复壮细胞的方法

复壮细胞的方法【专利摘要】本发明涉及一种将来自老年供体的细胞或衰老细胞重编程为摆脱衰老标记的多能细胞的方法。特别是，本发明涉及由包含来自老年供体的细胞或衰老细胞的靶细胞群体制备诱导的多能干细胞(iPSC)的离体方法，所述方法包括下述步骤：在适合于将所述细胞重编程成iPSC的条件下培养所述靶细胞群体，其中所述合适的条件包括增加至少下述重编程因子在所述靶细胞中的表达：Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog。【专利说明】复壮细胞的方法【
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】[0001]本发明涉及一种将来自老年供体的细胞或衰老细胞重编程(reprogramming)为摆脱衰老标记的多能细胞的方法。特别是，本发明涉及用于由来自老年供体或衰老细胞的靶细胞群体制备诱导的多能干细胞(iPSC)的离体方法，所述方法包括下述步骤:在适合将所述细胞重编程为iPSC的条件下培养所述靶细胞群体，其中所述适合条件包括增加至少下述重编程因子的组合在所述祀细胞中的表达:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog。[0002]发明背景[0003]S.Yamanaka1’2发现诱导的多能干细胞(iPSC)以及iPSC技术的飞速发展已经开辟出自体再生医学的新途径，由此患者特异性的多能细胞可潜在地来源于成人体细胞。iPSC已经通过0CT4、S0X2、C-MYC和KLF4转录因子混合组的强制表达或通过用NANOG和LIN28代替KLF4和c-MYC的替代因子组合在不同细胞类型中可再现地获得3。[0004]细胞的衰老与生理老化有关，且其特征在于响应于各种应激刺激形式出现的稳定的细胞周期阻滞，包括致癌基因活化或称为复制性衰老的极短端粒9’'共同特征是这些细胞中ρ53/ρ21αρι和pRb/pl6Iffi4A肿瘤抑制途径的活化，其与形态的改变、衰老相关的β_半乳糖苷酶(SA-P-Gal)活性的增加、特定的SA分泌组(SASP)和衰老相关异染色质位点(SAHF)的形成有关，其被认为参与抑制促进细胞分裂的基因11。[0005]ΕΡ2096169公开了一种由体细胞产生诱导的多能干细胞的方法，其包括将下述六个基因引入体细胞中的步骤=Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog。然而，重编程因子的这种特定组合从来没有应用于衰老细胞或来自老年供体的细胞。[0006]近来若干研究小组已经描述:由于p53、pl6INK4A和ρ21αρ1的上调，细胞衰老是重编程的阻碍，这表明细胞老化可能是该技术的重要限制。因此，已经提出消除不同衰老效应物(senescenceeffector)作为提高iPSC产生效率的潜在解决方案4_8。[0007]TO2011/016588提出将p53的功能抑制剂与由0ct3/4、Sox2、Klf4、L_myc和Lin28组成的重编程因子混合组一起使用。p53shRNA用作p53的功能抑制剂。[0008]与现有技术中涉及衰老细胞重编程的技术偏见相反，本发明人如今证明，使用六个因子0CT4、NAN0G、S0X2、KLF4、c-MYC和LIN28的特定组合能够实现将增殖性的百岁老人的和衰老的成纤维细胞有效重编程为人iPSC，而不需要消除衰老效应物。[0009]此外，如在人胚胎干细胞(hESC)中所观察的，本发明人表明该重编程恢复了端粒尺寸、基因表达谱、氧化应激和线粒体代谢。令人吃惊地，来源于老化和衰老细胞的iPSC没有保留细胞老化表型的可检测标志物，且不能与hESC区分开。最终，再分化为成纤维细胞的iPSC显示出增加的增殖潜能以及与年轻增殖性成纤维细胞相当的基因表达谱，这表明根据本发明的重编程策略消除了细胞老化表型的印记，形成了产生复壮(rejuvenated)细胞的新方法。[0010]按照申请人:的理解，本发明首先描述了一种用来自老年供体的细胞或衰老细胞产生iPSC的方法，因此本发明可高度有利地应用于特别是自体再生医学，由此患者特异性的多能细胞可潜在地来源于成年期或衰老的体细胞，并且还将在研究领域中发现许多应用。此外，本发明可用作在体外或体内复壮衰老细胞或来自老年供体的细胞的一般方法。[0011]发明概述[0012]本发明的第一方面涉及一种用于由靶细胞群体制备诱导的多能干细胞(iPSC)的离体方法，所述靶细胞群体包含来自老年供体的细胞或衰老细胞或过表达pl6INK4A或ρ21αρ衰老效应物的细胞，所述方法包括下述步骤:[0013]a)提供包含来自老年供体的细胞或衰老细胞或过表达pl6INK4A或ρ21αρ衰老效应物的细胞的所述靶细胞群体，和[0014]b)在适合于将所述靶细胞群体重编程为iPSC的条件下培养所述靶细胞群体，其中所述适合的条件包括增加至少下述重编程因子的组合在所述靶细胞群体中的表达:[0015]1.由Oct家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0016]i1.由Klf家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0017]ii1.由Sox家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0018]iv.由Myc家族基因的一个基因编码的重编程因子；和[0019]V.Lin28；[0020]v1.和任选的Nanog。[0021]在优选的实施方式`中，所述合适的条件包括增加下述重编程因子在所述靶细胞群体中的表达:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或L_myc)、Lin28和任选的Nanog。在相关的实施方式中，所述合适的条件包括增加下述重编程因子在所述靶细胞群体中的表达:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或Lnyc)、Lin28和Nanog。[0022]本发明人表明，可通过本发明的方法完全除去衰老标记。因此，有利地，所述靶细胞群体可选自包含来自老年供体的成人体细胞或衰老细胞如衰老的成纤维细胞的细胞群体，或选自具有老年或衰老相关生理状态如早衰综合征的任何种类的细胞。在一个【具体实施方式】中，所述靶细胞群体是从至少为50岁、例如至少60、70、80、90或100岁的成人受试者，例如需要再生的自体细胞疗法的受试者，中获得的人细胞群体，显然不限制岁数，因为使用该策略有效地重编程了101岁供体的细胞群体。[0023]有利地，所述方法不包括任何直接沉默衰老效应物如ρ21αΡ1和/或pl6Iffi4a和/或Ρ53的步骤。特别是，所述方法可不包括ρ53的功能抑制剂如p53shRNA的任何使用。[0024]在一个实施方式中，增加以上所列的重编程因子的表达的条件包括:[0025](a)将一种或多种包含所述重编程因子的编码序列的表达载体引入所述靶细胞群体中；或[0026](b)将有效量的各重编程因子或其前体RNA直接递送入所述靶细胞群体。[0027]在一个【具体实施方式】中，本发明所述方法包括用病毒载体的组合转染所述靶细胞群体的步骤，各种病毒载体包含重编程因子0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或L_myc)、Lin28和任选的Nanog中各重编程因子的编码序列。[0028]本发明进一步涉及可通过如上所述方法获得的诱导的多能干细胞，特别地涉及可通过所述方法获得且从老化或衰老细胞获得的诱导的多能干细胞。[0029]本发明进一步涉及复壮来自老年供体的细胞或衰老细胞的体外方法，其包括通过增加至少下述重编程因子的组合在所述来自老年供体的细胞或衰老细胞中的表达将所述来自老年供体的细胞或衰老细胞重编程为诱导的多能干细胞:[0030]1.