细胞外核酸的稳定化和分离的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使用凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂、高渗剂和/或如权利要求书中所定义的式1的化合物使含细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定的方法、组合物和装置。
【专利说明】细胞外核酸的稳定化和分离
[0001]产生本发明的工作接受了来自于欧盟第七框架计划(European Community’sSeventh Framework Programme) (FP7/2007-2013)在拨款协议号 222916 下的资助。
【技术领域】
[0002]本文公开的技术涉及适合于使含细胞的样品、尤其是血液样品中的细胞外核酸群体稳定的方法和组合物，并涉及从相应稳定化的生物样品分离细胞外核酸的方法。
【背景技术】
[0003]已在血液、血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到保护而免受核酸酶影响(例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内)这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应等等来说，是令人感兴趣的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别同一性、评估染色体异常和监测妊娠相关的并发症。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性(例如胎儿来源的核酸或肿瘤来源的核酸)。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述 文献中:W097/035589，W097/34015, Swarup等，FEBS Letters581(2007)795-799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sc1.1075:40-49(2006)，Fleischhacker 和 Schmidt, Biochmica et Biophysica Actal775(2007)191-232,Hromadnikova 等，(2006)DNA and Cell biology, Volume25, Numberllpp635_640 ;Fan 等，(2010)Clinical Chemistry56:80
[0004]传统上，从含细胞的生物样品例如血液分离细胞外核酸的第一步骤是获得所述样品的基本上无细胞的级分，例如在血液的情况下为血清或血浆。然后从所述无细胞的级分分离细胞外核酸，在处理血液样品时，所述无细胞的级分通常为血浆。然而，获得样品的基本上无细胞的级分可能是有困难的，并且分离常常是繁琐和耗时的多步骤过程，因为重要的是使用仔细控制的条件来防止离心期间细胞破裂，所述细胞破裂可能使细胞外核酸被破裂期间释放的细胞内核酸污染。此外，通常难以去除所有细胞。因此，许多往往且通常被分类为“无细胞”的处理后的样品例如血浆或血清事实上仍含有在分离过程中未被去除的残留量的细胞。另一个重要的考虑因素是:由于离体温育期间的细胞破裂，通常在从抽血事件起相对短的时间段内，细胞内核酸从样品中包含的细胞中释放出来。一旦开始细胞裂解，裂解的细胞就释放出另外的核酸，其与细胞外核酸混合，并且回收用于测试的细胞外核酸变得越来越困难。现有技术中讨论了这些问题(参见例如Chiu等(2001), ClinicalChemistry47:91607-1613 ;Fan 等(2010)和 US2010/0184069)。此外，可用的细胞外核酸的量和可回收性可能在一段时间后由于降解而显著降低。[0005]除了例如源自于肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，含细胞的样品还可能包含不被包含在细胞中的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。在运输和操作期间保持含细胞的样品、尤其是例如血液样本中的病毒核酸的完整性，对于后续分析和病毒载量监测也是至关重要的。
