专利名称：油藏中芽孢杆菌(Bacillus)的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种油藏中芽孢杆菌的检测方法，具体涉及依靠培养的微生物学方法与不依靠培养的分子生物学方法相结合来揭示油藏中Bacillus多样性的方法。
背景技术：
随着油藏中微生物的分离和检测，研究人员发现油藏中同时存在着对原油开采有害和有益的微生物，一些微生物的代谢产物和代谢活性能被用来提高原油采收率。根据这一特点，微生物提高原油采收率(MEOR)作为三次采油的一种重要措施被提出并实施开来。微生物提高原油采收率的主体是功能微生物菌群。根据以往的研究,芽孢杆菌(.Bacillus)是微生物提高原油采收率的一类重要的微生物菌群。芽孢杆菌(feci77m)能产生物表面活性剂降低原油与水以及岩石之间的界面张力，从而提高原油的流动性达到增加原油采收率的目的；芽孢杆菌能降解长链烃减低原油粘度提高原油流动性来增加原油采收率；芽孢杆菌还能产生生物聚合物选择性地堵塞油藏中的大孔道，增加注入水的波及系数从而增加原油采收率。对于微生物提高原油采收率的实验室研究和矿场实验研究而言，研究栖居在油藏中的微生物是发现功能微生物菌群以及设计微生物提高原油采收率矿场试验实施方案的 关键步骤。传统的依靠培养的微生物学方法已被用来分离和鉴定油藏中的微生物，但是这些方法对微生物的富集以及分离过程复杂，大部分情况下，需要配制专一性的培养基，选择专一性的碳原，并且富集过程有时要经过几十轮的培养。另外一个方面，采用传统的微生物学培养方法仅能培养出自然界中很少的一部分微生物(少于l%)(Amann et al.，1995)。因此通过传统微生物学方法仅揭示了油藏中很少的一部分微生物。目前，分子生态学技术为微生物的检测提供了新的方法，被广泛用来研究自然环境中的微生物生态。研究人员也将这些方法用于油藏微生物多样性研究，油藏中检测到大量的不同系统发育类型的微生物种群。然而，综观所有国内外关于油藏微生物多样性研究的报道，出现了一个令人费解的结果，那就是利用不基于培养的分子生态学方法，油藏样品中很少或几乎没有检测到芽孢杆菌{Bacillus、。这些结果给人们一个印象就是油藏样品中芽孢杆菌{Bacillus、很少或油藏中不存在芽孢杆菌当利用分子生态学方法研究环境样品中微生物群落多样性的时候，有两个方面的原因可能造成油藏样品中检测不到芽孢杆菌Ofeci77m)，第一是，芽孢杆菌是一类革兰氏阳性、能形成芽孢的微生物菌群，DNA抽提过程中芽孢的破壁率要比其它微生物小，因此芽孢杆菌在整个分析过程中很可能被忽略；第二，分子生态学方法不能检测到环境样品仅占比例为O. 1%-1%微生物菌群(Head et al.，1998)。芽孢杆菌是一类革兰氏阳性、能形成芽孢、对微生物提高原油采收率有益的功能微生物菌群。利用不基于培养的微生物学方法没有检测到芽孢杆菌OfeCiBm)的油藏是否真的不存在芽孢杆菌？能通过怎样的方法来快速检测油藏样品中的少量芽孢杆菌菌群是目前研究人员所面临的难题。
发明内容
本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种油藏中芽孢杆M(Mcillus)的快速检测方法，它将传统的微生物学和分子生物学的优点相结合，提成了一种快速检测油藏中的芽孢杆菌方法。本发明所述的方法能有效地检测油藏中的芽孢杆菌Ofeci77M)，为油藏中采用功能芽孢杆菌的发现，以及油藏中芽孢杆菌(Mcillus )的生态学研究提供了新的可行方法。为解决上述问题，本发明采用如下技术方案
本发明提供了一种油藏中芽孢杆菌的快速检测方法，所述方法包括下列步
骤
(1)油藏样品的采集；
(2)通过高温灭活样品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；
(3)收集灭活后样品中的牙抱；
(4)将收集的芽孢接种于培养基、在油藏原位温度条件下对芽孢菌进行复活培养；
(5)通过分子生物学方法检测复活的芽孢菌菌群。本发明所述油藏为不同地质条件、不同开采方法的各类油藏。本发明的油减样品包括注水井井口样品，油井井口样品，地层水样品，油井返排样品以及岩芯样品。油藏样品的采集步骤为将采集的油藏样品装入已灭菌的样品瓶中，装满样品瓶，密封，记录样品采集的油藏原位温度。通过高温灭活样品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物步骤为，在无菌条件下取500ml的油藏样品到无菌烧瓶中，烧瓶口覆盖上有透气孔的无菌微生物培养膜；将烧瓶加热，保持沸腾10分钟，室温冷却。收集灭活后样品中的芽孢步骤具体操作为待烧瓶中样品冷却后，在无菌条件下将烧瓶中的样品转移到多个50ml的无菌离心管中，IOOOOg离心力离心15分钟，在无菌条件下将上清液转移到一个干净的无菌容器中保存为待用上清液；