由Oct家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0031]?.由Klf家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0032]ii1.由Sox家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0033]iv.由Myc家族基因的一个基因编码的重编程因子；和[0034]V.Lin28；[0035]v1.和任选的Nanog。[0036]本发明进一步涉及一种在需要的受试者中复壮来自老年供体的细胞或衰老细胞的体内使用的组合物，所述组合包含用于增加下述重编程因子0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog在所述老化或衰老细胞中的表达的工具。[0037]在一个实施方式中，所述用于增加所述重编程因子的表达的工具包含0ct4蛋白、Klf4蛋白、Sox2蛋白、c-Myc蛋白、Lin28蛋白和任选的Nanog蛋白的组合,其中各种蛋白与将所述蛋白递送入待复壮细胞的细胞核中的适当工具相结合。[0038]或者，所述用于增加所述重编程因子的表达的工具可包含0ct4前体RNA、Klf4前体RNA、Sox2前体RNA、c-Myc前体RNA、Lin28前体RNA和任选的Nanog前体RNA的组合，其中各种前体RNA与将各种前体RNA递送入待复壮细胞的细胞质中的适当工具相结合。[0039]如上所述的本发明组合物可有利地适合于局部施用。[0040]发明详述[0041]本发明的第一方面涉及一种由靶细胞群体制备诱导的多能干细胞(iPSC)的离体方法，所述靶细胞群体包含来自老年供体的细胞或衰老细胞或过表达pl6INK4A或ρ21αρ衰老效应物的细胞，所述方法包括下述步骤:[0042]a)提供包含来自老年供体的细胞或衰老细胞或过表达pl6INK4A或ρ21αρ衰老效应物的细胞的所述靶细胞群体，和[0043]b)在适合于将所述靶细胞群体重编程为iPSC的条件下培养所述靶细胞群体，其中所述适合的条件包括增加至少下述重编程因子的组合在所述靶细胞群体中的表达:[0044]1.由Oct家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0045]i1.由Klf家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0046]ii1.由Sox家族基因的一个基因编码的重编程因子；[0047]iv.由Myc家族基因的一个基因编码的重编程因子；和[0048]V.Lin28,和，任选地[0049]v1.Nanog。[0050]如本文所使用，术语〃多能〃是指能够产生这样的后代的细胞，所述后代可以在适当的条件下经历分化以成为共同地表现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特性的细胞类型。多能干细胞可造成出生前、出生后或成人生物体的组织。标准的本领域公认的测试，如在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可用于确定细胞群体的多能性。然而，各种不同多能干细胞特征的鉴定也可以用来识别多能细胞。[0051]更具体地，人多能干细胞可表达至少一些，任选全部的下述非限制性列表的标志物:SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1,0ct4、Lin28、Rexl和Nanog0[0052]如本文所使用，术语〃诱导的多能干细胞〃是指以人工方式衍生自非多能细胞的多能干细胞。非多能细胞可以是自我更新和分化潜能比多能干细胞低的细胞。潜能低的细胞可以是，但不限于，体干细胞、组织特异性祖细胞、初级或次级细胞。本方法的一个显著的优点是，其能够由包括老化细胞或衰老细胞的任何体细胞产生诱导的多能干细胞，该老化细胞或衰老细胞由于其老化表型，之前被认为不可诱导至多能性。[0053]术语〃重编程〃是指由靶细胞中一小组因子(或重编程因子)的表达所引起的将革巴细胞的命运改变成不同细胞类型的命运的过程。例如，Takahashi和Yamanaka,2006已经描述了通过异位表达0ct3/4、Sox2、c-myc和Klf4将成纤维细胞重编程为诱导的多能干细胞的方法、[0054]因此，〃重编程因子〃是可用于重编程靶细胞的因子，例如其可以是转录因子。术语〃重编程因子〃进一步包括，就重编程能力而言，模拟所述因子的功能的任何类似物分子。[0055]用于本发明所述方法的靶细胞群体[0056]用于本发明所述方法的靶细胞群体有利地是包含来自老年供体的细胞或衰老细胞或过表达pl6Iffi4A或ρ21αρ衰老效应物的细胞的细胞群体。这些细胞可从活的或冷冻的动物组织获得。[0057]术语〃衰老细胞〃是指通常在细胞周期的Gl转变过程中或少数情况在G2过程中，呈现出由于端粒磨损造成的复制用尽(replicativeexhaustion)或响应于应激如DNA损伤、化疗药物或致癌基因的异常表达而引起的细胞周期阻滞的细胞。这种阻滞主要是通过P53的活化和细胞周期蛋白`依赖性激酶(⑶K)抑制剂？16皿43和ρ21αρι的上调来实施的(Collado等人，2007，Cell,130:223-233)。[0058]〃衰老细胞〃可以以至少一个或更多个下述特征来表征:[0059]-p53/p2Icipi和pRb/pl6INK4A肿瘤抑制物途径(以下称为衰老效应物)的活化，[0060]-Gl中不可逆阻滞的细胞，[0061]-端粒尺寸的变短，[0062]-衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表达，[0063]-作为衰老相关的异染色质位点(SAHF)的特定染色质修饰，[0064]-特定的分泌组，[0065]-降低/改变的整体线粒体活性。[0066]Gl中的不可逆细胞阻滞可如Matsuura等25所述通过FACS评价，其简要概括如下:[0067]为了分析细胞周期，在4°C下至少15分钟期间用冷却的709ffit0H固定胰酶化的细胞。离心固定的细胞，并在30分钟内用碘化丙啶(10yg/ml)加核糖核酸酶Α(250μg/ml)染色之前，在PBS中重悬,通过流式细胞仪例如使用FacsCaliburII(BDBiosciences)进行分析。[0068]例如，端粒尺寸的变短可例如通过以下实施例中描述的Southern印迹分析评价平均末端限制性酶切片段(TRF)长度来表征。[0069]用于检测衰老相关β_半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表达的方法描述在Matsuura等25中，其简要概括如下:[0070]如(Dimri等人，ProcNatlAcadSciUSA.1995年9月26日;92(20):9363-7)所描述的染色细胞培养物。简言之，在室温下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并用1%的多聚甲醛固定3分钟，然后在室温下用PBS洗涤三次，每次5分钟。使用含有40mM磷酸钠(二碱价的)、40mM柠檬酸、150mMNaCl、2mMMgCl2、5mM亚铁氰化钾、5mM铁氰化钾、lmg/mlX-gal(5-漠~4~氣-3-口引噪基-b-D-半乳糖昔，PierceChemicalC0.,Rockford,IL)的PH6的溶液，在37°C的非二氧化碳富集培育箱中进行过夜染色。分别在PBS和二甲基甲酰胺中加入来自新鲜制备的100X_储液的氰化物盐和X-gal。然后在显微镜检查和拍照之前，在室温下用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。