用于检测金黄色葡萄球菌的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及用于快速检测生物或非生物样品中金黄色葡萄球菌的存在或不存在的方法。本发明包括检测方法，其包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，本发明涉及设计用于检测金黄色葡萄球菌的引物、探针和试剂盒。
【专利说明】用于检测金黄色葡萄球菌的组合物和方法
发明领域[0001]本发明涉及微生物诊断领域，并且更具体而言，涉及金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aareiAs)检测领域。
[0002]发明背景
金黄色葡萄球菌(“SA”)是兼性厌氧、革兰氏阳性菌，其自然储库包括人皮肤和鼻子，并且还可居住于伤口。大多数携带金黄色葡萄球菌的人未显示感染征兆；然而，如果正常屏障被突破，则金黄色葡萄球菌可以变得侵袭性并且在体内引起感染。金黄色葡萄球菌可以引起许多病，范围从较小的皮肤感染例如丘疹、疔疮和脓肿到重大疾病例如肺炎、脑膜炎和败血症。当屏障被突破时，除皮肤和鼻子外的组织可以受感染，例如皮肤或粘膜衬里，这导致疖和痈。金黄色葡萄球菌感染可以通过与受感染个人的皮肤接触或与由受感染个人使用的物体接触在人之间传播。
[0003]金黄色葡萄球菌具有惊人的发展对主要抗生素包括青霉素(甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林和氟氯西林)的抗性的能力，其已赢得“超级细菌”的标记。甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)是已变得对青霉素抗性的细菌，并且它负责几种难以治疗的人感染。MRSA也可以被称为苯唑西林抗性金黄色葡萄球菌(0RSA)和多重抗性金黄色葡萄球菌，而金黄色葡萄球菌的非甲氧西林抗性株有时被称为甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)。
[0004]金黄色葡萄球菌感染的诊断可以包括患者症状的医生评估，其通常不是确定性的，因为感染可以已通过另一种细菌例如酿脓链球菌/yOgefles)引起。血液测试、尿分析和有时X射线可以用于诊断金黄色葡萄球菌感染。确定性诊断可能需要培养物测试，其仅可在许多小时或天后获得，延迟患者的治疗。
[0005]由于其在医院和社区获得性疾病中增加的临床重要性，设计用于MRSA的特异性检测的某些PCR测定已得到开发。然而，文献指示还存在检测无论它是否是抗生素抗性的金黄色葡萄球菌的显著临床需要。
[0006]发明概述
本发明涉及用于快速检测生物或非生物样品中金黄色葡萄球菌的存在或不存在的方法。本发明包括包含执行至少一个循环步骤的检测方法，所述循环步骤包括扩增步骤和杂交步骤。此外，本发明涉及设计用于检测金黄色葡萄球菌的引物、探针和试剂盒。在本发明的方法中靶向用于检测金黄色葡萄球菌的基因是荚膜多糖酶(CPE )基因。例如，选择CPE基因靶因为它测定为对金黄色葡萄球菌是特异性的，并且不存在于其他葡萄球菌属物种中，并且还证实在金黄色葡萄球菌内的良好同源性。CPE基因具有未经证实的作为产生金黄色葡萄球菌荚膜多糖途径中的还原酶的功能(O’ Riordan等人，2004，Clin.Microbiol.Rev.17 (I):218-234)。
[0007]在一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包含选自SEQ ID N0:2-4、6、8-10、12和14-34的核苷酸序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO:2-4、6、8_10、12和14-34的核苷酸序列或其互补体组成。在某些实施方案中，寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸，更优选40个或更少的核苷酸。在另一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包括与SEQ ID NO:2-4,6,8-10、12和14-34之一或其互补体具有至少80%序列同一性(例如至少85%、90%或95%等)的核酸，所述寡核苷酸具有loo个或更少的核苷酸。在某些实施方案中,序列同一'I"生优选是90%，更优选95%。一般地，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在这些实施方案的某些中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸,30个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变化。
[0008]在另一个方面，本发明提供了一组寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中的至少一个包含选自SEQ ID N0:2-4、6、8-10、12和14-34的序列或其互补体。在某些实施方案中，寡核苷酸组包括包含选自SEQ ID NO:2、8、12和14-20的序列或其互补体的第一寡核苷酸，和包含选自SEQ ID NO:3、6、9和21-26的序列或其互补体的第二寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸组还包括包含选自SEQ ID NO:4、10和27-34的序列或其互补体的第三寡核苷酸。在特定实施方案中，第三寡核苷酸是可检测标记的。
