用于异丁醇生产的宿主细胞和方法

用于异丁醇生产的宿主细胞和方法
【专利摘要】本文提供了产生异丁醇的重组酵母宿主细胞及其使用方法。所提供的酵母宿主细胞包含：异丁醇生物合成途径和降低或消除的醛脱氢酶活性、降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性中的至少一个；或编码具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽的异源多核苷酸。
【专利说明】用于异丁醇生产的宿主细胞和方法
[0001]政府许可权利
[0002]本发明根据能源部授予的合同号DE-AR0000006受到美国政府的支持。美国政府拥有本发明的某些权利。
【技术领域】
[0003]本发明涉及用于异丁醇发酵生产的重组宿主细胞和方法。
_4] 相关申请的交叉引用
[0005]本专利申请根据35U.S.C.§ 119 (e)要求美国专利申请61/472，484 (提交于2011 年 4 月 6 0),61/467, 261 (提交于 2011 年 3 月 24 0),61/472, 487 (提交于 2011 年
4月 6 H),61/467, 271 (提交于 2011 年 3 月 24 H),61/570, 513 (提交于 2011 年 12 月 14日)、61/467，249 (提交于2011年3月24日)、61/472，497 (提交于2011年4月6日)以及61/472,474 (提交于2011年4月6日)的优先权，其各自全文以引用的方式并入本文。
[0006]对于通过EFS-WEB电子递夺的序列表的引用
[0007]电子递交的序列表(名称:20120323_CL5367USNA_SEQLIST.txt ;大小 2，003, 893字节；创建日期2012年3月23日)的内容在此全文以引用的方式并入本文。
【背景技术】
[0008]丁醇是重要的工业`化学品，可用作为染料添加剂、作为塑料工业中的原料化学品以及作为食品和调味品工业中的食品级提取剂。每年度通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇并且对这一商业化学品的需求在未来很可能增加。
[0009]用于异丁醇的化学合成的方法是已知的，例如羰基合成、一氧化碳的催化氢化(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第 6 版，2003, Wiley-VCH VerlagGmbH andC0.，ffeinheim, Germany,第5卷,716-719页)和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini 等人，J.Molec.Catal.A.Chem.220:215-220，2004)。这些方法使用了来自于石化产品的起始物质，一般价格昂贵，且不环保。通过植物来源的原材料进行的异丁醇生产将使温室气体排放最小化并且将是本领域中的一个进步。
[0010]异丁醇作为酵母发酵的副产品而进行生物生产。其为由于真菌对氨基酸的不完全代谢而形成的“杂醇油”的组分。异丁醇通过L-缬氨酸的分解代谢而特异性产生。在L-缬氨酸的氨基基团被收集作为氮源后，所得的α-酮酸通过所谓的艾利希途径(Ehrlich pathway)的酶进行脱羧化并且还原成为异丁醇(Dickinson等人，J.Biol.Chem.273:25752-25756,1998)。
[0011]对于通过糖直接生物合成丁醇的改进方案和替代方案将改善经济可行性并且将是本领域中的一个进步。

【发明内容】

[0012]本文提供了用于异丁醇生产的重组酵母宿主细胞和方法。[0013]在一些实施例中，重组宿主细胞包含工程化的异丁醇生产途径，以及(a)下列中的至少一个:(i)具有酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的异源多肽，其选自(I)与来源于角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii )或类厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae)的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同一性的多肽，(2)与SEQID N0:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63 或 65 具有至少约90%同一性或具有至少约95%同一性的多肽；或(^)编码(a)的具有KARI活性的异源多肽的异源多核苷酸；和6)至少一个宿主细胞修饰，其增强了所述工程化异丁醇生产途径的性能。在一些实施例中，(a)和(b)的组合引起异丁醇生产途径性能中的协同提高。
[0014]在一些实施例中，重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径，以及(a)具有酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的异源多肽，其选自(i)与来源于角双歧杆菌、齿双歧杆菌、运动发酵单胞菌、拜氏梭菌或粪厌氧棒状菌的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同—性的多肽，(ii)与 SEQ IDN0:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、
57、59、61、63或65具有至少约90%同一性或具有至少约95%同一性的多肽；(iii)与来自形双歧杆菌、齿双歧杆菌、鹁鸡肠球菌(Enterococcus gal I inarum)、链球菌嗜热菌(Streptococcus thermophiles)、运动发酵单胞菌、拜氏梭菌、粪厌氧棒状菌或乳酸乳球菌乳脂亚种 MG1363 (Lactococcus lactis subsp.cremorisMG1363)的 KARI 酶或其活性片段具有至少约90%同一性或至少约95%同一性的多肽，其中所述多肽针对NADH具有小于约50的KM，(iv)与来自头葡萄球菌(Staphylococcus capitis) SK14，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) M23864-W1，人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)SKl 