[0006]如果样品包含大量细胞，正如在例如使用全血样品的情形中那样，上面讨论的问题尤其成为一个争论点。因此，为了避免或相应地减轻上述问题，通常在获得样品后基本上立即将样品的基本上不含细胞的级分与样品中包含的细胞分离开。例如，推荐的是，在抽取血液后基本上直接从全血获得血浆，和/或将全血和/或得到的血浆或血清冷却，以便保持细胞外核酸的完整性并避免细胞外核酸群体被所包含的细胞释放出的细胞内核酸污染。然而，例如直接从血液分离血浆这一需要是一个主要缺点，因为许多抽取血液的机构(例如医生的诊所)不具有能够有效分离血浆的离心机。此外，如上所述，在常规条件下获得的血浆通常包含残留量的细胞，因此所述细胞在样品操作期间也可能被破坏或可能死亡，从而释放出细胞内核酸、尤其是基因组DNA。这些残留的细胞还造成了下述风险，即，它们在操作期间被破坏，使得它们的核酸内含物、尤其是基因组(核)DNA和细胞质RNA与细胞外循环核酸级分合并，从而污染或相应地稀释所述级分。为了去除这些残留的污染性细胞并避免/减轻上述问题，已知以更高速度进行第二个离心步骤。然而，同样地，这样的大功率离心机在获得血液的机构处通常不可用。另外，即使在抽取血液后直接获得血浆，如果不能直接分离核酸，也推荐将其在_80°C下冷冻以保护其中包含的核酸。这也对样品的处理强加了实际限制，因为例如血浆样品必须被冷冻运输。这提高了成本，并且还造成在冷冻链中断的情况下样品受:损的风险。
[0007]血液样品目前通常被收集在含有喷雾干燥的EDTA或液体EDTA (例如BDVacutainer K2EDTA)的血液收集管中。EDTA螯合镁、钙和其他二价金属离子，从而抑制酶促反应，例如血液凝固或由D NA酶造成的DNA降解。然而，尽管EDTA是有效的抗凝剂，但EDTA不能有效地防止细胞外核酸群体被释放的细胞内核酸稀释或相应地污染。因此，样品的无细胞部分中存在的细胞外核酸群体在储存期间发生变化。因此，EDTA不能使细胞外核酸群体充分稳定，尤其是因为它不能避免细胞外核酸群体被例如抽血后在样品运输和储存期间由细胞降解和细胞不稳定性产生的基因组DNA片段污染。
[0008]具体地旨在使全血中包含的循环核酸稳定的方法是现有技术中已知的。一种方法使用甲醛使细胞膜稳定，从而减少细胞裂解，此外甲醛抑制核酸酶。相应的方法被描述在例如US7, 332，277和US7, 442，506中。然而，甲醛或释放甲醛的物质的使用具有缺点，因为它们可能通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联而损害细胞外核酸的分离效率。使血液样品稳定的可选方法被描述在例如US2010/0184069和US2010/0209930中。这些最近才开发的方法证实了对提供用于使含细胞的生物样品稳定以允许有效回收例如这样的样品中包含的细胞外核酸的手段的极大需求。
[0009]然而，尽管存在这些最近才有的发展，但对开发下面这样的样品处理技术仍存在持续不断的需求:所述样品处理技术能够使生物样品、尤其是含有细胞的样品、包括怀疑含有细胞的样品、特别是全血、血浆或血清中包含的细胞外核酸群体稳定，从而使这样的样品的操作或相应的处理更加容易(例如通过避免从全血直接分离血浆的需要或避免冷却或甚至冷冻分离的血浆的需要)，从而也使这样的样品中包含的细胞外核酸的分离和测试更加可靠，并因此提高细胞外核酸的诊断和预后能力。具体来说，对用于保护全血样品中的细胞外核酸，以例如用于产前检测和/或用于肿瘤、尤其是恶变前疾病或恶性疾病的筛查的解决方案，存在着持续不断的需求。
[0010]本发明的目的是克服现有技术的样品稳定化方法的至少一种缺点。因此，本发明的目的之一是提供一种能够使含细胞的样品、特别是全血稳定的方法。具体来说，本发明的目的是使生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定，尤其是避免细胞外核酸群体被基因组DNA、尤其是片段化基因组DNA污染。此外，本发明的目的尤其是提供一种方法，所述方法适合于即使在室温下也使生物样品、优选为全血样品稳定，优选稳定至少两天、优选地至少三天的时间段。此外，本发明的目的是提供能够有效地使生物样品、尤其是样品中包含的细胞外核酸群体稳定的样品收集容器、尤其是血液收集管。
【发明内容】
[0011]本发明是基于以下这一发现:在使包含细胞外核酸的含细胞的生物样品、尤其是全血样品或源自于全血的样品例如血浆稳定方面，某些添加剂是令人吃惊地有效的。已发现，这些添加剂在使细胞外核酸群体稳定方面高度有效，尤其是能够避免或至少显著减少基因组DNA、尤其是片段化基因组DNA的污染。
[0012]根据第一方面，提供了一种适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，其中将样品与下列物质相接触:
[0013]a)至少一种凋亡抑制剂，
[0014]b)至少一种高渗剂,其使所述样品中包含的细胞稳定,和/或