[0009]在进一步方面，本发明提供了用于检测样品中的SA的方法，该方法包括执行扩增步骤，其包括使样品与一组SA引物接触，如果SA存在于样品中，则产生扩增产物；执行杂交步骤，其包括使扩增产物与一种或多种可检测的SA探针接触；且检测扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中SA的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示样品中SA的不存在。在一个实施方案中，SA引物组的每个引物包含选自SEQ ID NO:2、3、6、8、9、12和14-26的核苷酸序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO:2、3、6、8、9、12和14-26的核苷酸序列或其互补体组成，并且一种或多种可检测的SA探针包含选自SEQ ID N0:4、10和27-34的核苷酸序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO:4、10和27-34的核苷酸序列或其互补体组成。在一些实施方案中，杂交步骤包括使扩增产物与由供体荧光部分标记和相应的受体突光部分标记的探针接触。该方法还包括检测探针的供体突光部分和受体突光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在。荧光的存在或不存在指示样品中SA的存在或不存在。在一个方面，扩增可以采用具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，第一和第二荧光部分可以沿着探针长度在彼此不超过5个核苷酸内。在另一个方面，SA探针包括允许二级结构形成的核酸序列。此类二级结构形成一般导致第一和第二荧光部分之间的空间接近。根据这种方法，在探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
[0010]在进一步方面，本发明提供了用于检测SA的核酸的试剂盒。该试剂盒可以包括包含选自SEQ ID N0:2、8、12和14-20的序列或其互补体，或由选自SEQ ID N0:2、8、12和14-20的序列或其互补体组成的第一寡核苷酸；包含选自SEQ ID NO:3、6、9和21-26的序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO:3、6、9和21-26的序列或其互补体组成的第二寡核苷酸；和包含选自SEQ ID NO:4、10和27-34的序列或其互补体，或由选自SEQ ID N0:4、10和27-34的序列或其互补体组成的第三可检测标记的寡核苷酸。在一个方面，试剂盒可以包括已用供体和相应的受体荧光部分标记的探针，或可以包括用于标记探针的荧光部分。在某些实施方案中，受体荧光部分可以是猝灭剂。该试剂盒还可包括三磷酸核苷、核酸聚合酶和/或核酸聚合酶功能所需的缓冲液。该试剂盒还可包括关于使用引物、探针和荧光部分检测样品中SA的存在或不存在的包装说明书和使用说明书。
[0011]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和例子仅是举例说明性的，并且不意图是限制性的。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
[0012]本发明的一个或多个实施方案的细节在下文附图和说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点根据附图和详述和权利要求是显而易见的。
[0013]附图简述
图1显示金黄色葡萄球菌荚膜多糖酶基因的参考基因序列。
[0014]图2A-2D显示关于金黄色葡萄球菌的扩增子序列，各自包括上游引物、O下游引物?和探针?。[0015]图3A-3D显示用于检测金黄色葡萄球菌的扩增曲线。
[0016]发明详述
本文描述了用于检测样品中的金黄色葡萄球菌的实时测定。本发明提供了检测无论它是否是甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌的方法。提供了用于检测金黄色葡萄球菌的引物和探针，以及含有此类引物和探针的制造物品或试剂盒。与其他方法相比较用于检测金黄色葡萄球菌的实时PCR增加的灵敏度，以及改善的实时PCR特征包括样品污染(containment)和扩增产物的实时检测，从而使得这种技术用于在临床实验室中常规诊断金黄色葡萄球菌感染的实施可行。
[0017]该方法包括执行至少一个循环步骤，其包括使用一对CPE引物扩增来自样品的SACPE核酸分子的部分。如本文使用的“CPE引物”指对编码CPE的核酸序列特异性退火并在合适条件下起始由其的合成的寡核苷酸引物。CPE引物各自对CPE核酸分子内或邻近的靶退火，从而使得每个扩增产物的至少部分含有对应于CPE的核酸序列。CPE扩增产物产生的条件是CPE核酸存在于样品中，因此CPE扩增产物的存在指示样品中SA的存在。扩增产物应含有与一种或多种可检测的CPE探针互补的核酸序列。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测的CPE探针接触，用于检测样品中SA的存在或不存在。
[0018]如本文使用的，术语“扩增”指合成与模板核酸分子(例如SA CPE核酸分子)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子一般包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物对模板核酸退火，并且由引物酶促延长，以生成扩增产物。扩增一般要求脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如Platinum? Taq)和用于聚合酶的最佳活性的合适缓冲液和/或辅因子(例如MgCl2和/或KCl)的存在。