19，金黄色葡萄球菌金黄亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus) TCHl30，沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri) L37603,表皮葡萄球菌W23144，腐生葡萄球菌腐生亚种(Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus) ATCC15305,肉葡萄球菌肉亚种(Staphylococcus carnosus subsp.Carnosus) TM300，单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes) E`GD_e、格氏李斯特菌(Listeria grayi) DSM20601、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus) EC30，鹁鸡肠球菌EG2，溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus) JCSC5402，前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、变异链球菌(Streptococcus mutans) UA159，格氏链球菌(Streptococcus gordonii)str，cgakkus sybstr.CHl，猪链球菌(Streptococcus suis) 89/1591、婴儿链球菌婴儿亚种(Streptococcus infantarius subsp.1nfantarius) ATCCBAA-102、乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363，乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp mesenteroides) ATCC8293,布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri) ATCC11577、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus) JCSC1435，表皮葡萄球菌 ATCC12228，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) CGSP14,肺炎链球菌TIGR4，血链球菌(Streptococcus sanguinis) SK36，唾液链球菌(Streptococcus salivarius) SK126，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) LMD-9、肺炎链球菌CCRI1974M2，乳酸乳球菌乳酸亚种 11403，肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris)ATCC19254，肠膜明串珠菌乳脂亚种、短乳杆菌格雷夫斯亚种(Lactobacillus brevissubsp.gravesensis)ATCC27305或乳酸乳球菌乳酸亚种NCD02118的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同一性或至少约95%同一性的多肽，其中所述异源多肽针对NADH具有小于约 50 的 Km, (V)与 SEQIDNO:67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133 或 135 或它
们的活性片段具有至少约90%同一性或具有至少约95%同一性的具有KARI活性的多肽，其中所述异源多肽针对NADH具有小于约50的Km ； (b)编码具有KARI活性的异源多肽的异源多核苷酸；(c)降低或消除的醛脱氢酶活性；(d)降低或消除的醛氧化酶活性；(e)降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性；或(丨)它们的组合。
[0015]在一个实施例中，所述重组宿主细胞包含降低或消除的醛脱氢酶表达活性和降低或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性。
[0016]在另一个实施例中，所述重组宿主细胞包含(i )降低或消除的醛脱氢酶表达或活性或降低或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性，以及(ii)编码具有KARI活性并且针对NADH具有小于300 μ M的Km的多肽的异源多核苷酸。
[0017]在另一个实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其与SEQID Ν0:27、29、141、143、275或277具有至少约90%或至少约95%同一性。
[0018]在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其在对应于SEQ ID Ν0:27的S56和S58的氨基酸处包含替换。在一些实施例中，具有KARI活性的多肽还包含对应于SEQ ID Ν0:27的Ι86、Ν87、Τ131、或Τ191的一个或多个氨基酸的替换。在一些实施例中，具有 KARI 活性的多肽对于 SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、
53、55、57、59、61、63或65具有至少约90%同一性或至少约95%同一性。
[0019]在一些实施例中，所述重组宿主细胞在约48小时后具有至少约3、至少约4、或至少约5克/克细胞的有效异丁醇产率，其中所述48小时中的至少最后约24小时处于厌氧条件下。`
[0020]在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其在ρΗ6.8下针对NADH具有小于约350、小于约100、小于约50、或小于约10 μ M的ΚΜ。
[0021]在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其与SEQ IDΝ0:376、382、378或275具有至少约90%同一性或至少约95%同一性。
[0022]在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其包含在对应于来自粪厌氧棒状菌的KARI酶(SEQ ID Ν0:27)的氨基酸A41、S56、S58、I87、T131、T191、R227、或Q246的一个或多个位点上具有氨基酸替换。
[0023]在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其包含SEQID N0:33或SEQ ID NO:35或它们的活性片段。