然后在每个离心管中加入Iml的无菌水、重悬浮离心管底部收集到的沉淀物，将所有离心管中的重悬浮液收集到一起成为IOml的混合液；混合液中包含有芽孢。将收集的芽孢接种于培养基、在油藏原位温度条件下对芽孢菌进行复活培养步骤具体为将收集到的IOml的混合液作为种子，在无菌条件下接种到装有30ml培养基的IOOml培养瓶中，密封瓶口，在样品采集的油藏原位温度10°C -110°C条件下，摇菌(150rmp)对芽孢菌进行复活培养7-15天，得复活培养液；
所述的培养基是指与微生物原来生长环境相匹配，并能为芽孢复活提供营养物的培养基，培养基成分为糖蜜2g, (NH4)2HPO4 O. 16g，KNO3 O. 2g，用待用上清液配制并定容到100ml，加入原油2g;121°C灭菌20分钟高压蒸汽灭菌，原油来自样品采集油藏。通过分子生物学方法检测复活的芽孢菌菌群步骤具体操作为在无菌条件下吸取5ml复活培养液于离心管中，IOOOOg离心力离心10分钟，移除上清，在离心管中加入Iml无菌水，重悬浮离心管底沉淀；
通过DNA试剂盒FastDNA Spin Kit for Soil来抽提重悬浮液中的DNA，构建16S rDNA克隆文库，基因测序以及微生物系统发育分析来完成对芽孢杆菌的检测和分析。油田中大部分芽孢杆菌(ifeci77M)由于其形成芽孢的特性和检测方法的不足而被忽视，本发明将传统的微生物学和分子生物学的优点相结合，提出了一种快速检测油藏中的芽孢杆菌的方法。本发明所述的方法能有效地检测油藏中的芽孢杆菌为油藏中采用功能芽孢杆菌的发现，以及油藏中芽孢杆菌(.Bacillus)的生态学研究提供了新的可行方法。
图I为实施例I收集得到的某个芽孢的透射电镜照片。
具体实施例方式不同的油藏原位温度不同，本发明选取了 4个不同原位温度的油藏，每个油藏中取了注水井以及油井样品。同时还选取了一个聚合物驱后油藏，取注水井以及油井样品。所有实例中的样品的共同特点是，在没有经过本专利方法处理过的样品中，没有检测到芽孢杆菌Ofeci77m)。根据本专利中的方法对上述样品进行处理，通过多个实例来证明本发明中的方法的可行性。实施例I 低温油藏中芽孢杆菌iBacillus )检测
从新疆油田低温No. 6油藏(25°C)分别采集了注水井T6186和油井T6073的井口样品。以前研究报道表明，通过分子生态学方法，两个原始样品中没有检测到芽孢杆菌{Bacillus')。对该实例中的两个样品进行处理，具体检测步骤为
I、油藏样品的采集将采集的油藏样品装入已灭菌的样品瓶中，装满样品瓶，密封，记录样品采集的油藏原位温度25°C。然后以最快速度运输到实验室进行实验。2、通过高温灭活样品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物在无菌条件下取500ml的油藏样品到一个2L的无菌烧瓶中，烧瓶口覆盖上有透气孔的无菌微生物培养膜。将烧瓶放置在铺有石棉网的电加热炉加热，保持沸腾10分钟后关掉电炉室温冷却。3、收集灭活后样品中的芽孢待烧瓶中样品冷却后，在无菌条件下将烧瓶中的样品转移到多个50ml的无菌离心管中，IOOOOg离心力离心15分钟，在无菌条件下将上清液转移到一个干净的无菌容器中保存为待用上清液；
然后在每个离心管中加入Iml的无菌水、重悬浮离心管底部收集到的沉淀物，将所有离心管中的重悬浮液收集到一起成为IOml的混合液；混合液中包含有芽孢。收集得到的某个芽孢的透射电镜照片见图I。4、将收集的芽孢接种于培养基、在油藏原位温度条件下对芽孢菌进行复活将收集到的IOml的混合液作为种子，在无菌条件下接种到装有30ml培养基的IOOml培养瓶中，密封瓶口，在样品采集的油藏原位温度25°C条件下，摇菌(150rmp)对芽孢菌进行复活培养7天，得复活培养液；
所述的培养基是指与微生物原来生长环境相匹配，并能为芽孢复活提供营养物的培养基，培养基成分为糖蜜2g, (NH4)2HPO4 O. 16g，KNO3 O. 2g，用待用上清液配制并定容到100ml,加入原油2g ; 121/C灭菌20分钟高压蒸汽灭菌,原油来自No. 6油藏。5、通过分子生物学方法检测复活的芽孢菌菌群在无菌条件下吸取5ml复活培养液于离心管中，IOOOOg离心力离心10分钟，移除上清，在离心管中加入Iml无菌水，重悬浮离心管底沉淀；
通过DNA试剂盒FastDNA Spin Kit for Soil来抽提重悬浮液中的DNA，构建16S rDNA克隆文库，基因测序以及微生物系统发育分析来完成对芽孢杆菌的检测和分析。