[0071]通过间接免疫荧光检测衰老相关异染色质位点(SAHF)的表达的方法描述在以下实施例中。[0072]整体线粒体活性可通过测量由质子梯度产生的跨膜电位来评价。使用阳离子染料JC-1测量该参数的方法例如描述在以下实施例中。[0073]来自老年供体的细胞包含许多呈现衰老细胞的某些特征的增殖性细胞，特别是[0074]-肿瘤抑制物pl6INK4a和ρ21αρ1(以下称为衰老效应物)的上调，[0075]-降低的增殖能力，[0076]-全基因组CpG甲基化，[0077]-非预定的异染色质化。[0078]可使用本领域中用于测量蛋白质表达和/或mRNA表达的常用技术，例如Western印迹、Northern印迹或实时PCR来观察肿瘤抑制物pl6Iffi4a和ρ21αρι的上调。当与受控的(非衰老的)细胞例如胚胎干细胞相比，在测试细胞中观察到明显更高的？16皿43和ρ21αρι的表达时，则观察到上调。[0079]本发明人已经表明，来自老年供体(大于70岁)的增殖性的和衰老细胞具有与年轻供体的细胞不同的印记，例如就基因表达或代谢而言。根据所述方法获得的iPSC具有与胚胎干细胞更接近的印记，并且在这方面与由4种重编程因子0CT4、S0X2、c-MYC和KLF4的常规混合组得到iPSC有区别。[0080]根据申请人:理解，包括使用至少5种、优选6种特定的重编程因子的组合的本发明方法是本领域中描述用于由衰老细胞或老年供体的细胞产生诱导的多能干细胞的唯一方法。因此，本发明所述方法对较可能含有高比例的衰老细胞的细胞群体尤其有用。[0081]在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述靶细胞群体包含至少10%、20%、30%、40%或至少50%的显示出至少一种或多种(或全部)下述老化表型的特征的细胞:[0082]-肿瘤抑制物pl6INK4a和ρ21αρ1(以下称为衰老效应物)的上调，[0083]-Gl中不可逆阻滞的细胞，[0084]-衰老相关β_半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表达，[0085]-衰老相关异染色质位点(SAHF)的表达，[0086]-改变的整体线粒体活性。[0087]在另一个【具体实施方式】中，所述靶细胞群体是从至少50岁、例如至少60、70、80、90或至少100岁的成人受试者获得的细胞,如真皮细胞或成纤维细胞。[0088]此类靶细胞群体可从哺乳动物物种，优选啮齿动物、灵长动物或人类物种，更优选人类获得。[0089]所述靶细胞群体可从各种不同组织，优选来自需要自体再生治疗的老年人类患者的组织获得。[0090]从各种不同组织获得样品的方法和确立原代细胞的方法是本领域众所周知的(参见例如Jones和Wise,MethodsMolBiol.1997)?[0091]在一个【具体实施方式】中，所述靶细胞群体从来自血液、骨髓、脂肪组织、皮肤、毛发、皮肤附属物、内脏如心脏、肠或肝脏、间质组织、肌肉、骨、软骨或骨骼组织的原代细胞获得。[0092]用于复壮或产生iPSC的重编程因子的组合[0093]本发明的一个必要特征是使用用于从所述靶细胞群体复壮或诱导的多能干细胞的下述重编程因子组合:[0094]1.由Oct家族基因的一个基因，优选0ct4，编码的重编程因子；[0095]i1.由Klf家族基因的一个基因，优选Klf4，编码的重编程因子；[0096]ii1.由Sox家族基因的一个基因，优选Sox2，编码的重编程因子；[0097]iv.由Myc家族基因的一个基因，优选c_Myc，编码的重编程因子；[0098]V.Lin28,和，任选地[0099]v1.Nanog。[0100]用于由所述靶细胞群体如衰老细胞或来自老年供体的细胞复壮或诱导的多能干细胞的重编程因子组合可包括，例如5种重编程因子0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或L_myc)和Lin28的组合,或6种重编程因子0ct4、Klf4、Sox2、c_Myc(或L_myc)、Lin28和Nanog的组合。在一个优选的实施方案中，不使用P53的功能性抑制剂。[0101]如本文所使用，p53的功能性抑制剂是能够抑制(a)p53蛋白质的功能或(b)p53基因的表达的任何物质。此类物质例如描述在W02011/016588中。最特别地，本方法不包括使用表达对抗P53的siRNA或shRNA到所述靶细胞群体(例如衰老细胞)中的任何工具。[0102]如本文所使用，术语"Oct家族"是指在保持多能性中起关键作用的八聚体(〃0ct〃)转录因子家族。P0U5F1(P0U结构域，5类，转录因子1)，又名0ct3/4，是Oct家族的一个代表。在Oct-3/4+细胞如囊胚细胞和胚胎干细胞中不存在0ct3/4导致自发的滋养层分化，因而Oct-3/4的存在产生胚胎干细胞的多能性和分化潜能。示例性的0ct3/4蛋白是由鼠0ct3/4基因(基因库登记号NM_013633)和人0ct3/4基因(基因库登记号NM_002701)编码的蛋白。[0103]因此，术语"0ct3/4"、"0ct4"、"0CT4"、"0ct4蛋白〃、"0CT4蛋白〃等是指0ctomer4转录因子的任何天然存在的形式，或其保持0ct4转录因子活性(例如与野生型0ct4相比，根据本领域已知方法测定的活性为至少50%、80%、90%或100%)的变体。在一些实施方式中，与天然存在的0ct4多肽相比，变体具有相对于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它实施方式中，0ct4蛋白是由基因库参照号ADW77327.1确定的蛋白。[0104]如本文所使用，术语"Sox家族〃是指类似于Oct-3/4与保持多能性有关的Sox基因，虽然与仅仅在多能干细胞中表达的Oct-3/4相比，其与多能干细胞和单能干细胞有关。虽然Sox2是用于诱导的初始基因1A但已经发现Sox家族中其它基因也在诱导过程中起作用。Soxl以与Sox2类似的效率产生iPSC，并且基因Sox3、Soxl5和Soxl8也产生iPSC。[0105]示例性的Sox2蛋白是由鼠Sox2基因(基因库登记号NM_011443)和人Sox2基因(基因库登记号NM_003106)编码的蛋白。[0106]因此，本文所称的术语〃SOX2〃、〃S0X2〃、〃SOX2蛋白〃、〃S0X2蛋白〃等包括Sox2转录因子的任何天然存在的形式，或其保持Sox2转录因子活性(例如与野生型Sox2相比，根据本领域已知方法测定的活性为至少50%、80%、90%或100%)的变体。在一些实施方式中，与天然存在的Sox2多肽相比，变体具有相对于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它实施方式中，Sox2蛋白是由NCBI参照号NP_003097.1确定的蛋白。[0107]如本文所使用，术语"Klf家族〃是指最初鉴定为用于产生小鼠iPSC的因子以及还证明是用于产生人iPSC的因子的Klf基因。示例性的Klf4蛋白是由鼠klf4基因(基因库登记号NM_010637)和人klf4基因(基因库登记号NM_004235)编码的蛋白。[0108]因此，本文所称的术语〃KLF4〃、"KLF4蛋白〃等包括KLF4转录因子的任何天然存在的形式，或其保持KLF4转录因子活性(例如与野生型KLF4相比，根据本领域已知方法测定的活性为至少50%、80%、90%或100%)的变体。在一些实施方式中，与天然存在的KLF4多肽相比，变体具有相对于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一'丨生。在其它实施方式中，KLF4蛋白是由NCBI参照号NPJKM226.3确定的蛋白。[0109]如本文所使用，Myc家族的因子是指由涉及癌症的myc原癌基因编码的因子。