[0024]在另一个实施例中，所述重组宿主细胞在编码具有醛脱氢酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽催化异丁醛向异丁酸的转化。在一些实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽对应于酶学委员会编号(EnzymeCommission Number) ECl.21.3、ECl.2.1.4 和 / 或 ECl.2.1.5。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6或它们的同源物。在一些实施例中，所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(K.lactis)并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021或KLLA0D09999G。在一些实施例中，所述宿主细胞是树干毕赤酵母(P.stipitis)并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是八0)2、40)3、40)4、40)5、或40)7。在一些实施例中，所述宿主细胞是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是AldH。在一些实施例中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是aldA、aldB或aldH。
[0025]在另一个实施例中，所述宿主细胞包含编码具有醛氧化酶活性的多肽的内源多核苷酸中的缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，所述具有醛氧化酶活性的多肽催化异丁醛至异丁酸的转化。在一些实施例中，所述具有醛氧化酶活性的多肽对应于酶学委员会编号ECl.2.3.1。在一些实施例中，所述具有醛氧化酶活性的多肽是AOXl和/或A0X2。
[0026]在另一个实施例中，所述宿主细胞包含编码具有乙酰乳酸还原酶的多肽的内源多核苷酸中的缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶的多肽包含由选自 SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:680、SEQ ID NO:682、SEQ ID NO:684、SEQ ID NO:686,SEQ ID NO:688, SEQ ID NO:690,SEQ ID NO:692, SEQ ID NO:694, SEQ IDNO:696、SEQ ID NO:702、SEQ ID NO:704、SEQ ID NO:706、SEQ ID NO:708、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ ID NO:716、SEQ ID NO:718、SEQ ID NO:720、SEQ IDNO:722、SEQ ID NO:724、SEQ ID NO:726、SEQ ID NO:728 和 SEQ ID NO:730 的多核苷酸所编码的多肽。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶的多肽是YMR226C。
[0027]在另一个实施例中，所述重组宿主细胞是酵母宿主细胞。在一些实施例中，所述酵母选自糖酵母(Saccharomyce )、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、伊萨酵母(Issatchenkia)或毕赤酵母(Pichia)。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母。
[0028]在另一个实施例中，所述宿主细胞是细菌细胞。在一些实施例中，所述细菌细胞是梭菌(Clostridium)、发酵单胞菌(Zymomonas)、埃希氏菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、红球菌(Rhodococc`us)、假单胞菌(Pseudomonas)、芽抱杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、片球菌(Pediococcus)、产喊杆菌(Alcaligenes)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、类芽抱杆菌(PaenibaciIIus)、节杆菌(Arthrobacter)、棒状杆菌(Corynebacterium)、短杆菌(Brevibacterium)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、酒球菌(Oenococcus)、片球菌(Pediococcus)或链球菌(Streptococcus)的细胞。在一些实施例中，所述细菌细胞并非大肠杆菌。
[0029]在一些实施例中，所述重组宿主细胞的工程化异丁醇生产途径包括下列底物至产物转化:Ca)丙酮酸至乙酰乳酸，(b)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸，(c) 2，3- 二羟基异戊酸至2-酮异戊酸，(d) 2-酮异戊酸至异丁醛，以及(e)异丁醛至异丁醇，并且超过一种所述底物至产物的转化通过对于所述宿主细胞异源的酶催化。在一些实施例中，编码对于所述宿主细胞异源的酶中的至少一个异源多核苷酸通过染色体整合到该宿主细胞中。在一些实施例中，所述底物至产物的转化通过基本上定位于细胞溶胶的酶催化。在一些实施例中，异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化通过利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶催化。在一些实施例中，乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸的转化通过使用NADH作为辅因子的KARI催化。
[0030]在一些实施例中，所述宿主细胞包含质粒pLH702或pLH701或具有相同编码区的质粒。在一些实施例中，所述宿主细胞包含质粒PBP915或具有相同编码区的质粒。在一些实施例中，所述宿主细胞包含质粒PYZ067 Δ kivD Δ hADH或具有相同编码区的质粒。
[0031]在一些实施例中，所述宿主细胞包含降低、破坏或消除的将乙酰乳酸转化成2，3- 二羟基-2-甲基丁酸的能力。
[0032]在一些实施例中，所述宿主细胞是酵母并且具有降低或消除的丙酮酸脱羧酶表达或活性。在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低或消除的PDC1、PDC5、或H)C6活性或它们的组合。
