专利名称：一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种 编码重组的0 -甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建以及利用毕赤酵母表达甘露聚糖酶的方法，同时，利用该重组甘露聚糖酶水解高浓度甘露聚糖制备甘露寡糖的方法，在工业生产中无需调节PH，操作简单，能够降低生产成本，缩短工艺流程，简化后续处理步骤。
背景技术：
甘露低聚糖是由2 — 10个单糖分子通过糖苷键连接而成的低度聚合糖，可以有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道有益菌群的特异性增殖，并具有抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏、抗肿癌及增强机体免疫力等多种生理功能。此外，低聚甘露糖还具有不被人体降解、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，是新一代功能性食品。近年来，关于低聚糖的研究越来越多，已有多种功能性低聚糖产品投入市场，但目前大多数低聚糖产品属于普通型的低聚糖，有效成分不足50%。欧美等国因限于资源，主要采用化学合成方法和从酵母细胞壁分离提取甘露低聚糖，其中酵母发酵法成本低，污染少，但它们的产品纯度低、性能差。为了提高产品纯度，必须在后续工艺中使用操作复杂成本过高的提纯工序，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等。酵母发酵法生产的关键是甘露聚糖酶。如何寻找高活力的甘露聚糖酶，使水解的效率提高，使产品的纯度提高，使后续提纯工序简单有效，能低成本地生产高纯度低聚糖，显得尤为重要。甘露聚糖酶，是一类能够水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶，能水解植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶和魔芋等)生成低聚甘露糖。甘聚聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物、植物和微生物体内有该酶的存在，而微生物是其主要来源。芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌、真菌中的曲霉、青霉、酵母菌和放线菌中的链霉菌都是产甘露聚糖酶的常见菌群。国内现在有许多相关科研单位，如中科院微生物研究所，南开大学等广泛进行了甘露聚糖酶及其相关内容的研究，但所报道的发酵酶活性不高，酶解产物纯度低，生产成本高，难以工业化。魔芋是我国南方地区的特有经济作物，其主要成分为葡甘聚糖，在西南贫困山区产量很高，目前在国内主要作为一种粗纤维食粮或作为食品添加剂，附加值不高。将魔芋利用甘露聚糖酶经酶法水解制成甘露低聚糖，有很好的市场前景。在生产中的一般甘露聚糖酶活性差，水解效率低，底物浓度低，不能适应生产的要求。
发明内容
本发明的目的是运用基因工程手段寻找毕赤酵母偏爱密码，构建重组的￠-甘露聚糖酶基因，实现甘露聚糖酶的高效稳定表达，同时利用表达的重组3 -甘露聚糖酶水解高浓度甘露聚糖制备甘露寡糖。
本发明是这样实现的。本发明的步骤为:一、重组￠-甘露聚糖酶基因的合成在氨基酸序列不改变的前提下，对原始的P -甘露聚糖酶基因的核苷酸序列利用DNAffORKS工具进行优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码组成。优化后的核苷酸序列与原始基因的核苷酸序列(GeneBank accession XM_001390670.1)相比，有257个核苷酸发生变化，核苷酸的同源性为76%。同时为了使￠-甘露聚糖酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的￠-甘露聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的20个氨基酸。优化前的序列:atgaagcttt ccaacgccct cctcaccctg gctagcctgg cgctggccaa cgtctccacg 60gctctgccga aagcctcccc tgcaccgagc accagcagca gtgctgcctc cacctccttc 120gccagcacct ccggcctcca attcaccatt gatggcgaaa ctggctactt cgccggaacg 180aacagctact ggatcggttt cctcactgac aacgcggacg tcgacctcgt catgggccac 240ctgaagtcgt ccggcctcaa gatcctccgc gtgtggggct tcaacgatgt cacctcgcag 300ccctcctccg gcacagtctg gtaccaactg caccaggacg gcaaatcgac aatcaacacg 360ggtgccgacg gtctccagcg cctcgactac gtcgtctcgt