c-Myc被证明是涉及产生小鼠iPSC和人iPSC的因子。示例性的c_Myc蛋白是由鼠c_myc基因(基因库登记号NM_010849)和人c-myc基因(基因库登记号NM_002467)编码的蛋白。N-Myc或L-myc也用作替代c_Myc的可能的重编程因子。[0110]因此，本文所称的术语〃C-MyC〃、〃C_MYC〃、〃c-Myc蛋白〃、〃C_MYC蛋白〃等包括cMyc转录因子的任何天然存在的形式,或其保持cMyc转录因子活性(例如与野生型cMyc相比，根据本领域已知方法测定的活性为至少50%、80%、90%或100%)的变体。在一些实施方式中，与天然存在的c-Myc多肽相比，变体具有相对于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它实施方式中，c-Myc蛋白是由NCBI参照号NP_002458.2定确的蛋白。[0111]术语"Nanog"或"nanog"是指与未分化的胚胎干细胞的自我更新密切相关的转录因子。在人类中，该蛋白质由NANOG基因编码。示例性的nanog是由鼠基因(基因库登记号XM_132755)和人Nanog基因(基因库登记号NM_024865)编码的蛋白。[0112]因此，本文所称的术语"Nanog"或"nanog"等包括Nanog转录因子的任何天然存在的形式，或其保持Nanog转录因子活性(例如与野生型Nanog相比，根据本领域已知方法测定的活性为至少50%、80%、90%或100%)的变体。在一些实施方式中，与天然存在的Nanog多肽相比，变体具有相对于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一'丨生。在其它实施方式中，Nanog蛋白是由NCBI参照号NP_079141确定的蛋白。[0113]术语"Lin28"或"Lin_28同源物A"是由人类中的LIN28基因编码的蛋白质。其是未分化的人胚胎干细胞的标志物，并编码结合并增强IGF-2(胰岛素样生长因子2)mRNA的翻译的细胞质mRNA结合蛋白。Lin28还被证明结合let_7前体miRNA,并阻断小鼠胚胎干细胞中成熟let-7微RNA的产生。Yu等人表明其是iPSC产生中的因子，尽管其不是强制性的3。示例性的Lin28是由鼠基因(基因库登记号NM_145833)和人Lin28基因(基因库登记号NM_024674)编码的蛋白。[0114]因此，本文所称的术语〃Lin28〃或〃Lin28同源物A"等包括Lin28转录因子的任何天然存在的形式，或其保持Lin28转录因子活性(例如与野生型Lin28相比，根据本领域已知方法测定的活性为至少50%、80%、90%或100%)的变体。在一些实施方式中，与天然存在的Lin28多肽相比，变体具有相对于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它实施方式中，Lin28蛋白是由NCBI参照号NP_078950确定的蛋白。[0115]如本文所使用，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是所述序列所共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性=相同位置#/总位置#X100)，考虑为了所述两个序列的最佳比对而需要引入的空隙数和每个空隙的长度。如下所述，序列对比和两个序列之间的同一性百分比的测定可使用数学算法来实现。[0116]两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用PAM120权重残差表(weightresiduetable)、空隙长度罚分12和空隙罚分4，利用已经整合到ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和V.Miller的算法(Comput.Appl.Biosc1.,4:11-17，1988)来测定。[0117]本领域技术人员可选择来源于其它哺乳动物如小鼠、大鼠、牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊和狗的其它相应重编程因子。本领域技术人员可有利地选择来自与本发明方法中用作原材料的靶细胞相同的物种的相应重编程因子。[0118]本领域技术人员也可选择一种或多种上述重编程因子的类似物。如本文所使用，术语"类似物"是指具有不同结构但提供与用于产生iPSC的重编程因子相同的结果的化合物，且因而可在产生诱导的多能干细胞的方法中替代所述重编程因子。[0119]例如，此类重编程因子的类似物已经在WenlinLi和ShengDing,TrendsinPharmacologicalSciences第31卷,第I期,2010年I月,36-45页，或Feng等.CellStemCell.2009年4月3日;4(4):301-12(特别参见Feng等人，2009的表1和2中公开的类似物)中描述。[0120]增加重编程因子表达的条件[0121]本领域现有的用于增加重编程因子表达的任何条件可用于本发明的方法中，只要此类条件导致存在适当量的用于将所述靶细胞重编程为诱导的多能干细胞的重编程因子。[0122]在本领域中已经描述了用于增加重编程因子表达的各种方法。对于综述，参见HannaJH,SahaK,JaenischR.Cell.2010年11月12;143(4):508-25；或ShengDing.TrendsinPharmacologicalSciences第31卷，第I期，2010年I月，36-45页；和Feng等.CellStemCell.2009年4月3日;4(4):301-12。[0123]在优选的实施方式中，下述可选方式可用于增加所述重编程因子的表达:[0124](i)增强编码所述重编程因子的基因的内源性表达，[0125](ii)通过将包含可操作地与控制序列连接的所述重编程因子的编码序列的表达载体引入靶细胞群体中而使所述重编程因子异位表达，或[0126](iii)将适量的所述重编程因子或其前体RNA递送入所述细胞。[0127]在另一个实施方式中，使用一种或多种表达载体，其包含重编程因子组合的编码序列，例如0ct4编码序列、Sox2编码序列、Klf4编码序列、c~Myc编码序列、Lin28编码序列和任选的Nanog编码序列和/或具有与0ct4、Sox2、Klf4>c_Myc、Lin28和任选的Nanog的相应天然编码序列的至少60%、70%、80%、90%或95%同一性的编码序列。[0128]如本文所使用，术语"编码序列"是指在转录时产生编码产物的核苷酸序列。根据本发明，所述编码序列的转录可结合适当的启动子而容易地实现。优选所述编码序列对应于在转录时产生重编程因子的基因的cDNA序列。[0129]可使用例如用于核酸序列的算法如BLASTN程序，使用作为默认值的字长(W)ll、期望值(E)10、M=5、N=4及两条链的对比来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。[0130]用于异位表达所述重编程因子的表达载体可以是，例如质粒载体、粘粒载体、人造细菌染色体(BAC)载体、基于转位子的载体(如PiggyBac)或病毒载体。[0131]在一个【具体实施方式】中，用于增加所述重编程因子的表达的表达载体是病毒载体。此类病毒载体的实例包括，但不限于，来源于诸如HIV(人免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒),ASLV(禽肉瘤/白血病病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳氏肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳房肿瘤病毒)等的逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒和单纯疱疫病毒的载体。