[0033]在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低或消除的NAD-依赖型甘油-3-磷酸酯脱氢酶表达或活性。在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低的GPD2活性。
[0034]在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低或消除的FRA2表达或活性。
[0035]在一些实施例中，所述宿主细胞在厌氧条件下产生异丁醇，并且异丁醇与甘油的摩尔比大于I。
[0036]在一些实施例中，具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽以〈10_3的序型HMME值匹配表Z中提供的序型HMM。
[0037]在一些实施例中，所述宿主细胞以大于理论收率约25%、约50%、约75%、或约90%的收率生产异丁醇。
[0038]在一些实施例中，产生异丁醇和乙醇。
[0039]用于生产异丁醇的方法包括:提供如上所述的重组宿主细胞，以及在由此产生异丁醇的条件下，使所述宿主细胞与碳底物接触。在一些实施例中，所述接触的至少一部分在厌氧条件下进行。在一些实`施例中，所述接触在提取剂存在下进行。在一些实施例中，所述接触在足量的有机提取剂存在下进行以形成包含水相和有机相两相体系。在一些实施例中，与使用不包含具有KARI活性的异源多肽、不包含编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸、不包含降低或消除的醛脱氢酶活性、不包含降低或消除的醛氧化酶活性、不包含降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性或其组合的重组宿主细胞的方法相比，异丁醇的有效速率、有效滴度、或有效收率中的一个或多个是提高的。在一些实施例中，与使用不包含(i)具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸以及(ii)增强工程化异丁醇生产途径的性能的至少一个修饰的重组宿主细胞的方法相比，异丁醇的有效速率、有效滴度或有效收率中的一个或多个是提高的。在一些实施例中，与使用不包含具有KARI活性的异源多肽、不包含编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸、不包含降低或消除的醛脱氢酶活性、不包含降低或消除的醛氧化酶活性、不包含降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性或它们的组合的重组宿主细胞的方法相比，DHMB生产、异丁酸生产或两者均是降低的。在一些实施例中，与使用不包含(i)具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸以及(ii)增强工程化异丁醇生产途径的性能的至少一种修饰的重组宿主细胞的方法相比，DHMB生产、异丁酸生产或两者有所减低。在一些实施例中，异丁醇与甘油的摩尔比大于I。
[0040]用于生产异丁醇的方法还包括提供产生异丁醇的重组宿主细胞，以及在由此产生异丁醇的条件下，使所述宿主细胞与碳底物接触，其中接触的至少一部分在厌氧条件下进行，并且其中所产生的异丁醇与甘油的比率大于I。
[0041]用于生产异丁醇的方法还包括使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，其包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，以及从所述培养物中移除DHMB。[0042]本文还提供了通过该方法产生的组合物。在一些实施例中，所述组合物包含异丁醇和上文提供的重组宿主细胞。在一些实施例中，所述组合物包含丁醇以及不超过约0.5mM的 DHMB。
[0043]本文还提供了发酵组合物。在一些实施例中，发酵组合物包含所述宿主细胞以及根据上文所述的方法产生的异丁醇。
[0044]还提供了包含i)能够产生丁醇的重组酵母，ii)丁醇，和iii)不超过约0.5mMDHMB的组合物。
[0045]还提供了用于制备重组宿主细胞的方法。这类方法可包括(a)提供重组宿主细胞，其包含编码具有醛脱氢酶活性或醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰；以及(b)使用编码异丁醇生物合成途径的多肽的多核苷酸转化所述宿主细胞。
[0046]还提供了降低或消除异丁醇至异丁酸的转化的方法。这类方法可包括(a)提供权利要求1-52中任一项的重组宿主细胞；以及(b)对所述宿主细胞施以条件，其中与使用并不包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的重组宿主细胞的方法相比，异丁醛至异丁酸的转化是降低或消除的。
[0047]还提供了某些多肽。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO:29、31、33、35、37、
39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、417、419、421、423、425、427、429、431、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、624、626、628、630、632 或它们的活性片段包含至少约90%同一性,或至少约95%同一性`,或至少约99%同一性,并且具有酮醇酸还原异构酶活性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID N0:417、419、421、423、425或427包含至少约90%同一性或至少约95%同一性或至少约99%同一性，并且具有酮醇酸还原异构酶活性。在一些实施例中，多肽包含与 SEQ ID N0:927、928、196、266、267、389、405、637、781、782、783、835、853、854、855、856、857或859具有至少约90%同一性、至少约95%同一性或至少约99%同一性的序列。
[0048]还提供了编码这类多肽的多核苷酸和包含这类多核苷酸和多肽的宿主细胞。
[0049]还提供了将乙酰乳酸转化成2，3-二羟基异戊酸的方法。例如，这类方法可包含(a)提供上文描述的多肽，以及(b)在由此产生2，3-二羟基异戊酸的条件下，使所述多肽与乙酰乳酸接触。
