专利名称：产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程菌株及其构建方法。
背景技术：
成骨生长肽(OGP)具有促进体外成骨细胞增殖、体内成骨及刺激造血等功能，可促进骨折愈合，预防骨质疏松。由14个氨基酸小肽组成，并且其氨基酸序列与组蛋白H4的C末端完全一致，与小鼠T细胞受体β链V区部分同源，对于骨折的愈合，骨质疏松症，急、慢性贫血病的预防和治疗及其在肿瘤放、化疗过程中刺激骨髓细胞造血的作用，已经得到高度的重视和肯定。降钙素基因相关肽(CalcitoninGene Related p印tide, CGRP)是在 1983 年由Rosenfeld等首次应用DNA基因重组和分子生物技术研究发现的第一个活性多肽，由37种氨基酸组成，其分子量约为3800道尔顿，它与降钙素基因同源，其中含有五个内含子和六个外显子，为内源性扩血管肽类物质，可以治疗心肌缺血。然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产OGP-CGRP融合蛋白，OGP-CGRP融合蛋白具有治疗骨质疏松症和心肌缺血、治疗闻血压等多重作用。本发明产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白0GP/CGRP 基因。所述融合蛋白0GP/CGRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。上述产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、在OGP和CGRP基因内设计一个Kpn I酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示的融合蛋白0GP/CGRP基因，并在融合蛋白0GP/CGRP基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (0GP/CGRP)载体；二、将步骤一获得的pUC (0GP/CGRP)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白0GP/CGRP基因重组表达载体 pGEX- 0GP/CGRP ；三、然后将载体pGEX- 0GP/CGRP转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，随机挑取转化菌于37 °C过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌 BL21 (DE3- 0GP/CGRP)。本发明的有益效果本发明基因工程菌株可以生产OGP-CGRP融合蛋白，成骨生长肽与降钙素基因相关肽间作用互补且协同增效，OGP-CGRP融合蛋白具有治疗骨质疏松症和心肌缺血双重作用。本发明基因工程菌株生产的成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为39%。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白0GP/CGRP基因。
具体实施方式
二具体实施方式
一所述融合蛋白0GP/CGRP基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。
具体实施方式
三具体实施方式
一所述产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、在OGP和CGRP基因内设计一个Kpn I酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示的融合蛋白0GP/CGRP基因，并在融合蛋白0GP/CGRP基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (0GP/CGRP)载体；二、将步骤一获得的pUC (0GP/CGRP)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白0GP/CGRP基因重组表达载体 pGEX- 0GP/CGRP ；三、然后将载体pGEX- 0GP/CGRP转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，随机挑取转化菌于37°C过夜培养，采用质粒提取试剂盒(购买自北京艾德莱生物科技有限公司)提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用空白质粒pGEX_6P_l作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌BL21 (DE3- 0GP/CGRP);其中大肠杆菌BL21(DE3)为购买得到。本实施方式步骤二中pUC (0GP/CGRP)载体用BamHI和EcoR I双酶切的体系如
下
成分用量
pUC (OGP/CGRP)载体20.uL
IOxMbuffer6μ
及,"/HI3μ
KcoR I3μΙ
(IdH2O2SμL酶切反应条件37°C水浴，10h。本实施方式步骤二中表达载体pGEX-6P-l双酶切的体系如下成分用量
pGEX- Ρ-Ι20μ
IOxMbuflfer6μ
Bamhll3μ
EcoR I3μΙ
ddH2028μ 酶切反应条件37°C水浴，IOh0本实施方式步骤二中连接反应体系如下
成分用量
目的基因OGP/CGRP13μL
酶切后pGEX-6P-1载体3 μ L
Τ4 DNA连接酶2μ
!0χΤ4 DNA 迮接lW buffe2μΙ连接反应条件16°C水浴，8 12h。所述T4 DNA连接酶，购买自TaKaRa公司。将本实施方式获得的重组菌BL21 (DE3- 0GP/CGRP)置于LB培养基于28°C培养15h，然后采用GST标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，获得成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白。本实施方式融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为39%。为验证本实施方式基因工程菌株所产融合蛋白的效果，进行以下实验 (一)OGP-CGRP融合蛋白治疗骨质疏松实验取雌性SD大鼠48只，40只无菌条件下摘除双侧卵巢，其中8只假手术对照组切除双侧一小块脂肪。12周后取造模组存活健康大鼠40只，随机分为5组，每组8只。假手术对照组取8只，共计5组，分别口服以下药物假手术对照组0. 5% CMC-Na溶液5ml/kg ;模型对照组0. 5% CMC-Na溶液5ml/kg。阳性对照组阿仑膦酸钠(Alen) 5mg/kg ;实验I组O. 5% OGP蛋白溶液5ml/kg ;实验2组0. 5% OGP-CGRP融合蛋白溶液5ml/kg。连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压为20kV。观察结果见表1，结果表明，阳性对照组、实验I组和实验2组与阴性对照组相比虽然都有治疗骨质疏松的作用，但是OGP-CGRP融合蛋白的治疗效果最佳，且比单独服用OGP蛋白溶液的效果有显著提高，说明OGP和CGRP融合可以增强成骨生长肽(OGP)的作用。表I骨小梁宽度的比较和骨面积(X土SD)
权利要求
1.产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白OGP/CGRP基因。
2.根据权利要求I所述的产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株，其特征在于所述融合蛋白OGP/CGRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。
3.如权利要求I所述的产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行 一、在OGP和CGRP基因内设计一个KpnI酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的融合蛋白0GP/CGRP基因，并在融合蛋白0GP/CGRP基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在PUC57载体上，获得pUC (0GP/CGRP)载体； 二、将步骤一获得的pUC(OGP/CGRP)载体用BamHI和EcoRI双酶切，再与同样经BamHI 和EcoR I双酶切的表达载体pGEX-6P-l连接，获得融合蛋白0GP/CGRP基因重组表达载体pGEX- 0GP/CGRP ； 三、然后将载体PGEX-0GP/CGRP转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，随机挑取转化菌于37 °C过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌 BL21 (DE3- 0GP/CGRP)。
4.根据权利要求3所述的产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中pUC (0GP/CGRP)载体用BamHI和EcoR I双酶切的体系如下成分用量 pUC (0GP/CGRP)载体20μ IOxMbuffer6,uLBam\\\3μKcoR I ddH2028 μ L 酶切反应条件37°C水浴，IOh0
5.根据权利要求3所述的产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中表达载体PGEX-6P-1双酶切的体系如下成分用量pGEX-6P-120μ IOxM buffer6μ BamH\3μΙ_, KcoR I3 μ ι, ddH2028μ 酶切反应条件37°C水浴，IOh0
6.根据权利要求3所述的产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中连接反应体系如下成分用量目的基因OGP/CGRP13μ 酶切后pGEX-6P-1载体3 μ Τ4 DNA连接酶2μ 10χΤ4 DNA 迕接1 : buffer2μΙ 连接反应条件16°C水浴，8 12h。
全文摘要
产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，涉及一种基因工程菌株及其构建方法。本发明的目的在于提供一种产成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产OGP-CGRP融合蛋白，该融合蛋白具有治疗骨质疏松症和心肌缺血双重作用。该基因工程菌株含有融合蛋白OGP/CGRP基因。方法一、融合蛋白OGP/CGRP基因的合成；二、重组表达载体的构建；三、将重组表达载体转化到大肠杆菌中，随机挑取转化菌，提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。本发明由于生产具有治疗骨质疏松症和心肌缺血双重作用的OGP-CGRP融合蛋白。
文档编号C12N15/70GK102965326SQ201210534878
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学