ctgccgaaca gcacgacatc 420aaactcatca tcaacttcgt caactactgg accgattacg gtggtatgtc tgcgtacgtg 480agcgcgtatg gc ggatccgg cgagacggat ttctatacca gtgataccat gcagagtgcc 540tatcagacat atatcaagac ggtcgtggag cggtacagta actcctcggc ggtgtttgcg 600tgggagttgg cgaatgagcc gagatgtccg agttgcgata cttctgtgtt gtataactgg 660attgagaaga cgagtaagtt tattaagggg ttggatgcgg atcgtatggt ttgtattggt 720gatgagggct tcggtctcaa catcgactcg gacggcagct acccttatca attctccgag 780ggcttgaact ttacgatgaa cctcggtatc gatactattg actttggtac cctccacttg 840taccctgata gctggggcac ctccgacgac tggggcaacg gctggatcac cgcccacggc 900gcagcctgca aagcggccgg caagccatgt ctcctggagg aatacggagt cacctcgaac 960cactgcagtg tggagggctc gtggcagaag acagcgctca gcacaacggg cgtcggcgcg 1020gatctgttct ggcagtatgg tgatgatttg agtaccggga agtcgccgga tgatgggaat 1080actatctact atgggactag tgattatcag tgcctggtga cggatcatgt tgctgctatt 1140ggtagtgctt aa 1152优化后的序列为:atgttgccaa aggcttctcc agccccatcc acttcttcta gtgccgcctc tacatctttt 60gcatctactt ctggcttgca gtttactatt gatggtgaaa ctggttattt tgctggtact 120aactcttact ggattggttt tttgactgat aacgctgatg ttgatttggt catgggtcat 180ttgaagtctt caggattgaa gattttgaga gtttggggtt ttaacgatgt cacttctcaa 240ccatctagtg gtactgtttg gtatcaacta catcaggatg gcaagtctac tattaacaca 300ggtgctgacg gtttgcagag attggattac gttgtcagtt cagccgaaca gcacgatatc 360aaacttatca taaacttcgt gaattattgg acagactacg gcggcatgtc tgcatacgtt 420tctgcttacg gtggatctgg tgagactgat ttttacactt ctgacactat gcaaagtgct 480taccagacct acattaagac agttgtcgag cgttactcta attcctctgc tgtttttgct 540tgggaattgg ctaacgaacc aagatgtcct tcttgcgata cttcagtcct atataactgg 600
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gatttgtttt ggcagtacgg agacgatttg agtactggaa agtctcccga tgatggtaac 1020acaatttact acggtacttc cgactatcag tgcttggtta cagatcatgt tgcagctatc 1080ggttctgct 1089优化后的甘露聚糖酶基因序列(Sbjct表不)与原始(Query表不)基因序列比较如下:(竖线表示上下对应的碱基相同，空格表示对应碱基不同)
权利要求
1.一种重组甘露聚糖酶基因，其特征在于:优化后的序列为:atgttgccaa aggcttctcc agccccatcc acttcttcta gtgccgcctc tacatctttt 60gcatctactt ctggcttgca gtttactatt gatggtgaaa ctggttattt tgctggtact 120aactcttact ggattggttt tttgactgat aacgctgatg ttgatttggt catgggtcat 180ttgaagtctt caggattgaa gattttgaga gtttggggtt ttaacgatgt cacttctcaa 240ccatctagtg gtactgtttg gtatcaacta catcaggatg gcaagtctac tattaacaca 300ggtgctgacg gtttgcagag