[0015]c)至少一种式I的化合物
【权利要求】
1.一种用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，所述方法包括将样品与半胱天冬酶抑制剂相接触。
2.权利要求1的方法，其包括将所述样品与下列物质相接触: a)至少一种半胱天冬酶抑制剂； b)任选地，至少一种使所述样品中包含的细胞稳定的高渗剂；以及 c)任选地,至少一种式I的化合物，
3.权利要求1或2的方法，其中还将所述样品与抗凝剂相接触。
4.权利要求1至3中一项或多项的方法，其中由于稳定化，基因组DNA从所述样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放减少，和/或所述样品中存在的核酸的降解减少。
5.权利要求1至4中一项或多项的方法，其中 a)所述半胱天冬酶抑制剂具有一个或多个下述特征: i)它是泛半胱天冬酶抑制剂；和/或
ii)它选自Q-VD-OPh 和 Z-Val-Ala-Asp (OMe) -FMK
和/或 b)所述高渗剂具有一个或多个、优选地两个或更多个下述特征: i)它是不带电荷的； ii)它通过诱导细胞皱缩使所述样品中包含的细胞稳定； iii)它是不能透过细胞的； iv)它是水溶性的； V)它是羟基化有机化合物； vi)它是多元醇； vii)它是羟基-羰基化合物； viii)它是糖或糖醇；和/或 ix)它是二羟基丙酮 和/或 c)其中所述式I的化合物具有一个或多个下述特征: i)Rl、R2和R3包含I至5个碳原子； ii)Rl、R2和R3包含I或2个碳原子；i i i ) R4 是氧； iv)它是N，N- 二烷基-羧酸酰胺； V)它选自N，N- 二甲基乙酰胺、N，N- 二乙基乙酰胺、N，N- 二甲基甲酰胺和N，N- 二乙基甲酰胺；和/或 vi)它是N，N-二甲基丙酰胺。
6.权利要求1至5中一项或多项的方法，其中还将所述样品与至少一种抗凝剂、优选为螯合剂例如EDTA相接触。
7.权利要求1至6中一项或多项的方法，其中在将所述样品与所述半胱天冬酶抑制剂、所述高渗剂、所述式I的化合物和/或所述抗凝剂相接触之后，得到的混合物具有一个或多个下述特征: a)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度选自至少0.01 μ M、至少0.05 μ Μ、至少0.1 μ Μ、至少0.5 μ Μ、至少I μ Μ、至少2.5 μ M或至少3.5 μ M ; b)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度范围选自0.01 μ M至100 μ Μ、0.05 μ M 至 100 μ Μ、0.I μ M 至 50 μ Μ、I μ M 至 40 μ Μ、I μ M 至 30 μ M 或 2.5 μ M 至25μΜ ； C)它包含所述高渗剂，所述高渗剂的浓度为至少0.05Μ、至少0.1Μ、优选地至少0.25Μ、更优选地至少0.5Μ ； d)它包含所述高渗剂，所述高渗剂的浓度范围选自0.05M至2M、0.1M至1.5M、0.15M至0.8Μ、0.2Μ 至 0.7Μ 或 0.1M 至 0.6Μ ;` e)它包含所述式I的化合物，所述式I的化合物的浓度为至少0.1%、至少0.5%、至少1%、至少0.75%、至少1%、至少1.25%或至少1.5% ； f)它包含所述式I的化合物，所述式I的化合物的浓度范围选自0.1%至50%、0.5%至25%, 0.75% 至 20%、1% 至 15% 或 1% 至 10% ;和 / 或 g)它包含所述抗凝剂、优选为螯合剂，所述抗凝剂的浓度范围选自0.05mM至lOOmM、0.05mM 至 50mM、0.1mM 至 30mM、ImM 至 20mM 或 2mM 至 15mM。
8.权利要求1至7中一项或多项的方法，其中为了稳定化将所述样品与下列物质相接触: a)至少一种作为半胱天冬酶抑制剂的泛半胱天冬酶抑制剂， b)至少一种高渗剂，优选为羟基化有机化合物，以及 c)任选地，至少一种式I的化合物，优选为N，N-二烷基-羧酸酰胺，以及 d)任选地，抗凝剂，优选为螯合剂，更优选为EDTA， 其中a)至d)的化合物被包含在稳定化组合物中。
9.权利要求1至8中一项或多项的方法，其中所述样品具有一个或多个下述特征: a)它包含细胞外核酸； b)它选自全血、源自于血液的样品、血浆、血清、淋巴液、尿液、液剂、脑脊液、腹水、乳液、粪、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、拭子/涂片、体液、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物以及细胞培养上清液； c)它是细胞贫化的体液或含细胞的体液； d)它选自全血、血浆和/或血清；和/或e)它是全血。