[0050]还提供了重组酵母细胞。在一些实施例中，重组酵母细胞包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，并且所述酵母产生小于0.01摩尔2，3- 二羟基-2-甲基丁酸(DHMB)/摩尔消耗的糖。在一些实施例中，重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，并且所述酵母以小于约1.0mM/小时的速率产生DHMB。在一些实施例中，重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，并且所述酵母产生2，3- 二羟基-3-异戊酸(DHIV)的量是所述产生DHMB的量的至少约1.5倍。
[0051]还提供了鉴定参与DHMB产生的基因的方法。在一些实施例中，所述方法包括(i)提供包含至少两个或更多个基因缺失的酵母菌株的集合；(ii)测量单个酵母菌株产生的DHMB的量；(iii)选择产生不超过约1.0mMDHMB/小时的酵母菌株；以及(iv)在所选择的酵母菌株中鉴定缺失的基因。在一些实施例中，所述方法包括(i)提供过表达至少两个或更多个基因的酵母菌株的集合；(ii)测量单个酵母菌株产生的DHMB的量；(iii)选择产生至少约1.0mMDHMB/小时的酵母菌株；以及(iv)在所选择的酵母菌株中鉴定过表达的基因。
[0052]还提供了用于异丁醇生产的方法。在一些实施例中，所述方法包括(a)使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，其包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径；以及b)测量DHIV和/或DHMB浓度。在一些实施例中，所述生长和测量可同步进行或以任何顺序先后进行。在一些实施例中，所述测量包括液相色谱-质谱法。
[0053]还提供了提高酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的方法。在一些实施例中，所述方法包括(a)提供包含乙酰乳酸、KARI酶和乙酰乳酸还原酶的组合物，以及(b)降低DHMB水平。在一些实施例中，降低DHMB水平是通过降低乙酰乳酸还原酶的活性而实现的。在一些实施例中，降低DHMB水平是通过从所述组合物中移除DHMB而实现的。
[0054]在一些实施例中，提高宿主细胞中KARI酶产率可包括培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含异源KARI酶和降低、破坏或消除乙酰乳酸还原酶表达或活性的至少一个遗传修饰，并且其中在DHMB存在下，所述KARI酶活性是降低的。在一些实施例中，所述KARI与大肠杆菌或乳酸乳球菌的KARI具有至少约90%、至少约95%或至少约99%同一性。在一些实施例中，所述降低、破坏或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性实质上降低DHMB的存在。
[0055]还提供了提高二羟酸脱水酶(DHAD)活性的方法。在一些实施例中，所述方法包括Ca)提供包含二羟基异戊酸(DHIV)和DHAD酶的组合物，以及(b)降低DHMB水平。
[0056]附图1兑明和以引用的方式并入的随本文进行电子提交的表格
[0057]通过下面的【具体实施方式】、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些【具体实施方式】、附图和序列 描述形成本专利申请的一部分。
[0058]图1示出了四种不同的异丁醇生物合成途径。标记有“&”、“13”、“。”、“(1”、“6”、“广’、“g”、“h”、“ i ”、“ j ”和“k”的步骤代表下述的底物至产物的转化。
[0059]图2描述了来自荧光假单胞菌(“PF5”；SEQ ID NO: 5)的KARI与来自粪厌氧棒状菌(“K9”；SEQ ID NO:27)的KARI的氨基酸序列比对。粗体的位点被靶定用于如本文所述的诱变。
[0060]图3A、3B和3C描述了来自角双歧杆菌DSM20098 (“K1”;SEQ ID N0:141)、齿双歧杆菌 ATCC27678 (“K2” ；SEQ ID NO: 143)、拜氏梭菌 NCMB8052 (“K7”；SEQ ID NO: 275)、粪厌氧棒状菌 DSM14662 (“K9” ；SEQ ID NO: 27)、鹑鸡肠球菌 EG2 (“K25”SEQ ID NO: 376)、嗜热链球菌LMD-9 (“K26”SEQ ID NO: 121 )、乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363 (“K29” ；SEQ IDN0:382)、运动发酵单胞菌(“S2” ；SEQ ID NO:277)和乳酸乳球菌(“LTS” ；SEQ ID N0:380)。粗体的位点被靶定用于如本文所述的诱变。
[0061]图4 是 pLH556 (pHR81-PIlv5_Pf5.KARI)载体(SEQ ID NO: 138)的质粒图谱。
[0062]图5示出了两种菌株PNY1910和PNY2242的异丁醇生产的特异速率Qp。
[0063]图6示出了发酵时程期间PNY1910 (三角形)和PNY2242 (菱形)的培养物上清中的DHIV+DHMB积累。(所使用的HPLC方法未区分DHMB和DHIV。)
[0064]图7示出了甘油、丙酮酸、2，3-丁二醇化00)、0!11￥/1)麗8、α -酮异戊酸(aKIV)和异丁酸(iBuAc)的收率。DHIV和DHMB —同示出，因为所使用的HPLC方法未对其进行区分。
[0065]图8示出了 K9G9变体的Vmax/KM值的概述，如实例16中所述。
[0066]图9A、B和C示出了 K9变体的异丁醇与甘油的摩尔收率比，异丁醇的摩尔收率和异丁醇滴度，如实例19中所述。
[0067]图10示出了异丁醇生物合成途径。步骤“a”为丙酮酸至乙酰乳酸的转化。步骤“b”为乙酰乳酸至DHIV的转化。步骤“c”为DHIV至KIV的转化。步骤“d”为KIV至异丁醛的转化。步骤“e”为异丁醛至异丁醇的转化。步骤“f”为乙酰乳酸至DHMB的转化。
[0068]图11示出了来自子囊菌酵母菌种的YMR226C同源物的系统发生树。将一个丝状真菌(粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))序列包括在内以作为外类群(outgroup)。
[0069]图12示出了与YMR226C具有同源性的ORF的核苷酸序列的多序列比对(MSF格式)。示出的基因名对应于表7中给出的登录号和序列号。所述比对通过AlignX(VectorNTI)产生。
[0070]图13示出了 DHMB随时间的摩尔收率图。
[0071]图14描述了酵母菌株NYLA84中的异丁醇和异丁酸产量。
[0072]表Z-是经实验验证的KARI酶的序型HMM表(随本文进行电子提交并且以引用的方式并入)，所述KARI酶在表1中列出并且如美国申请公开2010/0197519和2009/0163376中所描述，其全文以引用的方式并入本文。
