP的构建过程；图3是试验I中未注射pTol2-EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内12h后荧光观
察结果；
图4是试验I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内12h后报告基因 EGFP的瞬时表达荧光观察结果；
图5是试验I中未注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内12h后普通可见光观察结果；
图6是试验I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内12h后报告基因 EGFP的瞬时表达普通可见光观察结果；
图7是试验I中未注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内7此后荧光观察结果；
图8是试验I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内72h后报告基因 EGFP的瞬时表达荧光观察结果；
图9是试验I中未注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内72h后普通可见光观察结果；
图10是试验I中注射pTol2_EFl a -MCS-EGFP质粒的斑马鱼体内72h后报告基因 EGFP的瞬时表达普通可见光观察结果。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式中的一种多克隆位点的人工设计与合成方法按以下步骤实现
一、选择在表达载体及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位点；
_■、将两两酶切位点之间以ATAT喊基结构串联，在串联后的喊基序列两端各添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点后得到序列；
三、在步骤二中的序列两末端再随机添加2飞个GC或AT碱基，然后送至测序公司合成，即完成了多克隆位点的人工设计与合成。
本实施方式中合成的MCS序列稀释至浓度为IOOuM备用。
本实施方式效果
本实施方式设计并合成的多克隆位点序列中的两两酶切位点是由ATAT结构串联，并且在序列两末端添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点后得到满足特定研究需4求的序列，并且GC或AT序列为随机添加，以此平衡上下游PCR扩增引物之间的退火温度和 GC含量，便于后续的PCR扩增，基因功能分析顺利进行。
以携带报告基因EGFP的表达载体Tol2为例进行重组载体的构建。新合成的MCS 序列两端分别添加HindIII和SalI酶切位点，SalI端再增加6个碱基(GGAACC)，形成一段含有HindIII和SalI酶切位点、长度为115bp便于进行PCR扩增的MCS序列。合成的MCS 序列中添加的ATAT结构能够防止各不同内切酶对酶切位点的识别错误，同时也防止了较多GC碱基所引起的甲基化作用。GGAACC序列为随机添加，能够平衡上下游PCR扩增弓I物之间的退火温度和GC含量,利于后续扩增。经分子生物学软件Primer premier5. O验证,新弓丨入的序列对序列酶切位点的识别没有影响。
通过以下试验验证本发明有益效果
试验I
以表达载体Tol2及报告基因EGFP插入序列为例，进行MCS的人工合成同时进行验证
一、MCS的人工设计与合成
I.利用Primer premier 5. O软件设计多克隆位点序列，同时设计正向引物Pl与反向引物P2，从酶切位点表中选择在表达载体Tol2及报告基因EGFP插入序列中都不存在的 11 个酶切位点，分别为 HindIII, StuI, Bell、BspEI, PmeI, AscI, Smal/Xmal、PacI、 Haelll、Seal、Sail ；
2.将步骤一中的两两酶切位点之间以ATAT喊基结构串联,在串联后的喊基序列两端各添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点HindIII和SalI ;其中，所述表达载体中存在的酶切位点位于表达载体启动子与终止子之间；
3.在步骤二中的序列两末端随机添加GGAACC碱基，然后送至测序公司合成，由此完成了多克隆位点的人工设计与合成；
其中，所述多克隆位点序列为CCCAAGCTTAT GCATGC ATAT TGATCA ATATTCCGGA ATAT GTTTAAAC ATAT GGCGCGCC ATAT CCCGGG ATAT TTAATTAAATAT GGCC ATAT AGTACT ATAT GTCGACGCGT GGAACC，其序列如Seq ID No: I所示，所述引物序列中正向引物Pl : 5’ -CCCAAGCTTATGCATGCATATTG-3'，反向引物 P2 :5’ -GGTTCCACGCGTCGACATATAGTAC-3'；
二、表达载体pTol2_EFl a -MCS-EGFP (多克隆位点表达载体)的构建