[0019]术语“引物”在本文中如本领域技术人员已知的使用，并且指寡聚化合物，主要是寡核苷酸，还指修饰的寡核苷酸，其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发” DNA合成，即例如寡核苷酸的3’ -末端提供游离3’ -OH基团，在那里更多的“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶与之附着，建立3’至5’磷酸二酯连接，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能用于预期功能外，在根据本发明的“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间不存在基本差异。
[0020]术语“杂交”指一种或多种探针对扩增产物的退火。杂交条件一般包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。
[0021]术语“5’至3’外切核酸酶活性”指一般与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5’末端去除。
[0022]术语“热稳定的聚合酶”指其为热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时，不会不可逆地变性。一般地，合成在每个引物的3’末端处起始，并且沿着模板链以5’至3’方向前进。热稳定的聚合酶已从下述中分离:黄栖热菌/iaras)、红栖热菌(7: ruber)、嗜热栖热菌(K水生栖热菌(K叫似纟/^^乂乳栖热菌丨/1.lacteus、、^L色栖热菌(K 嗜热脂肪芽胞杆菌{Bacillus和炽热甲烧嗜ΙΜ LMethanothermus fervidus)0然而,并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是该酶是补充的。
[0023]术语“其互补体”指与给定核酸是相同长度且确切互补的核酸。
[0024]当就核酸而言使用时，术语“延伸”或“延长”指当另外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸内时。例如，核酸任选通过掺入核苷酸的生物催化剂进行延伸，所述生物催化剂例如一般在核酸的3’末端处添加核苷酸的聚合酶。
[0025]在两个或更多个核酸序列的背景下，术语“相同的”或“同一性”百分比指当例如如使用技术人员可用的序列比较算法之一或通过目视检查测量的，就最大对应性比较且比对时，其为相同或具有其为相同的指定核苷酸百分比的两个或更多个序列或子序列。适合于测定序列同一性和序列相似性百分比的示例性算法是BLAST程序，其在例如下述中描述:Altschul 等人(1990) “Basic local alignment search tool” J.Mol.Biol.215:403-410, Gish 等人(1993) “Identification of protein coding regionsby database similarity search” Nature Genet.3:266-272, Madden 等人(1996)“Applications of network BLAST server^ Meth.Enzymo1.266:131-141,Altschul 等人(1997)“Gapped BLAST and PS1-BLAST:a new generation of protein database searchprograms^ Nucleic Acids Res.25:3389-3402,和 Zhang 等人(1997)“PowerBLAST:A newnetwork BLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation，，Genome Res.7:649-656。
[0026]在寡核苷酸背景下的“修饰的核苷酸”指其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸替换为给寡核苷酸提供所需性质的不同核苷酸的改变。可以在本文描述的寡核苷酸中取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基_dU、2, 6- 二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基_dA、C7_丙炔基_dG、C5_炔丙基氨基_dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基_dA、C7-炔丙基氨基-dG、7_脱氮杂-2-脱氧黄苷、吡唑嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2’-O-甲基Ribo-U、2，-0-甲基Ribo-C, N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在本发明的寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或是本领域另外已知的。在某些实施方案中，相对于相应未修饰的寡核苷酸的解链温度，修饰的核苷酸取代修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步举例说明，在本发明的一些实施方案中，某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如最小化引物二聚体形成等)，增加预期靶扩增子的得率，等等。这些类型的核酸修饰的例子在例如美国专利号6，001, 611中描述。