[0132]在本领域中已经描述了基于编码重编程因子的表达载体产生诱导的多能干细胞的方法，例如参见W02007/69666、EP2096169A1或W02010/042490。[0133]典型地，用于本发明所述方法的任何重编程因子的编码序列，例如0ct4编码序列、Sox2编码序列、Klf4编码序列、c~Myc编码序列、Nanog编码序列和/或Lin28编码序列，可以可操作地连接能够引起编码序列在靶细胞群体中的表达的控制序列，例如启动子。此类表达载体可进一步包括控制其表达的调控元件，如启动子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子。所述启动子可以是组成型的或诱导型的。所述载体可以是自我复制的或可以整合到宿主细胞的DNA中。[0134]或者，用于异位表达的载体是病毒载体，产生的病毒颗粒用于将所述重编程因子的编码序列引入包含老化或衰老细胞的所述靶细胞群体中。术语“病毒颗粒”意图指含有病毒结构蛋白和编码所述重编程因子的序列的颗粒。[0135]病毒颗粒可通过用携带所述重编程因子组合的核苷酸编码序列的病毒载体转化或转染包装细胞来制备。在以下实施例中，由慢病毒制备病毒颗粒。[0136]然后，可使用如上所述的`表达载体转染所述靶细胞群体。[0137]术语〃转染〃或〃转染〃是指将核酸分子引入细胞中的过程。所述核酸分子可以是编码完整蛋白或其功能部分的基因序列。任何适当的转染方法均可用于本文描述的方法。[0138]将所述编码序列以及其控制序列直接引入所述靶细胞的基因组中可分别引起致癌基因或肿瘤抑制基因的活化或失活突变。对于某些应用，特别是医学应用，可能要求避免靶细胞的任何遗传改变。[0139]在第三实施方式中，将所述重编程因子如0ct4、Sox2、Flk4、c_Myc、Nanog和Lin28，或相应的编码DNA或RNA，引入宿主DNA中未整合外源性遗传材料的靶细胞中，即不将核苷酸序列引入细胞的基因组中。[0140]表达载体如质粒载体能够以裸DNA形式递送到所述细胞中用于异位表达所述重编程因子。或者，经化学修饰的或未修饰的编码所述重编程因子的RNA可引入所述细胞中以重编程它们(参见例如WarrenL等，2010，CellStemCell.11B5H;7(5):618-30)?[0141]例如在W02009115295中已经描述了其它表达载体。[0142]这些核酸可借助于例如脂质体或阳离子聚合物，例如使用哺乳动物细胞中的常规转染方案而递送入所述靶细胞。[0143]特别是，不使用病毒DNA或病毒颗粒作为递送体系以将核酸分子引入所述靶细胞的适当转染方法可用于本文所描述的方法中。示例性的转染方法包括但不限于，磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声致穿孔(sonoporation)、通过热冲击转染、磁转染和电穿孔。在一些实施方式中，按照本领域众所周知的标准程序，使用电穿孔将核酸分子引入所述靶细胞。[0144]或者，重编程因子蛋白或在靶细胞的重编程方面显示出与完整蛋白质类似特性的其片段可借助于化学载体递送入所述靶细胞，所述化学载体例如细胞渗透性肽包括但不限于渗透或TAT源的肽。[0145]本领域中也已经描述了提高产生iPSC的效率的方法。特别是，在本发明所述方法中，可进行各种广生效率提闻剂的引入和/或加入。用于提闻广生iPSC的效率的物质的实例包括但不限于,组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如丙戊酸、曲古抑菌素A(trichostatinA)、乳酸钠、MC1293和M344)、核酸表达抑制剂如用于HDAC的siRNA和shRNA、G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂和核酸表达系统抑制剂如用于G9a的siRNA和shRNA(也参见Feng等人，2009，上文)。[0146]在一个【具体实施方式】中，根据本发明所述方法不包括任何直接沉默衰老效应物、特别是直接沉默P53效应物的步骤。[0147]〃直接沉默〃表示使用直接作用于目标基因例如p53基因的表达而不是作用于上游因子的物质。一种沉默基因的方法是使用直接针对待抑制的基因序列的siRNA或shRNA。[0148]包含可由本发明所述方法获得的iPSC的组合物[0149]本发明进一步涉及基于细胞的组合物(以下称为"iPSC组合物〃)，其包含可由如上所述方法获得的iPSC和药学上可接受的载体。值得注意的，根据本发明的iPSC没有老化表型的特征，尽管其源于来自老年供体的细胞或衰老细胞。[0150]这些iPSC组合物典型地可包含从患有年龄有关的疾病如由缺陷性解旋酶所引起的疾病的患者获得的iPSC，所述疾病包括沃纳综合征、科克因综合征、罗特穆德-汤姆逊综合征、布卢姆综合征、着色性干皮病和毛发低硫营养不良，或从患有包括但不限于早衰综合征(Hutchinson-Gifordprogeria)或威德曼劳滕施特劳赫综合征的其它障碍的患者获得的iPSC。[0151]通过可由本发明所述方法获得的iPSC的分化获得的细胞组合物及其用途[0152]由本发明所述方法，特别是从老年供体的细胞获得的iPSC可有利地在分化条件下体外培养，以产生分化的细胞，如肌肉、软骨、骨、真皮组织、心脏或脉管组织，或其它目标组织。[0153]因此，本发明涉及用于制备包含分化细胞的组合物的方法，所述方法包括下述步骤:[0154](a)提供包含由本发明所述方法从老年供体的靶细胞获得的iPSC细胞的组合物；和，[0155](b)在适合于将iPSC细胞分化成期望的细胞谱系的条件下，培养所述包含iPSC细胞的组合物。[0156]本领域技术人员可使用用于将干细胞分化成期望的细胞谱系的已知方法，所述干细胞例如诱导的多能干细胞、ES细胞或间质干细胞。[0157]本发明的另一个方面涉及包含源于iPSC分化的所述细胞谱系(以下称为本发明的分化细胞)的所述组合物的用途。[0158]虽然来源于老年供体例如大于70岁的供体的细胞，本发明的分化细胞的特性在于具有复壮表型，例如关于端粒的尺寸、基因表达谱、代谢和衰老表型出现前的细胞周期数。因此，本发明的分化细胞可用于各种应用，特别是用于研究或治疗领域。[0159]一个主要的应用领域是细胞疗法或再生医学。这些iPSC或分化细胞的组合物还可用于产生如上所述年龄相关疾病的细胞模型。[0160]例如，原代细胞如从患有遗传缺陷的患者中获得的成纤维细胞，可根据本领域已知的方法培养和遗传校正，并随后根据本发明的方法重编程和复壮为iPSC，并分化成用于再适合的细胞谱系用于施用到患者体内，例如与细胞供体相同的患者(自体治疗)。[0161]类似地，通过直接体内植入包含iPSC或其含适当的祖细胞或细胞谱系或本发明的分化细胞的衍生物的组合物在体内再生损伤的组织，再生医学可潜在地用于治愈由机能障碍、损伤或衰竭组织引起的任何疾病。优选此类损伤组织是由老化相关的疾病损伤的组织或来自大于50、60、70、80、90或大于100岁的老年患者的组织。[0162]在一个方面，本发明的iPSC细胞或分化细胞可用于患有年龄相关疾病的患者或由于特定疾病需要再生治疗的老年患者的自体再生治疗或与此类疾病相关的治疗，所述疾病包括但不限于癌症疾病、炎症性和自身免疫性疾病、肌肉和骨骼疾病、神经疾病、糖尿病及其他代谢疾病。[0163]因此，在一个方面，本发明涉及用作植入哺乳动物例如人类患者中的细胞治疗产品的本发明所述iPSC组合物或分化细胞,所述人类患者优选是大于50、60、70、80、90或大于100岁的老年患者，最优选作为自体移植(即所述细胞具有与所述患者的细胞相同的基因型)。[0164]在另一个【具体实施方式】中，本发明所述iPSC组合物或分化细胞用于治疗关节或软骨、肌肉或骨损伤。