一种脂肪酶突变体及其用途
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，涉及一种脂肪酶突变体及其用途，该突变体是由野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B（CALB）出发经过突变得到的，具体涉及一种脂肪酶突变体和其制备方法以及利用该脂肪酶突变体通过催化布洛芬类化合物的酯衍生物水解，动力学拆分得到具有光学活性的S构型布洛芬类化合物的方法。本发明中，野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B通过突变得到具有改良性质的脂肪酶，该酶在毕氏酵母工程菌中表达，该脂肪酶包括与SEQ?ID?NO.02至少85%同一性的氨基酸序列，并且具有对应于SEQ?ID?NO.02的189位残基为芳香族氨基酸残基，对应于SEQ?ID?NO.2的190位残基为非极性氨基酸残基。本发明通过对南极假丝酵母菌脂肪酶B进行突变，提高了其对布洛芬类化合物的对映选择性。
【专利说明】一种脂肪酶突变体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，涉及一种脂肪酶突变体及其用途，该突变体是由野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B (CALB)出发经过突变得到的，具体涉及一种脂肪酶突变体和其制备方法以及利用该脂肪酶突变体通过催化布洛芬类化合物的酯衍生物水解，动力学拆分得到具有光学活性的^构型布洛芬类化合物的方法。
【背景技术】
[0002]脂肪酶，即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯。脂肪酶通常被用于在水相体系中催化酯类化合物的水解反应，在非水相体系中催化醇类化合物的酯化、转酯反应化，在非水相体系中催化氨酰化反应等。iGurrent Opinion in Chemical Biology 2002,
6,145-150.)
南极假丝酵母(Candida antarctica)首先是在南极洲分离得到的，该南极假丝酵母可以产生两种性质完全不同的脂肪酶，分别为南极假丝酵母脂肪酶A (CALA)和脂肪酶B(CALB)ο Patkar等人1993年成功分离纯化分别得到了 CALA和CALB (.1ndian.J.Chem.1993 32B.76-80)。1994年，Uppenberg等研究出CALB自由酶的三维立体结构和氨基酸顺序(SiiT/citfre 1994，2，293-308)，发现CALB由317个氨基酸残基组成，分子量为33kD，与其它脂肪酶的氨基酸序列对比发现它们之间没有明显的同源性。1995年CALB被成功克隆并在米曲霉oryzae) {Canadian Journal of Botany 1995, 73,869-875.)中得到表达，该专利为诺和诺德公司所拥有。为了进一步研究CALB的性质及提高产量，CALB又陆续在许多种宿主中被克隆表达，如毕赤酵母G0ZcAi aAasioris)，酿酒酵母 iSacclmromyces cerevisiae)和大肠杆菌Cb7i)等。CALB 对水溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活性，是用于许多反应的催化剂，并且被用于例如立体选择性转化和聚酯合成，特别是对于仲醇的高对映选择性使得CALB目前在生物技术的使用中成为最重要的酶。
[0003]天然的CALB仍存在一定的缺陷，如热稳定性较差产量较低等，使其在生产实践中的应用受到一定限制，成功修饰和改造CALB使其具有更加良好的性质是一个研究的热点。2005年Magnusson等人在Trpl04处引入点突变，Trpl04Ala突变株对4-庚醇和5-壬醇的特异性比野生型酶分别提高了 270倍和5500倍2005, 6，1051-1056.)。2009年Seo等将CALB分别与苹果酸脱氢酶、亚精胺腐胺周质结合蛋白质和肽基脯氨酰顺反异构酶进行融合并在大肠杆菌中表达，融合表达的CALB溶解性得到大大提高，从而增加了其表达量(BBA- Proteins & Proteomics 2009, 1794, 519-525.)。