两个样品中均检测到了芽孢杆菌(Mcillus )。得到了两个芽孢杆菌(MeiciIIus)16S rRNA基因克隆文库(N6PB和N6IB)。N6ro和N6IB克隆文库中分别有5个和6个芽孢杆菌系统发育类型(表I和表2)。在N6PB克隆文库中98. 8%的序列被鉴定为芽孢杆菌Uaci77m)，其中sp.为该样品中的优势芽孢杆菌；在N6IB克隆文库中95. 4%的序列被鉴定为芽孢杆菌(ifeci77i/5·),其中Bacillus flexus为该样品中的优势芽孢杆菌。表I根据本专利方法油井T6073样品中检测到的芽孢杆菌(MciIIus)
权利要求
1.一种油藏中芽孢杆菌(Mcillus)的快速检测方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤 (1)油藏样品的采集； (2)通过高温灭活样品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物； (3)收集灭活后样品中的牙抱； (4)将收集的芽孢接种于培养基、在油藏原位温度条件下对芽孢菌进行复活培养； (5)通过分子生物学方法检测复活的芽孢菌菌群。
2.如权利要求I所述的油藏中芽孢杆菌OfeciBm)的快速检测方法，其特征在于，所述油藏为不同地质条件、不同开采方法的各类油藏。
3.如权利要求2所述的油藏中芽孢杆菌OfeciBm)的快速检测方法，其特征在于，油减样品包括注水井井口样品，油井井口样品，地层水样品，油井返排样品以及岩芯样品。
4.如权利要求3所述的油藏中芽孢杆菌OfeciBm)的快速检测方法，其特征在于，油藏样品的采集步骤为将采集的油藏样品装入已灭菌的样品瓶中，装满样品瓶，密封，记录样品采集的油藏原位温度。
5.如权利要求4所述的油藏中芽孢杆菌的快速检测方法，其特征在于，通过高温灭活样品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物步骤为，在无菌条件下取500ml的油藏样品到无菌烧瓶中，烧瓶口覆盖上有透气孔的无菌微生物培养膜；将烧瓶加热，保持沸腾10分钟，室温冷却。
6.如权利要求5所述的油藏中芽孢杆菌(ifeci77M)的快速检测方法，其特征在于，收集灭活后样品中的芽孢步骤具体操作为待烧瓶中样品冷却后，在无菌条件下将烧瓶中的样品转移到多个50ml的无菌离心管中，IOOOOg离心力离心15分钟，在无菌条件下将上清液转移到一个干净的无菌容器中保存为待用上清液； 然后在每个离心管中加入Iml的无菌水、重悬浮离心管底部收集到的沉淀物，将所有离心管中的重悬浮液收集到一起成为IOml的混合液；混合液中包含有芽孢。
7.如权利要求6所述的油藏中芽孢杆菌OfeciBm)的快速检测方法，其特征在于，将收集的芽孢接种于培养基、在油藏原位温度条件下对芽孢菌进行复活培养步骤具体为将收集到的IOml的混合液作为种子，在无菌条件下接种到装有30ml培养基的IOOml培养瓶中，密封瓶口，在样品采集的油藏原位温度10°C -110°C条件下，摇菌(150rmp)对芽孢菌进行复活培养7-15天，得复活培养液； 所述的培养基是指与微生物原来生长环境相匹配，并能为芽孢复活提供营养物的培养基，培养基成分为糖蜜2g, (NH4) 2HP04 O. 16g，KN03 O. 2g，用待用上清液配制并定容到100ml，加入原油2g;121°C灭菌20分钟高压蒸汽灭菌，原油来自样品采集油藏。
8.如权利要求7所述的油藏中芽孢杆菌的快速检测方法，其特征在于，通过分子生物学方法检测复活的芽孢菌菌群步骤具体操作为在无菌条件下吸取5ml复活培养液于离心管中，IOOOOg离心力离心10分钟，移除上清，在离心管中加入Iml无菌水，重悬浮离心管底沉淀； 通过DNA试剂盒FastDNA Spin Kit for Soil来抽提重悬浮液中的DNA，构建16S rDNA克隆文库，基因测序以及微生物系统发育分析来完成对芽孢杆菌的检测和分析。
全文摘要
本发明公开了一种油藏中芽孢杆菌(Bacillus)的快速检测方法，所述方法包括下列步骤(1)油藏样品的采集；(2)通过高温灭活样品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；(3)收集灭活后样品中的芽孢；(4)将收集的芽孢接种于培养基，在油藏原位温度条件下对芽孢菌进行复活培养；(5)通过分子生物学方法检测复活的芽孢菌菌群。本发明所述的方法能有效地检测油藏中的芽孢杆菌(Bacillus)，为油藏中采用功能芽孢杆菌(Bacillus)的发现，以及油藏中芽孢杆菌(Bacillus)的生态学研究提供了一种新的可行方法。
文档编号C12Q1/68GK102936630SQ201210499739
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者张凡, 佘跃惠, 侯读杰, 柴陆军 申请人:中国地质大学(北京)