[0073]表1:经实骀骀证的KARI酶。
`[0074]
【权利要求】
1.重组宿主细胞，包含工程化的异丁醇生产途径以及 a.下列中的至少一个: 1.具有酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的异源多肽，其选自: 1.与来源于角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)或幾厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae)的 KARI 酶或其活性片段具有至少约90%同一性的多肽；
2.与SEQID N0:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、或65具有至少约90%同一性或至少约95%同一性的多肽；或 ?.编码a)的具有KARI活性的异源多肽的异源多核苷酸；和 b.至少一个宿主细胞修饰，其增强所述工程化的异丁醇生产途径的性能。 2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中a)和b)的组合引起异丁醇生产途径性能中的协同提高。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞修饰包括降低或消除的醛脱氢酶表达或活性和降低或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性。
4.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，包含降低或消除的醛脱氢酶表达或活性和降低或消除的乙酰乳 酸还原酶表达或活性，并且其中所述具有KARI活性的异源多肽针对NADH具有小于300 μ M的ΚΜ。
5.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽与SEQIDΝ0:27、29、141、143、275、或277具有至少约90%或至少约95%同一性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽包含对应于SEQ ID NO:27的S56和S58的氨基酸中的替换。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽还包含对应于SEQ ID勵:27的186、呢7、1'131、或1'191的一个或多个氨基酸的替换。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞在约48小时后具有至少约3、至少约4、或至少约5克/克细胞的有效异丁醇产率，其中所述48小时中的至少最后约24小时处于厌氧条件下。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽在ρΗ6.8下针对NADH具有小于约350、小于约100、小于约50、或小于约10 μ M的ΚΜ。
10.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽包含对应于 SEQ ID Ν0:27 的氨基酸 Α41、S56、S58、I87、T131、T191、R227、或 Q246 的一个或多个位置处的氨基酸替换。
11.根据权利要求ι-?ο中任一项所述的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞修饰包括编码具有醛脱氢酶活性的多肽的内源多核苷酸中缺失、突变、或替换中的至少一个。
12.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述具有醛脱氢酶活性的多肽对应于酶学委员会编号ECl.21.3、ECl.2.1.4、ECl.2.1.5、或它们的组合。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)，并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、或它们的同源物。
14.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(K.1actis),并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021、或 KLLA0D09999G。
15.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是树干毕赤酵母(P.stipitis)，并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、或ALD7。
16.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),并且所述具有醒脱氢酶活性的多肽是AldH。
17.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)，并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是aldA、aldB、或aldH。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码具有醛氧化酶活性的多肽的内源多核苷酸中缺失、突变、或替换中的至少一个或多个。
19.根据权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述具有醛氧化酶活性的多肽对应于酶学委员会编号ECl.2.3.1。
20.根据权利要求19所述的重组宿主细胞，其中所述具有醛氧化酶活性的多肽是A0X1、A0X2、或它们的组合。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源多核苷酸中至少一个或多个缺失、突变、或替换。
22.根据权利要求21所述的重组宿主细胞，其中所述内源多核苷酸选自:SEQIDNO:676、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:680、SEQ ID NO:682、SEQ ID NO:684、SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:688, SEQ ID NO:690,` SEQ ID NO:692, SEQ ID NO:694, SEQ ID NO:696, SEQ IDNO:702、SEQ ID NO:704、SEQ ID NO:706、SEQ ID NO:708、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ ID NO:716、SEQ ID NO:718、SEQ ID NO:720、SEQ ID NO:722、SEQ IDNO:724、SEQ ID NO:726、SEQ ID NO:728 和 SEQ ID NO:730。