[0004]布洛芬类化合物(piOfens)是一类重要的药物，主要用于治疗疼痛、发烧、炎症等，是非留体类抗炎药物(NSAIDs)中重要的一类。这类药物临床已广泛应用包括萘普生、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬等(图1)。布洛芬类药物的α位含有一个手性碳原子，存在一对光学异构体，尽管目前布洛芬类药物以消旋形式存在，旦其中S构型布洛芬具有明显较高的临床效果。
[0005]利用生物催化方法合成布洛芬类化合物可通过多种生物催化剂催化的反应如水解、酯化、氧化、还原等反应来进行，其中通过脂肪酶催化的动力学拆分反应来制备光学纯的布洛芬类化合物便是可行路线之一，如脂肪酶通过水解或醇解羧酸酯、酯化羧酸等反应来拆分已有相关报导(Crem泛挪，2011，13，2607.)，但是南极假丝酵母脂肪酶B对布洛芬类化合物的酯衍生物几乎没有或仅有很低的对映选择性MicrobTech, 2006, 39, 924; J Org Chem, 1994, 59, 4410; Bi o techno I Bi oeng, 2001, 75,559.)，这就的需要对现有的方法路线进行改进，以提高脂肪酶对布洛芬类化合物的对映选择性至理想水平。
【发明内容】
[0006]本发明的技术方案如下:通过对南极假丝酵母菌脂肪酶B进行突变，提高其对布洛芬类化合物的对映选择性，使通过脂肪酶动力学拆分路线高效、可行。
[0007]本发明由野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B {Candida antarctica lipase B)基因(SEQ ID N0.1)通过突变得到具有改良性质的脂肪酶，该酶在毕氏酵母工程菌中表达，该脂肪酶突变体，能够将布洛芬类化合物的酯衍生物水解，动力学拆分得到具有光学活性的S构型布洛芬类化合物(图2)。在本发明的实施方案中，该脂肪酶与天然存在的CALB野生型相比，在将底物水解为产物方面具有一个或多个改善的性质。其能够以SEQ ID N0.02蛋白质(南极假丝酵母脂肪酶B, Candida antarctic lipase B,缩写为CALB)的至少1.5倍活性将布洛芬类化合物的酯衍生物水解为至少70%对映体过量的S构型的布洛芬类化合物。
[0008]在进一方面，该重组脂肪酶包括与SEQ ID N0.02至少85%同一性的氨基酸序列，并且具有对应于SEQ ID N0.02的189位残基为芳香族氨基酸残基，对应于SEQ ID N0.2的190位残基为非极性氨基酸残基，这些氨基酸突变对于改善脂肪酶的活性剂对映选择性至关重要。
[0009]在进一方面，所述脂肪酶突变体包含以下一项或多项突变，39残基位为非极性氨基酸残基；40位残基为非极性氨基酸残基；138位残基为极性不带电荷氨基酸残基；139位残基为极性不带电荷氨基酸残基；152位残基为极性带正电荷的氨基酸残基；154位残基为非极性氨基酸残基；157位残基氨基酸残基为极性氨基酸残基。
[0010]本发明中涉及的芳香族氨基酸为Phe、Tyr，非极性氨基酸为Ala、Val、Leu、lie、Pro、Phe、Trp> Met,极性不带电荷氨基酸为Gly、Ser、Thr> Cys> Tyr、Asn、Gin,极性带正电荷的氨基酸残基为Lys、Arg、His。
[0011]进一方面，本发明的一些实施方案中，含有突变的脂肪酶变体针对布洛芬类化合物的酯衍生物展现出更高的活性及选择性，这些突变包含下列一项或者多项突变，氨基酸序列 189 位残基为 Phe (SEQ ID N0.4，10, 12)，190 位残基为 Leu 或 lie (SEQ ID N0.6，8，10，12)，39 位残基为 Ala 或 Val (SEQ ID N0.34)，40 位残基为 Ala 或 Val (SEQ IDN0.34)，138 位残基为 Ser、Thr 或 Cys (SEQ ID N0.14，16，18，36，38，40，42)，139位残基为 Tyr、His 者 Arg (SEQ ID N0.14，16，36，38，40，42)，152 位残基为 Lys 或His (SEQ ID N0.30，32)，154 残基位为 Gly 或 Ala (SEQ ID N0.20，22，24，26，28，30，32，36，38，40，42)，157 位残基为 Ser、Thr、Asp 或 Gly (SEQ ID N0.20，22，24，26，28，30，32，36，38，40，42)。