[0027]金黄色葡萄球菌核酸和寡核苷酸
本发明提供了通过扩增例如SA CPE基因核酸的部分来检测SA的方法。来自SA的核酸序列是可获得的(参见例如GenBank登记号NC_002745)。具体地，本发明提供了扩增且检测SA CPE核酸分子的引物和探针。
[0028]对于SA的检测，提供了扩增CPE核酸分子的引物和探针。除本文例示那些外的CPE核酸也可以用于检测样品中的SA。例如，功能变体可以通过本领域技术人员使用常规方法就特异性和/或灵敏度进行评估。代表性功能变体可以包括例如本文公开的CPE核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
[0029]更具体而言，本发明的寡核苷酸各自包括具有选自SEQ ID NO:2-4、6、8_10、12和14-34的序列的核酸，其基本上相同的变体，其中该变体与SEQ ID NO:2-4、6、8_10、12和14-34之一，或SEQ ID NO:2-4、6、8_10、12和14-34的互补体和变体具有至少例如80%,优选90%或更优选95%的序列同一性。
[0030]表1:上游引物
【权利要求】
1.一种寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:2-4、6、8-10、12和14-34的序列或其互补体。
2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
3.权利要求1或2中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个保守修饰的变化。
4.权利要求1-3中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。
5.权利要求1-4中任一项的寡核苷酸,其还包含一个或多个可检测标记。
6.权利要求1-5中任一项的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包含至少一个标记部分和/或至少一个粹灭剂部分。
7.一种寡核苷酸，其与SEQ ID勵:2-4、6、8-10、12和14-34之一或其互补体具有至少80%序列同一1丨生。
8.一种检测样品中的金黄色葡萄球菌(SA)的方法，所述方法包括: -执行扩增步骤，其包括使所述样品与一组SA引物接触，如果SA存在于所述样品中，则产生扩增产物； -执行杂交步骤，其包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的SA探针接触；和-检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中SA的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示所述样品中SA的不存在； 其中所述SA引物组的每个引物包含选自SEQ ID NO:2、3、6、8、9、12和14-26的序列或其互补体；并且其中所述一种或多种可检测的SA探针包含选自SEQ ID N0:4、10和27-34的序列或其互补体。
9.权利要求8的方法，其中: -所述杂交步骤包括使所述扩增产物与由供体荧光部分标记和相应的受体荧光部分标记的探针接触；和 -所述检测步骤包括检测所述探针的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中所述荧光的存在或不存在指示所述样品中SA的存在或不存在。
10.权利要求8或9中任一项的方法，其中所述扩增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶。
11.权利要求9或10中任一项的方法，其中所述第一和第二荧光部分在所述探针上彼此不超过5个核苷酸内。
12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述SA探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致所述第一和所述第二荧光部分之间的空间接近。
13.一种用于检测金黄色葡萄球菌的核酸的试剂盒，其包括: -包含选自SEQ ID NO:2、8、12和14-20的序列或其互补体的第一寡核苷酸； -包含选自SEQ ID NO:3、6、9和21-26的序列或其互补体的第二寡核苷酸；和 -包含选自SEQ ID NO:4,10和27-34的序列或其互补体的第三可检测标记的寡核苷酸。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述第三可检测标记的寡核苷酸包含供体荧光部分和相应的受体突光部分。
15.权利要求13或14中任一项的试剂盒，其还包含选自下述的至少一种另外组分:三磷酸核苷、核酸聚合酶和所述·核酸聚合酶功能所需的缓冲液。
【文档编号】C12Q1/68GK103547685SQ201280024827
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年5月25日 优先权日:2011年5月26日
【发明者】J.A.约翰逊 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司