[0165]在另一个【具体实施方式】中，本发明所述iPSC组合物或分化细胞也可有利地用于产生用于再生医学(基于细胞的疗法)或研究中的真皮组织例如皮肤组织。[0166]在另一个【具体实施方式】中，本发明所述iPSC组合物或分化细胞也可有利地用于制药工业中从健康或患病的患者产生包括但不限于真皮、肌肉或骨骼细胞用于筛选应用。此类筛选试验可用于寻找具有临床应用的新药或用于毒理学试验。[0167]在另一个【具体实施方式】中，本发明所述iPSC组合物或分化细胞还可用于再生心脏或脉管组织。[0168]在另一个【具体实施方式】中，本发明所述iPSC组合物或分化细胞还可用于例如在患有神经退行性疾病的患者中再生脑组织或神经组织。[0169]复壮靶细胞的方法[0170]在另一个方面，本发明涉及复壮来自老年供体的细胞或衰老细胞的方法。[0171]特别是，本发明涉及复壮来自老年供体的细胞或衰老细胞的体外方法，所述方法包括通过增加至少下述重编程因子在所述靶细胞中的表达来将所述靶细胞重编程为诱导的多能干细胞:[0172](i)由Oct家族基因的一个基因编码的重编程因子，例如0ct4；[0173](ii)由Klf家族基因的一个基因编码的重编程因子，例如Klf4;[0174](iii)由Sox家族基因的一个基因编码的重编程因子，例如Sox2；[0175](iv)由Myc家族基因的一个基因编码的重编程因子，例如c-myc或L_myC;和[0176](v)Lin28；[0177](vi)和任选的Nanog。[0178]术语〃复壮〃是指清除参与细胞老化表型的后遗传修饰的过程。细胞老化表型可特别通过下述标志物来表征:[0179]-p53/p2Icipi和pRb/pl6INK4A肿瘤抑制物途径(以下称为衰老效应物)的活化，[0180]-Gl中不可逆阻滞的细胞，[0181]-端粒尺寸的变短，[0182]-衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表达，[0183]-作为衰老相关异染色质位点(SAHF)的特定染色质修饰，[0184]-特定的分泌组，[0185]-降低/改变的整体线粒体活性。[0186]当一个或所有这些老化表型的标志物由于所述复壮过程在老化或衰老细胞类型中被减少或抑制时，观察到复壮过程。[0187]在一个优选的实施方案中，复壮来自老年供体的细胞或衰老细胞的体外方法包括:在适合增加下述由0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog组成的重编程因子组合的表达的条件下，培养所述来自老年供体的细胞或衰老细胞。[0188]所述重编程因子的组合可体内用于复壮需要的受试者的组织。因此，本发明进一步涉及一种在需要的受试者中复壮衰老细胞或老化细胞的体内使用的组合物，所述组合物包含用于增加下述由0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog组成的重编程因子组合的表达的工具。[0189]在一些实施方式中，所述用于增加所述重编程因子的表达的工具包含适量的0ct4蛋白、Klf4蛋白、Sox2蛋白、c-Myc蛋白、Lin28蛋白和任选的Nanog蛋白，每种蛋白与将所述蛋白递送入待复壮的衰老细胞的细胞核中的适当工具相结合。[0190]将蛋白质递送入细胞的工具包括但不限于，化学载体如细胞渗透性肽，例如渗透或TAT源的肽。[0191]在其它实施方式中，所述用于增加所述重编程因子的表达的工具包含适量的0ct4前体RNA、Klf4前体RNA、Sox2前体RNA、c-Myc前体RNA、Lin28前体RNA和任选的Nanog前体RNA，其与将各种前体RNA递送入待复壮的衰老细胞的细胞质中的适当工具相结合。[0192]如上所述的这些组合物特别适合于局部施用，例如皮肤或真皮施用，例如用于治疗皮肤疾病。[0193]本发明将通过下述实施例进一步说明。然而，这些实施例无论如何不应该解释为限制本发明的范围。实施例:[0194]方法[0195]从科里尔医学研究所(NJ，USA)获得来自老年供体的细胞。通过深度细胞培养直至细胞周期生长阻滞(通过FACS评估)来获得复制性衰老细胞，并如之前所述25检测衰老相关半乳糖苷酶活性。[0196]H9和Hl人胚胎干细胞从WiCell研究所(WI，USA)获得。使用标准hESC程序，将hESC和iPSC维持在KODMEM培养基(hESC培养基)中的丝裂霉素-C处理的OF-1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，所述KODMEM培养基补充有20%的KnockOut血清替代品、0.1mM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺(全部来自Invitrogen)、0.ImM?-巯基乙醇和10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，PepiOtech)，或者以无饲养层培养方式维持在具有化学限定的mTeSR培养基(Stemcell技术)的基质胶(BDBiosciences)上,如之前所述26。[0197]对于人iPSC的产生，含有人0CT4、S0X2、NANOG和LIN28基因的cDNA的慢病毒载体从Addgene并且如之前Yu等所述3获得。由Takahashi等2’3描述的载体，将KLF4和c_MYCcDNA亚克隆到相同的载体骨架中。293T细胞系(Invitrogen)用来产生表达转基因的慢病毒。在转导的前一天，将人原代成纤维细胞以每个35mm平皿2XIO5个细胞接种。将含有六种慢病毒的各种的上清液的等量混合，转移到成纤维细胞平皿，并孵育过夜。转导后24小时，用第二上清液替换含有慢病毒的培养基。转导后6天，通过胰蛋白酶化收获成纤维细胞，并再平铺在IOOmm平皿中MEF饲养层上。第二天，用补充有10ng/ml的bFGF的hESC培养基替换所述培养基。每隔一天更换培养基。在转导后30-40天，挑取克隆并转移到35mm平皿中具有2ml补充有10ng/ml的bFGF的hESC培养基的饲养层上。[0198]结果[0199]通过连续传代，将74岁供体的增殖性人二倍体成纤维细胞(以下称74P)诱导为复制性衰老(74S)。通过FACS分析评估18代(51群体倍增数)后的细胞衰老，SA-β-Gal活性的提高，⑶K抑制剂pl6Iffi4A和ρ21αρι的上调和SAHF的形成。将这些衰老细胞也维持在培养物中2个月以上，而在细胞数量上没有任何可检测的增加，证实细胞周期阻滞的稳定性。我们最初尝试通过含LIN28的基因组(0CT4、NANOG,S0X2、LIN28)的过表达由这些衰老的成纤维细胞产生iPSC，以与所公开的采用4个重编程因子0CT4、S0X2、KLF4、c-MYC的组并最初描述为对衰老回避无效的先前的试验结果进行比较。通过单个慢病毒转导所有这些重编程因子基因。40天后，我们未观察到类似iPSC的任何新的增殖或hESC集落的形成。这通过感染细胞群体中不存在内源多能性基因的可检测表达得到确认，而定量RT-PCR证明了有效的病毒转导。这些结果表明，含LIN28的重编程因子组不能如之前使用0CT4、S0X2、KLF4、c-MYC组合所描述的逆转复制性衰老状态以产生iPSC。[0200]有趣地，NANOG过表达已经描述为以主要与细胞分裂速度无关的方式加速重编程，并且类似于ρ53/ρ21αρι途径的抑制，LIN28的过表达增加了细胞分裂速度，导致iPSC产生的加速动力学13，14。因此，我们假设，衰老障碍可使用基于由单个慢病毒颗粒引入的6个重编程因子0CT4、NAN0G、S0X2、KLF4、LIN28和c_MYC的组合为提高重编程效率而优化的方案来克服，而不需要衰老诱导物的另外的暂时或永久抑制。[0201]为了检验我们的假设，用携带所述6个基因的各基因的单个慢病毒的混合物两次感染74P和74S细胞。