专利名称：大量生产普鲁兰多糖的诱变菌株及其培养方法
技术领域：
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一株大量产生普鲁兰多糖的诱变菌株出芽短梗霉及培养方法。
背景技术：
普鲁兰多糖是出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans)产生的胞外多糖，易溶于水，具有非常优良的增稠作用，造膜性强、易形成良好的水溶性的可食薄膜，并且具有无毒无害、无色无味等优良特性，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工和石油等领域，是一种很有前景的工业用多糖。出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans)细胞形态多种多样。在发酵过程中由于发酵条件和底物的不同，一般有酵母状(Y相)和菌丝体(M相)两种状态相互转变。但是出芽短梗霉在哪一种形态时大量产生普鲁兰多糖尚有争议。国内的相关研究中筛选到了一些多糖产量高色素低的出芽短梗霉菌株，但生产技术与先进国家相比还有差距，原料利用率(50%左右)还不高，并且存在发酵时间过长的问题。方宣钧也通过紫外照射得到变异株ZY047，通过优化培养条件多糖转化率达到54. 1%，色素水平较低；刘娜2005年硕士论文题目是“茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究”，该文主要研究了普鲁兰多糖生产菌种和发酵条件的优化，确定了菌种与发酵条件，虽然其色素水平低，但其普鲁兰多糖产量也不高。本发明利用复合诱变技术筛选获得一株普鲁兰多糖高产菌株，提高了原料利用率，有效降低了成本，实现了普鲁 兰多糖的工业化生产。
发明内容
本发明利用复合诱变技术筛选获得一株普鲁兰多糖高产菌株编号BCSWGHPL101，现在保藏于天津北洋百川生物技术有限公司，该菌株是以天津科技大学从我国宁夏回族自治区银川市王太堡果园土壤中筛选出的出芽短梗霉(Aureobsidiumpullulans) TKPM10017为出发菌株进行紫外诱变获得的。一株普鲁兰多糖高产菌株BCSWGHPLlOl(Aureobsidiumpullulans),该菌株已经于2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO. 7055。出芽短梗霉BCSWGHPL101的培养方法，包括如下步骤(I)菌种活化将斜面菌种-出芽短梗霉BCSWGHPL101 (Aureobsidium
pullulans)转接斜面培养基，28°C活化培养3d ；(2)种子培养选取生长良好的斜面作为种子，用接种针挑一块(大约Icm3)接入种子培养基中，于28°C，200±20r/min下培养36h，制得种子液；(3)发酵培养将(2)中的种子培养液以5%(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在28°C 下，200±20r/min 振荡培养 3d ；
(4)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):去皮马铃薯200g/L，加葡萄糖 20g/L，琼脂 20g/L，pH 自然。121。。20min 灭菌；(5)种子培养基蛋白胨 3g/L，蔗糖 50g/L，K2HPO4 *7H202. Og/L，MgSO4 7H200. 4g/L, NaC12. 5g/L,调节 pH 至 7. 0，121 °C 高压灭菌 20min,备用；(6)发酵培养基蛋白胨 3g/L，蔗糖 100g/L, K2HPO4. 7H203. Og/L, MgSO4 7H200. 4g/L, NaC12. 5g/L, FeSO4O. 01g/L，调节 pH 至 7. 0，121 °C 高压灭菌 20min，备用。有益效果本发明与现有技术相比，本发明的诱变菌株BCSWGHPL101与普鲁兰多糖生产菌相t匕，其普鲁兰多糖生产能力提高了 41. 2%，普鲁兰的生产强度由0. 94g/L-h,提高到1. 33g/L h，降低了生产成本，提高了原料利用率。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例1生产普鲁兰多糖的原始菌株出芽短梗霉TKPM100171.菌体形态出芽短梗霉具有复杂的生活周期，在其生长过程细胞形态有如下五种变化酵母状、芽孢子、肿胀孢子、菌丝状与厚垣孢子，这几种种形态的演化取决于生长条件。经研究发现，多糖的产量与酵母状细胞的多少正相关，随着酵母状细胞的比例的增加而增加。2.菌落形态短 梗霉呈典型的真菌生长，形成疏松边缘不整齐的真菌性菌落；菌落初期为脏白色，粘稠状，后逐渐转暗至黑色，呈皮革状，有褶皱。3.培养特征此菌为高耗氧菌，最适生长温度为24_34°C，微酸环境利于生长，在pH6. 0-7. 0，摇床转速180 220r/min，震荡培养3_4天，pH呈现一直下降的状态，发酵结束时PH降至最低。发酵液颜色呈现乳白到黄色的状态。4.可以利用的碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、糊精等。5.可以利用的氮源牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、硝酸钠、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵等，上述氮源可以混合使用，也可单一使用。实施例2以出芽短梗霉TKPM10017为出发菌株采用复合诱变技术筛选得到菌株BCSffGHPLlOl1.诱变菌株的获得(I)选择生长良好的出芽短梗霉菌株TKPM10017斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做IO6个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下,30cm处，分别照射0. 5min、lmin、1.5min、2min、2. 5min3min、3. 5min、4min将孢子悬液梯度稀释涂平板,避光28°C培养,计算致死率；(2)选择0. 5min、2min、4min三个不同剂量的照射时间分别对菌株TKPM10017的孢