23.根据权利要求21所述的重组宿主细胞，其中所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是 YMR226C。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的重组宿主细胞,其中所述酵母是糖酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、伊萨酵母(Issatchenkia)、或毕赤酵母(Pichia)0
26.根据权利要求1或25所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述工程化的异丁醇生产途径包括下列底物至产物的转化: a.丙酮酸至乙酰乳酸； b.乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸； c.2，3- 二羟基异戊酸至2-酮异戊酸； d.2-酮异戊酸至异丁醛；以及e.异丁醛至异丁醇， 其中每个底物至产物的转化通过由所述宿主细胞重组表达的酶催化。
28.根据权利要求27所述的重组宿主细胞，其中所有底物至产物的转化通过对于所述宿主细胞异源的酶催化。
29.根据权利要求28所述的重组宿主细胞，其中至少一个异源多核苷酸经染色体整合到所述宿主细胞中，所述异源多核苷酸编码对于所述宿主细胞异源的酶中的至少一个。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述底物至产物的转化通过基本上定位于细胞溶胶的酶催化。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化通过利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶催化。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含降低、破坏或消除的将乙酰乳酸转化成2，3- 二羟基-2-甲基丁酸的能力。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母，并且具有降低、破坏或消除的丙酮酸脱羧酶表达或活性。
34.根据权利要求33所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低、破坏或消除的H)C1、PDC5、或PDC6活性、或它们的组合。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低或消除的NAD-依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶表达或活性。·
36.根据权利要求35所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低的GPD2表达或活性。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低或消除的FRA2表达或活性。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞在厌氧条件下产生异丁醇，并且其中异丁醇与甘油的摩尔比大于I。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的多肽以〈10-3的序型HMME值匹配表Z中提供的序型HMM。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞以大于理论收率约25%、约50%、约75%、或约90%的收率生产异丁醇。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的重组宿主细胞，其中产生异丁醇，并且其中也产生乙醇。
42.生产异丁醇的方法，包括: a.提供权利要求1-41中任一项的重组宿主细胞，以及 b.在由此产生异丁醇的条件下，使a)的宿主细胞与碳底物接触。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述接触的至少一部分在厌氧条件下进行。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述接触在提取剂存在下进行。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述接触在足量的有机提取剂存在下进行以形成包含水相和有机相的两相体系。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中与并不包含(i)具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸中的至少一个和(ii)增强所述工程化的异丁醇生产途径性能的至少一个修饰的重组宿主细胞相比，异丁醇的有效速率、有效滴度、或有效收率中的一个或多个是提高的。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，其中与并不包含(i)具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸中的至少一个和(ii)增强所述工程化的异丁醇生产途径性能的至少一个修饰的重组宿主细胞相比，DHMB产量、异丁酸产量、或两者均是降低的。
48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述异丁醇与甘油的摩尔比大于1
49.发酵组合物，包含所述宿主细胞和根据权利要求42-28中任一项所述的方法产生的异丁醇。
50.生产异丁醇的方法，包括: a.提供产生异丁醇的重组宿主细胞； b.在由此产生异丁醇的条件下，使a)的宿主细胞与碳底物接触； 其中所述接触的至少一部分在厌氧条件下进行；并且 其中所述产生的异丁醇与甘油的比率大于I。
51.生产丁醇的方法，包括: a.使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，所述重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径；以及 b.从所述培养物中移除DHMB。
52.组合物，其通过权利要求51的方法产生，其中所述组合物包含丁醇和不超过约0.5mM 的 DHMB。