attggattac gttgtcagtt cagccgaaca gcacgatatc 360aaacttatca taaacttcgt gaattattgg acagactacg gcggcatgtc tgcatacgtt 420tctgcttacg gtggatctgg tgagactgat ttttacactt ctgacactat gcaaagtgct 480taccagacct acattaagac agttgtcgag cgttactcta attcctctgc tgtttttgct 540tgggaattgg ctaacgaacc aagatgtcct tcttgcgata cttcagtcct atataactgg 600atcgagaaga cctctaagtt catcaagggc ttggacgccg atagaatggt ttgtattggt 660gacgaaggtt ttggtttgaa tattgactcc gatggttctt acccatacca attctctgaa 720ggtctgaact ttaccatgaa cctaggcata gatactatcg actttggaac tctgcacttg 780tatccagatt catggggtac gtctgatgat tggggtaatg gctggatcac cgctcatgga 840gccgcctgca aggcagctgg taaaccttgt ttgttggagg aatacggtgt aacatctaat 900cactgttctg tggaaggttc ttggcagaag actgctttgt ctaccactgg tgtgggagct 960gatttgtttt ggcagtacgg agacgatttg agtactggaa agtctcccga tgatggtaac 1020acaatttact acggtacttc cgactatcag tgcttggtta cagatcatgt tgcagctatc 1080ggttctgct 1089设计的引物序列为:man-lGTCAATGTTGCCAAAGGCTTCTCCAGCCCCATCCACTTCTTCTAGman-2TAGATGCAAAAGATGTAGAGGCGGCACTAGAAGAAGTGGATGGGGC 46man-3GCCTCTACATCTTTTGCATCTACTTCTGGCTTGCAGTTTACTATTG 46man-4CAGCAAAATAACCAGTTTCACCATCAATAGTAAACTGCAAGCCAGA 46man-5GGTGAAACTGGTTATTTTGCTGGTACTAACTCTTACTGGATTGGTT 46man-6ACATCAGCGTTATCAGTCAAAAAACCAATCCAGTAAGAGTTAGTAC 46man-7TTTTGACTGATAACGCTGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAA 46man-8TCTCAAAATCTTCAATCCTGAAGACTTCAAATGACCCATGACCAAA 46man-9TCTTCAGGATTGAAGATTTTGAGAGTTTGGGGTTTTAACGATGTCA 46man-1OACAGTACCACTAGATGGTTGAGAAGTGACATCGTTAAAACCCCAAA 46man-11TCAACCATCTAGTGGTACTGTTTGGTATCAACTACATCAGGATGGC 46man-12AGCACCTGTGTTAATAGTAGACTTGCCATCCTGATGTAGTTGATAC 46man-13AGTCTACTATTAACACAGGTGCTGACGGTTTGCAGAGATTGGATTA 46man-14GTGCTGTTCGGCTGAACTGACAACGTAATCCAATCTCTGCAAACCG 46man-15ACTTCAGCCCAACAGCACCATATCAAACTTATCATAAACTTCCTGA 46man-16CGCCCTAGTCTCTCCAATAATTCACGAAGTTTATCATAAGTTTGAT 46man-17TATTCGACAGACTACGGCGGCATGTCTGCATACGTTTCTGCTTACG 46man-18TAAAAATCAGTCTCACCAGATCCACCGTAAGCAGAAACGTATGCAG 46man-19GGATCTGGTGAGACTGATTTTTACACTTCTGACACTATGCAAAGTG 46man-20CTGTCTTAATGTACGTCTGCTAAGCACTTTGCATAGTGTCAGAAGT 46man-21CTTACCAGACCTACATTAAGACAGTTGTCGAGCGTTACTCTAATTC 46man-22AATTCCCAAGCAAAAACAGCAGAGGAATTAGAGTAACGCTCGACAA 46man-23TGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCTTCT 46man-24AGTTATATAGGACTGAAGTATCGCAAGAAGGACATCTTGGTTCGTT 