专利名称：几丁质酶chi-x及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种几丁质酶CH1-X及其编码基因与应用。
背景技术：
几丁质酶(EC. 3. 2.1. 14)是一类能催化水解至少含有一个N-乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，几丁质酶能水解几丁质生成几丁寡糖、几丁二糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖等。根据其作用位点和酶解产物，可把几丁质酶分为外切几丁质酶(exochitinase)和内切几丁质酶(endochitinase)。内切几丁质酶从几丁质链的任一部位切割，产生几丁质寡聚糖，如Glc(NAG)2, Glc(NAG)3等；外切几丁质酶一般又分为几丁二糖酶(EC. 3. 2.1. 29)和N-乙酰基葡萄糖苷酶(EC. 3. 2.1. 30)，几丁二糖酶作用于几丁质长链的非还原端端部，水解几丁质生成N-乙酰葡萄糖胺二聚体G1c(NAG)2。几丁质酶根据其氨基酸序列特征可分成6类，1、
I1、IV型归于糖基化水解酶的第19家族，主要存在于植物中；II1、V型归于第18家族，广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物中，其氨基酸序列与19家族缺乏同源性，而N-乙酰葡萄糖胺酶被归于第20家族。目前发现，自然界中的很多微生物能够合成几丁质酶，从而降解几丁质，产生N-乙酰胺基葡萄糖及几丁寡糖等利用价值较高的衍生物，具有巨大的发展前景。科技的进步为研究利用几丁质提供了越来越多的方法，对几丁质的研究不断加深，范围不断拓广。作为效率高、控制性强且对环境友好的生物酶法处理几丁质将是现代几丁质产业的发展方向。几丁质资源很丰富，其水解产物应用也十分广泛，但因没有有效的几丁质处理手段而受到极大的限制，作为几丁质工业发展方向的酶法，目前因为几丁质酶活力较低还不能满足工业化生产的需要。因此，发现具有高活力、符合现代生物工程要求的几丁质酶是一项非常有意义的工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种几丁质酶CH1-X及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白CH1-X,来自朽1檬酸杆菌(Citrobacter sp.),具有几丁质酶功能，为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白质。为了使(a)或(b)中的蛋白CH1-X便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述的编码基因。
3.根据权利要求2所述基因，其特征在于所述基因为如下I)或2)或3)的DNA分子 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有几丁质酶活性的蛋白的DNA分子; 3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有几丁质酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将所述基因插入载体pET_28a(+)的多克隆位点得到的。
6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
7.权利要求1所述蛋白在降解几丁质或制备几丁质酶中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述几丁质为胶体几丁质。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述降解的pH值为2.O— 11.0，或3.0—10. O,或 3. 0—9. O,或 3. 0—8. O,或 3. 0—4. O,或 4. 0—8. O,或 4. 0—7. O,或 4. O—6.0，或 4. O—5. O ο
10.根据权利要求7—9中任一所述的应用，其特征在于所述降解的温度为O — 80°C，或 20— 70°C，或 30— 70°C，或 40— 70°C，或 50— 70°C，或 50— 60°C，或 60— 70V。
全文摘要
本发明公开了一种几丁质酶CHI-X及其编码基因与应用。所述蛋白CHI-X是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白CHI-X在作为几丁质酶时具有如下优点可以采用较高的反应温度；具有良好的热稳定性；可以在酸性条件下作用；具有良好的pH稳定性。本发明对现代几丁质产业发展具有重要意义。
文档编号C12N15/56GK103013957SQ201210510998
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者周志刚, 许洁, 杨雅麟, 梁凉, 徐俐, 何夙旭, 于会民, 艾春香 申请人:中国农业科学院饲料研究所, 北京正坤博达生物饲料有限公司