感染后一周，我们观察到在感染的衰老成纤维细胞(74Sinf)中SAHF的消失，这表示重编程的第一步。然后，将细胞接种在hESC培养基中小鼠成纤维细胞的饲养层上，且18-20天后，感染的衰老细胞中增殖恢复。类似于hESC的集落在感染后35-40天出现。由衰老的成纤维细胞(74S)以0.015-0.03%的平均重编程效率(类似于在相同的条件下感染的增殖性成纤维细胞(74P))来产生iPSC样集落。我们从增殖的(iPSC74P)和衰老的(iPSC74S)74岁供体成纤维细胞中随机选择6个集落，并进一步鉴定3个克隆，其然后在常规的hESC饲养层或无饲养层培养条件下成功扩增。长期培养和干细胞标志物表达的评估确认这些细胞的成功维持和重编程，其如今已经生长了35代以上。免疫细胞化学分析证明了表征人多能干细胞的细胞表面标志物SSEA-4和TRA-1-60的连续存在。定量RT-PCR分析表明，iPSC以与Hl和H9hESC系或汤姆逊实验室产生并平行生长的MR90克隆4iPSC系(iPSCIMR90THC143)相同的水平重新表达内源性0CT4、S0X2、NANOG和REXl多能标志物基因，而在亲本成纤维细胞中未检测到转录物。为了证实该内源性基因的这种再活化，我们研究了在0CT4和NANOG启动子中一个所描述的富CpG区域中CpG二核苷酸的DNA甲基化状态。亚硫酸氢盐基因组测序分析表明，当与hESCH9的甲基化状态相比时，0CT4和NANOG启动子两者在来自衰老的细胞(iPSC74SClF)或增殖的细胞(iPSC74PClH)的iPSC中脱甲基，与之前公布的iPSCIMR90THC143—样有效，而在亲本成纤维细胞中相同的区域被高度甲基化。[0202]为了排除任何细胞类型特异性的效应，我们使用通过连续传代诱导复制性衰老的IMR90人胚胎成纤维细胞重复相同的方案。类似于74岁供体的成纤维细胞，我们使用之前描述的4个因子的组未能成功产生iPSC，而我们使用所述6个因子的组合由增殖的或衰老的IMR90成纤维细胞获得了类似的重编程效率。[0203]接下来，我们通过与iPSC74P克隆相比较评价iPSC74S的分化能力，来评估我们产生的iPSC的多能性状态。如使用分别抗SMA、MAP2和F0XA2的特异性抗体的免疫染色所表明的，全部iPSC能够分化成三种早期胚胎谱系:内胚层、外胚层和中胚层。我们用衰老的IMR90成纤维细胞获得了类似的结果。总而言之，这些结果表明，6个转录因子0CT4、NAN0G、S0X2、KLF4、LIN28和c_MYC的组合是逆转细胞衰老状态从而导致产生iPSC的成功重编程策略。[0204]在老化过程中，人体内衰老细胞的数量增加，这认为会损害组织动态平衡。然而，ρ16ΙΝΚ4?^Ρρ21αρι的表达增加出现在来自老年供体的增殖细胞中，这认为进行性地降低了其增殖能力15。来自百岁老人的增殖细胞是否可有效地重编程为多能性，以及它们是否保持细胞老化表型的一些特异性标志物，是未解决的问题。为了研究这些特定的问题，我们通过组合使用所述6个因子，将来自92、94、96和101岁供体的成纤维细胞用于重编程实验。如我们先前的衰老细胞实验所表明的，我们能够从全部老年供体的成纤维细胞产生iPSC，其具有与由衰老的成纤维细胞得到的那些类似的效率。全部iPSC克隆产生重新表达的内源的多能性基因0CT4、S0X2、NANOG和REX1，如对于每个亲本成纤维细胞系的两个克隆所呈现的，这也通过0CT4和NANOG启动子区域中CpG的脱甲基化而得到确认。有趣地，我们还在来自老年供体的亲本成纤维细胞中观察到NANOG启动子的部分脱甲基化(这与在老年人中已描述的基因组的总体脱甲基化一致16)，其也可能在重编程中具有促进效应。此外，我们检测到多能性细胞表面标志物SSEA-4和TRA-1-60的重新表达，且最终如分别使用SMA、MAP2和F0XA2抗体的免疫染色所判定的，我们证明其具有分化成内胚层、外胚层和中胚层衍生物的能力。[0205]这些结果表明，我们的重编程方法成功地从百岁老人成纤维细胞恢复多能性状态和自我更新的效力；因此，细胞老化和通常相关的衰老表型不是对重编程为多能性的限制。[0206]虽然我们使用老年供体和衰老的成纤维细胞成功产生iPSC，关键问题是阐明多能性状态的诱导是否可清除细胞老化表型的主标志物。我们之前表明重编程导致SAHF消失，这证明衰老细胞的基因组组织的可塑性。然后，我们分析在我们的iPSC中老化和衰老的其它印记，并且如通过免疫印迹分析所示，发现由来自74岁供体的复制性衰老的成纤维细胞产生的iPSC未保持从其先前衰老的状态继承的提高的ρ21αρι和pl6Iffi4A表达。用MR90胚胎复制性衰老的成纤维细胞也获得了类似的结果。此外，从百岁老人产生的全部iPSC也具有类似于hESC系的下调的ρ21αρι和pl6Iffi4A蛋白表达。这些结果表明我们能够将ρ21αρι和ρ16ΙΝΚ4Α的表达重置至在hESC中发现的低水平。[0207]来自老年供体的增殖性成纤维细胞通常以具有不均匀尺寸为的端粒特征，其平均长度取决于亲本遗传的尺寸和在寿命期限中发生分裂的不同次数，但其与增殖能力没有必然关联。然而，复制性衰老总是与短的端粒有关。短的端粒被认为是损伤的DNA，导致DNA损伤响应信号传导级联的激活并触发衰老相关的细胞周期阻滞。虽然与亲本分化的细胞相比iPSC通常呈现增加的端粒尺寸17，但我们想知道从衰老细胞或百岁老人的细胞获得的iPSC是否呈现出具有增加长度的端粒。为了解决该问题，我们使用Southern印迹分析来检验从复制性衰老细胞获得的iPSC的平均末端限制性酶切片段(TRF)长度，与增殖性细胞进行比较。我们发现，来自74岁的供体(来自增殖性或衰老细胞)的iPSC的端粒长度增加到与在H9hESC中观察到的那些相当的尺寸。不同于50群体倍增数后进入复制性衰老的亲本成纤维细胞，对于胚胎成纤维细胞頂R90为60-63倍增数，我们能够连续地培养所有iPSC系，其在超过110群体倍增数后仍保持稳定。类似地，重编程后，来源于衰老的或增殖性IMR90胚胎成纤维细胞的iPSC中端粒DNA长度增加。虽然来自百岁老人的端粒在尺寸上比在衰老的成纤维细胞中变短较少，但我们能够将其尺寸重置至与hESC相同的长度。有趣地，在一些iPSC克隆中，我们发现比H9hESC中发现的更长的上限尺寸，表明多能细胞中的端粒尺寸不具有遗传的最大尺寸。还表明在iPSC产生中对于分化细胞增殖能力增加的一些可能的额外发展，适合于再生医学中的细胞基疗法。[0208]总体来说，这些数据强调，我们的重编程方法导致所产生的iPSC中衰老和老化的最常见标记的清除。`[0209]为了进一步评价衰老和老化的衍生iPSC的多能性能力，我们从老化的增殖性和衰老的成纤维细胞中选择3个iPSC克隆:iPSC74PClH、iPSC74SClF和iPSC96Cll。我们首先确认这些克隆通过在小鼠中形成畸胎瘤进展到终末分化的完全能力，导致在三个胚胎谱系中组织化器官样结构的出现。此外，进行DNA指纹分析(短串联重复，STR)以确认iPSC克隆来源于其相应的亲本成纤维细胞。我们还证实用于所述重编程的6个转基因几乎完全下调。[0210]然后，我们进行所选择的3个克隆及其亲本对应物的转录组分析，我们与hESC和iPSC数据集(构建为纲要(18))对比。我们首先确认，在我们的iPSC中，特定的多能基因以与来自所述纲要的hESC和iPSC类似水平表达(19)。然后，我们进行我们的3个iPSC克隆及其亲本成纤维细胞与若干hESC、iPSC和出生后成纤维细胞组合的分层聚类。惊人地，我们发现，与出生后的成纤维细胞相比，增殖性的、衰老的和老化的成纤维细胞聚类在一起，这表明它们共有总体共同的老化印记。此外，与之前描述的来源于4个因子感染的iPSC相t匕，使用所述6个因子的感染获得的来自增殖性和衰老的老化成纤维细胞的衍生iPSC明显更类似于hESC。[0211]由于在衰老和老化方面很好地描述了氧化应激和线粒体功能障碍2°’21，我们想知道这些功能是否也特别地从衰老和老化细胞重编程。