[0012]本发明的实施方式包括编码所述脂肪酶变体的核酸，例如与编码本发明所述CALB变体的核酸序列具有至少85%的序列同一性。本发明的相关实施方式包括包含这些核酸的载体及包含该类载体的宿主细胞。
[0013]本发明还包括脂肪酶突变体在动力学拆分手性羧酸酯类化合物中的应用。所述的手性羧酸酯类化合物为如式(I)所示的化合物，
【权利要求】
1.一种脂肪酶突变体，该突变体氨基酸序列具有与SEQ ID N0.02蛋白质氨基酸序列至少有85%序列同一性，并且对应于SEQ ID N0.2的189位残基为芳香族氨基酸残基，对应于SEQ ID N0.2的190位残基为非极性氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的脂肪酶突变体，所述的芳香族氨基酸残基为Phe或Tyr，优选Phe,所述的非极性氨基酸残基为Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp或Met,优选Leu或He。
3.如权利要求2所述的脂肪酶突变体，包括如下一个或多个氨基酸残基:39位为非极性氨基酸残基；40位残基为非极性氨基酸残基；138位残基为极性不带电荷氨基酸残基；139位残基为极性不带电荷氨基酸残基；152位残基为极性带正电荷的氨基酸残基；154位残基为非极性氨基酸残基；157位残基氨基酸残基为极性氨基酸残基。
4.如权利要求3所述脂肪酶突变体，所述的39位残基为Ala或Val；40位残基为Ala或Val ; 138位残基为Ser、Cys ; 139位残基为Tyr、His者Arg ; 152位残基为Lys或His ；154残基位为Gly或Ala ；157位残基为Ser、Thr> Asp或Gly。
5.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于，138位残基为Ser; 139位残基为Tyr。
6.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于，138位残基为Ser，139位残基为His。
7.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于，154位残基为Gly，157位残基为Asp0
8.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于，152位残基为His；154位残基为Gly ； 157位残基为Ser。
9.如权利要求1所述脂肪酶突变体，其氨基酸序列如SEQID N0.4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40 或 42 所示。
10.一种核酸，其能够编码权利要求1-9中任一项所述的脂肪酶突变体。
11.如权利要求10所述的核酸，其氨基酸序列如SEQID N0.3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39 或 41 所示。
12.—种表达载体,该载体含有权利要求10或11所述的核酸且能在宿主细胞中进行表达。
13.—种宿主细胞,其含有权利要求10或11的核酸或权利要求12所述的的表达载体。
14.如权利要求13所述的宿主细胞，该宿主细胞是毕氏酵母。
15.权利要求1-9中任一项所述的脂肪酶突变体在动力学拆分手性羧酸酯类化合物中的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于所述的应用包括下述方法:在pH5-9的磷酸盐缓冲液溶液中，在权利要求1-9任一项所述的脂肪酶突变体的催化下，手性羧酸酯类化合物进行水解，生成光学活性手性羧酸。
17.如权利要求15或16所述的应用，其特征在于，所述的手性羧酸酯类化合物为如式(I)所示的化合物，
18.如权利要求16-17任一项所述的应用，其特征在于，所述的手性羧酸酯类化合物为布洛芬类化合物的酯衍生物，其结构如式(II)所述，布洛芬类化合物为布洛芬、氟比洛芬、阿利洛芬、非诺洛芬、萘普生或酮洛芬，
【文档编号】C12N1/19GK103881992SQ201210561186
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】游松, 秦斌, 张新, 梁萍, 穆矛, 王潇莹, 马国振, 金旦妮 申请人:沈阳药科大学