53.组合物，包含i)能够产生丁醇的重组酵母，ii)丁醇，和iii)不超过约0.5mM的DHMB0
54.制备重组宿主细胞的方法，包括: a.提供重组宿主细胞，`其包含编码具有醛脱氢酶活性或醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰；以及 b.用编码异丁醇生物合成途径的多肽的多核苷酸转化所述宿主细胞。
55.降低或消除异丁醛至异丁酸的转化的方法，包括: a.提供权利要求1-41中任一项的重组宿主细胞；以及 b.对所述宿主细胞施以条件，其中与并不包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的重组宿主细胞相比，所述异丁醛至异丁酸的转化是降低或消除的。
56.组合物，包含异丁醇和权利要求1-41中任一项的重组宿主细胞。
57.多肽，所述多肽与SEQ ID N0:29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、`59、61、63、65、417、419、421、423、425、427、429、431、433、434、435、436、437、438、439、440、`441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、`460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、`479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、`498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、`517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、.536、537、624、626、628、630、632、或它们的活性片段包含至少约90%同一性或至少约95%同一性或至少约99%同一性，其中所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性。
58.多肽，所述多肽与SEQID NO:417、419、421、423、425、或427、或它们的活性片段包含至少约90%同一性或至少约95%同一性或至少约99%同一性，其中所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性。
59.多核苷酸，其编码权利要求57或58的多肽。
60.将乙酰乳酸转化成2，3-二羟基异戊酸的方法，包括: a.提供权利要求57或58的多肽； b.在由此产生2，3-二羟基异戊酸的条件下，使a)的多肽与乙酰乳酸接触。
61.重组宿主细胞，包含权利要求57、权利要求58的异源多肽或权利要求59的多核苷酸。
62.重组酵母，包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，其中所述酵母产生小于0.01摩尔2，3- 二羟基-2-甲基丁酸(DHMB) /摩尔消耗的糖。
63.重组酵母，包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，其中所述酵母以小于约1.0mM/小时的速 率产生DHMB。
64.重组酵母，包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，其中所述酵母产生.2，3- 二羟基-3-异戊酸(DHIV)的量是所述产生DHMB的量的至少约1.5倍。
65.生产丁醇的方法，包括: a)使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，所述重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径；以及 b)测量DHIV和/或DHMB的浓度； 其中步骤a)和b)可同时进行或以任何顺序先后进行。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述测量包括液相色谱-质谱法。
67.提高酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的方法，包括:a)提供包含乙酰乳酸、KARI酶和乙酰乳酸还原酶的组合物，以及b)降低DHMB水平。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述降低DHMB水平是通过降低乙酰乳酸还原酶的酶活性而实现的。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述降低DHMB水平是通过从所述组合物中移除DHMB而实现的。
70.提高二羟酸脱水酶(DHAD)活性的方法，包括:a)提供包含二羟基异戊酸(DHIV)和DHAD酶的组合物，以及b)降低DHMB水平。
71.提高宿主细胞中KARI酶产率的方法，其中所述宿主细胞包含工程化的异丁醇生产途径，所述途径包含异源KARI酶和降低、破坏或消除乙酰乳酸还原酶表达或活性的至少一个遗传修饰，并且其中在DHMB存在下，所述KARI酶活性是降低的。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述KARI与大肠杆菌或乳酸乳球菌(L.1actis)的KARI具有至少约90%、至少约95%或至少约99%同一性。
73.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述降低、破坏或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性实质上降低所述DHMB的存在。
74.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，包含编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID N0:33、或35、或它 们的活性片段。
【文档编号】C12N15/61GK103827304SQ201280024903
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年3月23日 优先权日:2011年3月24日
【发明者】L.C.安东尼, K.J.吉布森, H.何, L.L.黃, D.P.奥基弗, A.L.克鲁科伯格, Y.李, L.A.马格基奥-哈尔, J.麦塞瓦恩, M.J.内尔森, R.帕特奈克, S.C.罗斯曼 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司