专利名称：msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。
背景技术：
老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织(WHO)的标准，美国国家健康和营养调查(NHANES III，1988 1994年)结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7. 1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到2. 21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者 对1995 1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。肥胖与骨量关系临床观察表明，肥胖与骨密度(BMD)提高有关。肥胖是骨量的保护因素，超重和肥胖的妇女绝经后较同龄非超重妇女骨量高且骨丢失较慢。体重下降是绝经早期骨丢失的危险因素，提高体重指数可减缓绝经后骨丢失。但肥胖也常常引发高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎，是很多疾病的诱因之一。
发明内容
本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷，而提供的一种msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株。msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/Obese’),大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/0bese’)按以下步骤制备一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/Obese’ )用BamHI和EcoR I双酶切，获得msCT-rhL印tin融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-rhLeptin融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’ ；四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21 (DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/0bese’)。本发明中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。本发明中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明msCT-rhLeptin融合蛋白采用人为改造的Leptin和鲑鱼降I丐素基因编码翻译而成。具有降低使用者体重，并防治骨质疏松的效果。
本发明用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白微生物制剂,不产生拮抗反应，使用安全。本发明msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3_msCT/0bese’ )发酵产生的msCT-rhLeptin融合蛋白共70个氨基酸。本发明采用生物基因工程手段获得大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/0bese，)。采用本发明基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/Obese’)可大规模发酵生产msCT-rhLeptin融合蛋白，具有广泛应用前景。本发明为治疗骨质疏松和肥胖奠定了物质基础。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌 BL21 (DE3-msCT/0bese，)，大肠杆菌 BL21 (DE3_msCT/0bese’ )按以下步骤制备一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/Obese’ )用BamHI和EcoR I双酶切，获得msCT-rhL印tin融合蛋白的DAN片段(msCT/Obese，)；二、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-rhLeptin融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’ ；四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21 (DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/0bese’)。 本实施方式步骤四采用电击转化法转化大肠杆菌BL21 (DE3 )。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤一中质粒载体pUC (msCT/Obese’ )酶切反应体系为
pUC (msCT/Obese，)20 μ
IOXM buffer6μ1
"讓 HI3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。其他步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二的不同点在于步骤三中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为
载体 pGEX-6P-l20 μ
10ΧΜ buffer6μ1
BamHl3μ1
KcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
其他步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一、二或三的不同点在于步骤二中酶连接反应体系为
双酶切的载体PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段13μ1
Ι0ΧΤ4 DNA 迕接lW buffer2μ1
Τ4 DNA连接酶2μ1。其他步骤及参数与具体实施方式
一、二或三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一的不同点在于步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。其他步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。本实施方式msCT-rhL印tin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC (msCT/Obese’)。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一的不同点在于步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。其他步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌 BL21 (DE3-msCT/0bese，)，大肠杆菌 BL21 (DE3_msCT/0bese’ )按以下步骤制备一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/Obese’ )用BamHI和EcoR I双酶切，获得msCT-rhL印tin融合蛋白的DAN片段(msCT/Obese，)；二、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-rhLeptin融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’ ；四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21 (DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/0bese’ )；其中步骤一中质粒载体pUC (msCT/Obese’ )酶切反应体系为
P LJC (msCT/Obese，)20 μ
10ΧΜ buffer6μ1
BamHX3μ1
KcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1 ；其中步骤三中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为载体 pGEX-6P-l20 μΙ
IOXM buffer6μ1
BamHl.3μ1
KcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1 ；其中步骤二中酶连接反应体系为
双酶切的载体PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段13μ1
IO X Τ4 DN A 迮接 1 buffer2μ1
Τ4 DNA连接酶2μ1。其中步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示；步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本实施方式中msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC (msCT/Obese’)。本实施方式在构建msCT-rhL印tin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/0bese，)时改变了天然鲑鱼降I丐素(salmon calcitonin, sCT)的基因和瘦素(Leptin)的基因，而且在msCT和Obese’之间插入Kpn I酶切位点，既可以提高所编码融合蛋白的稳定性，同时也改变融合蛋白的二级结构，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoR I酶切位点，而且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点，重新设计了融合基因编码碱基序列。载体pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位点，本实施方式合成的pGEXusCT/Obese’均能为Kpn I单酶切开,说明本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白成功导入质粒pGEX-6P-l中。然后将质粒pGEX-msCT/Obese’导入大肠杆菌BL21 (DE3)中，选取阳性克隆。随机挑取阳性克隆大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/0bese’)菌落37°C过夜培养，提取质DNA，用Kpn I进行单酶切，并用相应的空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/0bese,>内含有SEQ ID NO 1所示DNA。将大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/0bese，)置于LB培养基28°C环境条件下培养15h，然后采用GST标签融合蛋白纯化方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治疗骨质疏松和肥胖的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为39%。利用本实施方式大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/0bese’)发酵获得的msCT-rhLeptin融合蛋白进行试验msCT-rhLeptin融合蛋白治疗骨质疏松实验取雌性SD大鼠，无菌条件下摘除双侧卵巢，其中阴性对照组切除双侧一小块脂肪。5天后取存活健康大鼠48只，随机分为6组，每组8只，分别口服以下药物模型组质量浓度为0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；阴性对照组质量浓度为0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；实验组质量浓度为0. 5%的msCT-rhL印tin融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；(获得的用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白用无菌水溶液溶解)阳性对照组I :阿仑膦酸钠(Alen) 5mg/kg。阳性对照组2 :质量浓度为O. 5%的msCT蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。阳性对照组3 :质量浓度为O. 5%的rhL印tin溶液，灌胃剂量为5ml/kg。连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表1，结果表明阳性对照组I、阳性对照组2、阳性对照组3和实验组都具有治疗骨质疏松的作用，且实验组的效果最好。表I骨小梁宽度的比较和骨面积(X土SD)
权利要求
1.msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株,其特征在于msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/0bese，)，大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/0bese’ )按以下步骤制备 一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC(msCT/Obese’)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-rhL印tin融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ； 三、msCT-rhL印tin融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’ ； 四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21(DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/0bese’)。
2.根据权利要求I所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中质粒载体pUC (msCT/Obese’ )酶切反应体系为 pUC (msCT/Obese，)20 μ IOXM buffer6μ1 BamHX3 μ! Ecoli I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH20 28μ1。
3.根据权利要求I所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株,其特征在于步骤三中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为 载体 pGEX-6P-l20 μ IOXM buffer6μ1 BamHX3μ1 KcoIi I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH20 28μ1。
4.根据权利要求I所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株,其特征在于步骤二中酶连接反应体系为 双酶切的载体PGEX-6P-13 μ 融合蛋白的DNA片段Ι3μ1IO X Τ4 DNA 迕接lW butter2μ1Τ4 DNA连接酶2μ1。
5.根据权利要求I所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株,其特征在于步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。
6.根据权利要求5所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株,其特征在于步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
全文摘要
msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，它涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷。msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3-msCT/Obese’)按以下步骤制备一、获得融合蛋白DAN片段；二、双酶切质粒；三、酶连接；四、转化大肠杆菌BL21。本发明可用于医药制备领域。
文档编号C12N1/21GK102965327SQ201210534879
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学