对步骤一中合成的MCS寡核苷酸链利用正反向引物进行PCR扩增，反应体系见表I;PCR 扩增条件为95°C 5min，95°C 30s,55°C 30s,72°C 30s，共 35 个循环，72°C 7min ； 反应结束后，产物进行I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒(TAKARA)切胶回收MCS条带，回收条带与PMD18-T载体连接，反应体系见表2 :16°C水浴连接30min，然后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中(TAKARA)，涂平板，37°C倒置培养过夜。选择经蓝白斑筛选后的阳性克隆进行菌斑PCR反应，反应体系如表3 :PCR扩增条件为95°C 5min，95°C 30s,55°C 30s,72°C 30s，共35个循环，72°C 7min ;反应结束后，I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性克隆摇菌过夜，质粒小量提取试剂盒(TIANGEN)提取质粒，然后送测序公司进行测序，将经测序验证的PMD-18T/MCS质粒与pTol2-EFl a -EGFP质粒利用HindIII和SalI (TAKARA)限制性内切酶分别进行双酶切，反应体系如表4 ;37°C酶切3h，I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化MCS片段，然后将回收的MCS片段与Tol2质粒大片段进行连接反应，反应体系如表5 :16°C水浴连接过夜，次日转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中(TAKARA)，涂 平板，37°C倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行菌斑PCR反应，反应体系如表6 PCR扩增条件 为95°C 5min,95°C 30s、55°C 30s、72°C 30s，共 35 个循环，72°C 7min ;反应结束后，1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测，然后挑取阳性克隆摇菌过夜，质粒小量提取试剂盒(TIANGEN)提取质 粒，送测序公司进行测序。测序结果正确即获得重组的表达载体pTol2-EFl a -MCS-EGFP。表1PCR扩增MCS序列反应体系
成分用量
MCS模板lpL
Jli向引物PIl^iL
反向引物P2l^L
2 X PCR Master Mix12.5卜山
H2O9.5,u L表2PMD-18T/MCS连接反应体系
成分用量
PMD-18T 载体lpL
Ligation Solution I5jxL
回收产物4pL表3PMD-18T/MCS菌液PCR反应体系
成分用量
Master Mix12.5uL
AVM通用引物luL
M13-47通用引物l^iL
H 010.5uL表4PMD-18T/MCS与Tol2双酶切反应体系
rOx八rn曰-
成分用莖
PMD18-MCS 质粒或 Tol2 质粒3pL
Hind XW‘uL
Sail1 uL
10 X K buffer3liL
H2012uL
表5MCS片段与Tol2连接反应体系
权利要求
1.一种多克隆位点的人工设计与合成方法，其特征在于多克隆位点的人工设计与合成方法按以下步骤实现 一、选择在表达载体及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位点； ~■、将两两酶切位点之间以ATAT喊基结构串联，在串联后的喊基序列两端各添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点后得到序列； 三、在步骤ニ中的序列两末端再随机添加2 6个GC或AT碱基，然后送至测序公司合成，即完成了多克隆位点的人工设计与合成。
全文摘要
一种多克隆位点的人工设计与合成方法，本发明涉及多克隆位点的人工设计与合成方法，具体涉及适用于多种表达载体的多克隆位点的合成、克隆与验证。本发明是要解决表达载体含有的MCS序列包含的酶切位点种类有时难以满足特定研究需求，导致特定基因功能分析无法顺利进行的难题。一、选择在表达载体及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位点；二、将两两酶切位点之间以ATAT碱基结构串联，在串联后的碱基序列两端各添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点后得到序列；三、在步骤二中的序列两末端再随机添加2～6个GC或AT碱基，然后送至测序公司合成，即完成了多克隆位点的人工设计与合成。本发明应用于多克隆位点的人工合成领域。
文档编号C12N15/10GK102978197SQ20121049920
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者常玉梅, 李世国, 梁利群, 唐然, 陶然 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所