专利名称：枯草芽孢杆菌hjda32菌株及其所产细菌素的制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体地说是涉及一种枯草芽孢杆菌新菌株及其所产生的可抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌细菌素的制备方法。
背景技术：
食品安全问题是世界范围内的重要课题。目前解决食品安全的主要方法之一是添加化学防腐剂，但长期的研究发现过量食用防腐剂对血压、心脏、肾脏等有不良影响，甚至有些化学防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。热杀菌也是食品加工过程中杀灭微生物的重要方法之一，但对某些低温制品，如低温肉制品，加热温度过高，其色泽、风味会发生明显变化，营养价值也大幅降低。其他物理方法如紫外消毒、过滤除菌、钴60照射法等，对人体无毒害作用，但当包装打开以后，又有再次染菌而腐败的可能。因此，开发广谱、高效、稳定、安全的天然食品防腐剂是食品工业发展的必然趋势。细菌素是由某些细菌通过基因编码、核糖体合成的具有抑菌生物活性的蛋白或肽类。这些物质在达到一定数量时可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的其他微生物；一般产生细菌素的细菌都存在特异性免疫基因，所产细菌素不会对产生菌本身造成伤害。细菌素与临床抗生素在生物合成、作用机制、抑菌谱等方面明显不同，细菌素可以安全、有效地使用以达到控制目标病原微生物生长的目的。由于细菌素具有高效抑菌活性，能被人体降解，不产生耐药性等优点而倍受人们的关注，在食品中有很大的应用潜力。开发新型食品安全的细菌素时首先要考虑的一个十分重要的前提条件是生产菌应具有很好的食品安全性。山西老陈醋的生产至今已有300余年的历史，仍然采用传统的固态自然接种发酵工艺，醋醅中栖息着丰富的微生物资源。从山西老陈醋醋醅中分离筛选产生细菌素的菌株具有很好的食品安全性，可用于开发生产食品防腐剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌新菌株及其所产细菌素的制备方法，枯草芽孢杆菌新菌株及其所产细菌素具有抑菌谱广、抑菌活性高，可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。本发明的目的是通过如下技术方案实现的。一株枯草芽抱杆菌{Bacillus subtil is) HJD A32菌株,于2012年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6624，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株是从山西省清徐老陈醋醋厂新鲜醋醅中分离筛选得到。在牛肉膏蛋白胨基础培养基(牛肉膏0. 5g，蛋白胨lg，NaCl 0. 5g，琼脂1.5g，蒸 馏水lOOmL，pH7. 2-7. 4)上37°C培养48h，呈杆状、单个、成对或成链排列(见
图1)，大小为0. 6 0. 85 ii mX1. 5 3. 5 ii m，有荚膜(见图2)，运动性较弱；幼龄菌培养2_18h，革兰氏染色呈阴性反应；培养19-23h，革兰氏染色呈阴阳性反应；培养24h，革兰氏染色呈阳性反应，菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，光滑，半透明，无色素产生，粘稠，湿润(见图3);在生芽孢培养基(酵母浸膏 0. 7g，蛋白胨 0. lg，葡萄糖 0. lg, (NH4)2SO4 0. 02g, MgSO4 IW2Q 0. 02g, K2HPO40. lg，蒸馏水lOOmL，pH 7. 2_7. 4)上30°C培养72h产生芽孢，芽孢呈椭圆形(见图4);在种子培养及发酵用培养液中培养48h，发酵液清亮、液面有白色膜；经过接触酶、碳源利用试验、明胶水解、淀粉水解、乙醇氧化、乙酸氧化、葡萄糖产酸产气、初始生长PH检测、最适生长温度测定、柠檬酸盐利用、吲哚试验、水溶性色素试验、5%NaCl、7%NaCl试验、溶菌酶试验、M. R、V. P、硝酸盐还原等生理生化鉴定(见表I)和16S rDNA系统发育分析，鉴定该菌株为枯草芽抱杆菌CfeciBw1S subtilis、。表I枯草芽孢杆菌HJD A32的生理生化特性
权利要求