46man-25CCCATACTTCACTCCTATATAACTGCATCGAGAAGACCTCTAAGTT 46man-26CTATCCGCGTCCAAGCCCTTGATGAACTTAGACGTCTTCTCGATCC 46man-27GGCTTCGACGCCGATAGAATGGTTTGTATTGGTGACGAAGGTTTTG 46man-28AACCATCGGAGTCAATATTCAAACCAAAACCTTCGTCACCAATACA 46man-29TTTGAATATTGACTCCGATGGTTCTTACCCATACCAATTCTCTGAA 46man-30ACGTTCATGCTAAAGTTCACACCTTCAGAGAATTCGTATGCGTAAG 46man-31GTCTGAACTTTACCATGAACCTAGGCATAGATACTATCGACTTTGG 46man-32AATCTCGATACAAGTGCAGAGTTCCAAAGTCGATAGTATCTATGCC 46man-33ACTCTGCACTTGTATCCAGATTCATGGGGTACGTCTGATGATTGGG 46man-34TCCATGAGCGGTGATCCAGCCATTACCCCAATCATCAGACGTACCC 46man-35TCCATCACCCCTCATGGAGCCGCCTCCAACGCAGCTCGTAAACCTT 46man-36ATGTTACACCGTATTCCTCCAACAAACAAGGTTTACCAGCTGCCTT 46man-37TG GAGGAATACGGTGTAACATCTAATCACTGTTCTGTGGAAGGTTC 46man-38TGGTAGACAAAGCAGTCTTCTGCCAAGAACCTTCCACAGAACAGTG 46man-39AGAAGACTGCTTTGTCTACCACTGGTGTGGGAGCTGATTTGTTTTG 46man-40AGTACTCAAATCGTCTCCGTACTGCCAAAACAAATCAGCTCCCACA 46man-4ITACGGAGACGATTTGAGTACTGGAAAGTCTCCCGATGATGGTAACA 46man-42ATAGTCGGAAGTACCGTAGTAAATTGTGTTACCATCATCGGGAGAC 46man-43TTTACTACGGTACTTCCGACTATCAGTGCTTGGTTACAGATCATGT 46man-44AGCAGAACCGATAGCTGCAACATGATCTGTAACCAAGCACman-45GGCCATTAATGGTGATGGTGATGGTGAGCAGAACCGATAGCTGCAACAT利用套叠PCR的方法合成该重组P -甘露聚糖酶基因，设计的引物长度为40-50bp，相邻两引物之间有20bp左右重叠序列，Tm值为55-60°C。
2.一种表达重组甘露聚糖酶的基因工程菌GSl 15/MAN78 (Pichia sp GS115/MAN78,),保藏号 CCTCCNo:2012554。
3.—种重组甘露聚糖酶水解制备甘露寡糖的方法，其特征在于步骤为: 底物为含有甘露聚糖的瓜尔豆胶，或魔芋胶，或刺槐豆胶，或香豆胶，或田菁胶； 底物配制时，在温度为50-55°C的自来水中一边少量添加底物，同时一边少量逐步添加重组甘露聚糖酶酶液，底物和酶量比例为Ig: 20ul，逐步递增底物的量达到预定的浓度，均匀搅拌，无需调节PH; 水解底物浓度15% 40%质量体积百分比，温度为50-55°C，时间0.5_2h，水解完成后，将反应液进行离心去残渣，取上清过滤，超滤，进行真空喷雾干燥，即得甘露低聚糖成品，降解物纯度达90% ； 所加的重组甘露聚糖酶是利用权利要求2所述的保藏号CCTCCNo =2012554的基因工程菌GS115/MAN78表达制 备的粗酶液。
全文摘要
本发明提出了一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法，其步骤为1)根据毕赤酵母密码子偏爱性，优化重组β-甘露聚糖酶基因；2)构建含有重组β-甘露聚糖酶基因的表达载体pHBM905BDM-Man，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，培养验证得单拷贝基因工程菌；3)构建培养验证多拷贝的基因工程菌；4)用不同拷贝数的基因工程菌高效表达制备重组β-甘露聚糖酶；5)用重组β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖底物生产甘露寡糖，底物水解浓度15-40%，温度50-55℃，时间0.5-2小时。目前，两拷贝β-甘露聚糖酶基因工程菌GS115/MAN78(CCTCCNo2012554)表达水平较高。本发明重组β-甘露聚糖酶活性高达5000U/mL(DNS法)，水解底物特异性高，水解底物浓度明显高于其他方法。
文档编号C12N15/56GK103146724SQ20121059185
公开日2013年6月12日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者马立新, 赵西选, 喻诗, 李晔星, 王亚平, 姚永兰 申请人:湖北大学, 湖北花果山实业有限公司