如之前所述22，转录组分析允许我们研究涉及两个过程的基因。再一次，当与年轻的增殖性胚胎或出生后成纤维细胞相比时，具有该特定基因亚组的转录组的聚类表明，在与这些改变的功能相关的表达谱的总体变化对老化和衰老的成纤维细胞是特异性的，而且我们的衍生iPSC将这些功能重置至胚胎样状态。接着，通过测量由质子梯度产生的跨膜电位(ΛΨΠ1)，我们评价了与hESC相比时衍生iPSC中的整体线粒体活性，其是健康的线粒体功能的指示。为此目的，我们使用阳离子染料JC-1，并通过共焦显微术和流式细胞分析来定量其两种形式的荧光强度比。如之前所示，红/绿比率随衰老而降低2°’21，并且还似乎与老化有关。惊人地，我们发现，iPSC中比例增加至类似于hESC中发现的水平，证实重编程恢复了来源于老年和衰老的成纤维细胞的iPSC的线粒体活性。由来自增殖性或衰老的IMR90成纤维细胞的iPSC得到了类似的结果。此外，当与HlhESC相比时，我们通过电子显微测定法未观察到iPSC中线粒体分布和形态的差异。线粒体特性的分析表明，在重置基因表达程序中，核重编程可如何通过恢复其功能障碍涉及细胞老化的细胞器的受损功能而复壮为健康的细胞生理学。最终，使用成纤维细胞分化试验23’24，我们证明这些细胞未过早地进入衰老。实际上，10群体倍增数之后，来源于74P、S和96iPSC的成纤维细胞未显示SA-P-Gal活性，并呈现出与年轻的增殖性成纤维细胞相当的增殖速度。为了排除我们的重编程策略不与衰老诱导途径中任何突变相关的可能性，我们证明了重分化的成纤维细胞再进入复制性衰老的能力。在深度培养之后，如通过增加的与细胞周期阻滞相关的SA-β-Gal活性、pl6INK4A和ρ21αρι的表达再增加以及再变短的端粒尺寸所示的，这些细胞变衰老。更有趣地，增大了触发复制性衰老所需的群体倍增数(PD)。尽管在51Η)之后，74岁的亲本成纤维细胞进入复制性衰老，来自iPSC74SClF的再分化成纤维细胞只是在58H)后才进入复制性衰老。该重获得的增殖潜力类似于来源于74岁增殖性亲本成纤维细胞ro60的iPSC74PClH，其在roi2时感染。在复制性衰老耗尽之前，这些细胞呈现39H)的群体倍增数潜力。观察到96岁成纤维细胞的增殖能力的类似重置，并通过端粒变长来解释。我们断定，克服了衰老状态的我们的重编程策略还能够延长细胞寿命。通过分层聚类的转录组分析，将亲本成纤维细胞与成纤维细胞中的出生后和分化的HlhESC比较，最终证明来自由老年的供体和衰老的成纤维细胞产生的我们的iPSC的早期再分化成纤维细胞的总体基因表达谱与亲本成纤维细胞不同，而更接近于来源于HlhESC系的胚胎成纤维细胞。该结果也通过与氧化应激和线粒体活性有关的基因表达谱得到证实，从而证实了我们的老化和衰老细胞的复原生理学。`[0212]总之，我们的结果表明，使用基因的特定组合可以将复制性衰老细胞和来源于百岁老人的细胞重编程为iPSC，证明老化和衰老不是重编程为多能性的障碍。这也加深对我们对基本细胞重编程的了解，并强调了参与细胞老化过程的后遗传改变(其明显也容易被重编程)的被低估的重要性。但是最重要地是，我们还证明，使用适当的重编程策略，有可能复原细胞生理学，这表明老化表型的主要方面的潜在可逆性。这些结果还促进了年龄相关的疾病模型的潜在发展，并支持消除一些与老化相关的病状的新的基于细胞的治疗策略的发展。[0213]用于实施本发明所述方法的可用的核苷酸序列和氨基酸序列[0214]表1[0215]【权利要求】1.一种由靶细胞群体制备诱导的多能干细胞(iPSC)的离体方法，所述靶细胞群体包含来自老年供体的细胞或衰老细胞或过表达P16INK4A或ρ21αρ衰老效应物的细胞，所述方法包括下述步骤:a)提供所述包含来自老年供体的细胞或衰老细胞或过表达pl6Iffi4A或ρ21αρ衰老效应物的细胞的靶细胞群体，和b)在适合于将所述靶细胞群体重编程为iPSC的条件下培养所述靶细胞群体，其中所述合适的条件包括增加至少下述重编程因子组合在所述靶细胞群体中的表达:1.由Oct家族基因的一个基因编码的重编程因子；?.由Klf家族基因的一个基因编码的重编程因子；ii1.由Sox家族基因的一个基因编码的重编程因子；iv.由Myc家族基因的一个基因编码的重编程因子；和V.Lin28；v1.和任选的Nanog。2.权利要求1所述的方法,其中所述重编程因子的组合包含0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细胞群体是:a.包含人衰老细胞例如人成纤维细胞衰老细胞的细胞群体；b.从至少50岁的成人受试者获得的人细胞群体；c.从患有导致较高比例的老化或衰老细胞的年龄相关性疾病的受试者获得的人细胞群体。4.权利要求1至3任一项所述的方法，其没有进一步包括在所述靶细胞群体中沉默衰老效应物的步骤。5.权利要求4所述的方法，其中所述沉默衰老效应物的进一步的步骤由沉默ρ21αρ和/或pl6INK4a和/或p53效应物组成。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述增加所述重编程因子表达的条件包括a)将一种或多种包含所述重编程因子组合的编码序列的表达载体引入所述靶细胞群体中；或b)将有效量的所述组合中的各重编程因子或其前体RNA直接递送入所述靶细胞群体中。7.权利要求6所述的方法，其包括用病毒载体的组合转染所述靶细胞群体的步骤，各个病毒载体分别包含下述各种重编程因子的编码序列:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog。8.可根据权利要求1-7中任一项所限定的方法获得的诱导的多能干细胞。9.根据权利要求8所述的诱导的多能干细胞，其中所述诱导的多能干细胞从老年供体的细胞或衰老细胞获得。10.通过权利要求9所述的iPSC分化成期望的细胞谱系而获得的分化细胞。11.复壮来自老年供体的细胞或衰老细胞的体外方法，所述方法包括通过增加至少下述重编程因子的组合在所述老化或衰老细胞中的表达来将所述来自老年供体的细胞或衰老细胞重编程为诱导的多能干细胞:i.由Oct家族基因的一个基因编码的重编程因子；ii.由Klf家族基因的一个基因编码的重编程因子；iii.由Sox家族基因的一个基因编码的重编程因子；iv.由Myc家族基因的一个基因编码的重编程因子；和V.Lin28；vi.和任选的Nanog。12.权利要求11所述的方法，其包括在适合增加下述重编程因子的表达的条件下培养所述来自老年供体的细胞或衰老细胞:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog。13.一种体内用于在需要的受试者中复壮衰老细胞或来自老年供体的细胞的组合物，所述组合物包含用于增加下述重编程因子表达的工具:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任选的Nanog。14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述用于增加所述重编程因子表达的工具包含适量的0ct4前体RNA、Klf4前体RNA、Sox2前体RNA、c-Myc前体RNA、Lin28前体RNA和任选的Nanog前体RNA，其与将各种前体RNA递送入待复壮的衰老细胞的细胞质中的适当工具相结合。15.根据权利要求9所述的诱导的多能干细胞、或根据权利要求10所述的分化细胞、或权利要求13或14所述的组合物，用作需要的老年患者中的自体移植物。【文档编号】C12N5/074GK103562376SQ201280024987【公开日】2014年2月5日申请日期:2012年4月10日优先权日:2011年4月8日【发明者】A·普里厄,O·米亚韦,J-M·勒迈特,L·拉帕塞申请人:国家医疗保健研究所,国家科学研究中心,蒙彼利埃第一大学,蒙彼利埃第二大学