1.一株枯草芽孢杆菌(feci77心subti I is) HJD A32菌株，其特征是已于2012年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6624。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌subtiI is) HJD A32菌株，其特征是所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株是从山西省清徐老陈醋醋厂新鲜醋醅中分离筛选得到，在牛肉膏蛋白胨基础培养基上、37°C条件下培养48h，呈杆状、单个、成对或成链排列，大小为0. 6 0. 85 ii mX1. 5 3. 5 ii m，有荚膜，运动性较弱；幼龄菌培养2_18h，革兰氏染色呈阴性反应；培养19-23h，革兰氏染色呈阴阳性反应；培养24h，革兰氏染色呈阳性反应，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、光滑、半透明、无色素产生、粘稠、湿润状；在生芽孢培养基上、30°C条件下培养72h产生芽孢，芽孢呈椭圆形；在种子培养及发酵用培养液中培养48h，发酵液清亮、液面有白色膜；经过接触酶、碳源利用试验、明胶水解、淀粉水解、乙醇氧化、乙酸氧化、葡萄糖产酸产气、初始生长PH检测、最适生长温度测定、柠檬酸盐利用、吲哚试验、水溶性色素试验、5%NaCl、7%NaCl试验、溶菌酶试验、M. R、V. P、硝酸盐还原等生理生化鉴定和16S rDNA系统发育分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌subtilis\
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubti I is) HJD A32菌株，其特征是所述的牛肉膏蛋白胨基础培养基是由下列质量/体积份的成分组成牛肉膏0. 5份，蛋白胨I份，NaCl 0. 5份，琼脂1. 5份，蒸馏水100份，培养液的PH值为7. 2-7. 4。
4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌mcillussubti I is) HJD A32菌株，其特征是所述的生芽孢培养基是由下列质量/体积份的成分组成酵母浸膏0. 7份，蛋白胨0.1份，葡萄糖 0.1 份，(NH4)2SO4 0. 02 份，MgSO4 7H20 0. 02 份，K2HPO4 0.1 份，蒸馏水 100 份，培养液的PH值为7. 2-7.4。
5.枯草芽孢杆菌HJDA32菌株所产细菌素的制备方法，步骤如下 (1)制备发酵液将枯草芽孢杆菌HJDA32菌株接种到发酵用培养液中，在36-38°C条件下，培养46-48h，得到发酵液； (2)制备细菌素将(I)制备的发酵液经10000r/ m离心15 min后取上清液，在上清液中缓慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80 %，然后在4-5°C条件下静置12 h，再在4-5°C条件下、12000 r/ m、离心30 min，弃去上清液得到细菌素。
6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌HJDA32菌株所产细菌素的制备方法，其特征是所述的发酵用培养液是由下列质量/体积份的成分组成葡萄糖I份，酵母浸膏I份，蒸馏水100份，培养液的PH值为7. 2-7. 4。
7.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌HJDA32菌株所产细菌素的制备方法，其特征是所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素通过牛津杯法试验，该细菌素的活力单位数为256AU/mL，可抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
8.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌HJDA32菌株所产细菌素的制备方法，其特征是所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素是蛋白类抑菌物质。
全文摘要
一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HJDA32菌株于2012年9月25日保藏，保藏号为CGMCCNo.6624，该菌株从山西省清徐老陈醋醋厂新鲜醋醅中分离得到。在牛肉膏蛋白胨基础培养基培养，菌株呈杆状、单个、成对或成链排列，大小为0.6～0.85μm×1.5～3.5μm，有荚膜；在生芽孢培养基上培养产生椭圆形芽孢。经过接触酶、碳源利用试验、明胶水解、淀粉水解、乙醇氧化、乙酸氧化等生理生化鉴定和16SrDNA系统发育分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。用枯草芽孢杆菌HJDA32菌株为生产菌株，用发酵用培养液培养，然后离心、硫酸铵粉盐析、再离心得到细菌素。该细菌素具有抑菌谱广、抑菌活性高，可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。本发明可用于食品防腐剂。
文档编号C12N1/20GK103013861SQ20121050020
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者郝林, 贾丽艳, 段先瑶 申请人:山西农业大学