子悬浮液进行紫外照射处理；(3)然后把三个不同照射时间的孢子悬液混合均匀，进行10倍系列稀释10—1
IO-6,取lO'lO'lO—6三个稀释度的孢子悬浮液涂布平板，28°C避光培养3d;(4)将(3)中的诱变菌株接种到含有10mg/L寡霉素的种子培养基中培养；将种子液置于28°C恒温摇床，200r/min，振荡培养3d ;(5)将(4)中的种子液进行10倍系列稀释，取10_4、10_5、10_6三个稀释度的孢子悬浮液涂布斜面培养基平板，28°C培养3d，筛选培养基中颜色乳白色、菌落大而粘稠、湿润的菌株。(6)再将(5)中筛选的菌株分别接种到种子培养基中，在28°C，200r/min下，振荡培养36h，以5%的接种量接入发酵培养基中，28°C、200r/min下发酵3d，离心，蒽酮硫酸法测定上清液中普鲁兰多糖的含量，复筛出普鲁兰多糖高产菌株BCSWGHPL101。2.诱变菌株BCSWGHPL101的特性(I)菌体形态发酵液中主要呈现酵母样形态，椭圆形且大小均一，菌株的繁殖方式类似于酵母的出芽生殖方式。(2)菌落形态菌落呈圆形，中心隆起，表面光滑，湿润，不易挑取，生长后期有菌丝体产生。(3)培养特征28°C，200rpm下震荡培养3d，发酵液颜色乳白到乳黄色。(4)可以利用的碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、糊精其中之一。(5)可以利用的氮源牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、硝酸钠、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵等，上述氮源可以混合使用，也可单一使用。(6)可以在10mg/L寡霉素存在的情况下生长良好。3.培养基的配置(I)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):去皮马铃薯200g/L，加葡萄糖 20g/L，琼脂 20g/L，，pH 自然。121。。20min 灭菌。(2)种子培养 基蛋白胨 3g/L，蔗糖 50g/L，K2HPO4 *7H202. Og/L，MgSO4 7H200. 4g/L, NaC12. 5g/L，调节 pH 至 7. 0，121 °C 高压灭菌 20min，备用。(3)发酵培养基蛋白胨 3g/L，蔗糖 100g/L，K2HPO4. 7H203. Og/L, MgSO4 7H200. 4g/L, NaC12. 5g/L, FeSO4O. 01 g/L 调节 pH 至 7. 0，121 °C 高压灭菌 20min,备用。(4)选择培养基寡霉素5mg/L(单独灭菌)，蛋白胨3g/L,鹿糖50g/L,K2HPO4 *7H202. 0g/L, MgSO4 *7H200. 4g/L，NaC12. 5g/L，调节 pH 至 7. 0，121 °C 高压灭菌 20min,备用。(5)初筛培养基即PDA培养基去皮马铃薯200g/L，加葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然。121°C 20min灭菌。实施例3出芽短梗霉BCSWGHPL101的培养1.菌种的活化将出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)BCSffGHPLlOl 转接 PDA 斜面培养基，28°C恒温培养3d。2.种子培养选择生长良好的活化斜面菌种转接于装有种子培养基的三角瓶中，于28°C，200±20rpm 下培养 36h。3.发酵培养将2中制得的种子培养基以5% (v/v)接种量接种于发酵培养基中，于28°C，200±20rpm 下培养 3d。检测结果出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) BCSffGHPLlOl在发酵培养基发酵生产普鲁兰多糖产量为96g/L。原始菌株产量68±5. 2g/L，较原始菌株提高了 41. 2%。
权利要求
1.一株产普鲁兰多糖的出芽短梗霉BCSWGHPL101 (Aureobsidiumpullulans),保藏号码 CGMCC NO. 7055。
2.如权利要求1所述产普鲁兰多糖的出芽短梗霉生产普鲁兰多糖的方法，包括如下步骤 (1)菌种活化将CGMCCNO. 7055转接斜面培养基，28°C活化培养3d ； (2)种子培养选取生长良好的斜面作为种子，用接种针挑一块Icm3接入种子培养基中，于28°C，200±20r/min下培养36h，制得种子液； (3)发酵培养将(2)中的种子培养液以5%(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在28°C下，200 土 20r/min振荡培养3d。
3.根据权利要求2所述的产普鲁兰多糖的出芽短梗霉生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于所述发酵培养基组成蛋白胨3g/L，蔗糖100g/L，K2HPO4. 7H203. Og/L,MgSO4 *7H200. 4g/L, NaC12. 5g/L, FeSO4O. 01g/L，调节 pH 至 7. 0。
4.如权I所述产普鲁兰多糖的出芽短梗霉CGMCCN0.7055在普鲁兰多糖生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株产普鲁兰多糖的出芽短梗霉，属于微生物领域，出芽短梗霉BCSWGHPL101(Aureobsidium pullulans)保藏号码CGMCCNO.7055；产普鲁兰多糖的出芽短梗霉所用发酵培养基组成为蛋白胨3g/L，蔗糖100g/L，K2HPO4.7H2O3.0g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，NaCl2.5g/L，FeSO40.01g/L，调节pH至7.0。本发明的诱变菌株BCSWGHPL101与常规普鲁兰多糖生产菌相比，其普鲁兰多糖生产能力更为高，并由此有效提高普鲁兰多糖的产率，降低生产成本。
文档编号C12R1/645GK103060204SQ20121059487
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者乔长晟, 郝华璇, 卢星达, 李政, 马正旺 申请人:天津北洋百川生物技术有限公司