10.权利要求1至9中一项或多项的方法，其中可以在无需冷藏的条件下、优选地在室温下，在选自下列的时间段内获得所述细胞外核酸群体的稳定化: a)至少两天； b)至少三天； c)至少一天至三天； d)至少一天至六天；和/或 e)至少一天至七天。
11.权利要求1至10中一项或多项的方法，其中 a)将一种或多种稳定剂和任选地其他添加剂包含在稳定化组合物中，并且其中所述稳定化组合物与特定体积的含细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10 和 1:2 至 1:5 ; b)使稳定化的样品经受核酸分析和/或检测方法； c)从稳定化的样品分离细胞外核酸； d)从稳定化的样品分 离细胞外核酸，并对分离的核酸进行分析和/或检测； e)去除稳定化的样品中包含的细胞； f)在进行分离、分析和/或检测步骤之前去除稳定化的样品中包含的细胞； g)在如权利要求10中所定义的稳定化时间段后进行核酸分离步骤； h)储存(i)稳定化的样品，(ii )其中细胞已被去除的稳定化的样品和/或(iii )从所述样品去除的细胞； i)丢弃从稳定化的样品去除的细胞；和/或 j)从细胞分离核酸，所述细胞是从稳定化的样品去除的细胞。
12.权利要求1至11中一项或多项的方法，其用于使血液样品中包含的细胞外核酸群体稳定，所述方法包括将所述血液样品与半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂相接触，其中由于稳定化，基因组DNA从所述血液样品中包含的细胞向所述血液样品的无细胞部分的释放减少，并且所述样品中存在的核酸的降解减少。
13.—种从生物样品、优选为血液样品分离细胞外核酸的方法，所述方法包括下列步骤: a)按照权利要求1至12中一项或多项的方法使所述样品中的细胞外核酸群体稳定；以及 b)分离细胞外核酸。
14.权利要求13的方法，其包括一个或多个下列步骤: i)任选地，在步骤a)与步骤b)之间从含细胞的样品去除细胞； ii)进行如权利要求11中所定义的步骤b)至j)中的一个或多个步骤；和/或 iii)使用分离方法从权利要求13的步骤b)中的样品分离细胞外核酸，所述分离方法选自提取、固相提取、使用核酸结合性固相的分离方法、使用二氧化硅材料的分离方法、基于使用包含阴离子交换基团的固相的分离方法、基于磁性粒子的纯化、苯酚-氯仿提取、基于醇和/或离液剂的核酸分离方法、层析、阴离子交换层析、基于阴离子交换粒子的分离、电泳、过滤、沉淀、靶核酸特异性分离方法及其组合。
15.权利要求13或14的方法，其中分离的核酸在另一个步骤c)中进行处理和/或分析，并且优选地进行: i)修饰； ii)与至少一种酶相接触； i i i )扩增； iv)反转录； V)克隆； vi )测序； vii)与探针相接触； viii)检测； ix)定量；和/或 ix)鉴定。
16.权利要求13至15中一项或多项的方法，其中 a)从所述样品的无细胞部分分离的细胞外核酸群体和/或在权利要求13的步骤b)中分离之后获得的细胞外核酸群体具有一个或多个下述特征: i)它作为一部分被包含在分离到的总核酸中； ii)它主要包含DNA；· iii)它主要包含RNA； iv)它包含循环的细胞外核酸； V)它包含疾病相关的核酸； vi)它包含肿瘤相关的核酸或肿瘤来源的核酸； vii)它包含炎症相关的核酸； viii)它包含胎儿核酸； ix)它包含病毒核酸； X)它包含病原体核酸； xi)它包含哺乳动物细胞外核酸；和/或 xii )它是DNA和RNA的混合物； 和/或 b)在步骤c)中进行分析和/或进一步处理、优选地进行检测的细胞外核酸具有一个或多个下述特征: i)它是DNA； ii)它是RNA ； iii)它是循环的细胞外核酸； iv)它包含疾病相关的核酸； V)它包含肿瘤相关的核酸或肿瘤来源的核酸； vi)它包含炎症相关的核酸； vii)它是胎儿核酸； viii)它是病毒核酸； ix)它是病原体核酸；χ)它是哺乳动物细胞外核酸；和/或 xi )它是DNA和RNA的混合物。
17.一种适用于使生物样品、优选为血液样品中的细胞外核酸群体稳定的组合物，其包含: a)至少一种半胱天冬酶抑制剂， 并且包含至少一种选自13)、(3)和(1)的其他化合物，其中 b)是至少一种适合于使所述样品中包含的细胞稳定的高渗剂，优选地是至少一种羟基化有机化合物； c)是至少一种式I的化合物，:14
18.权利要求17的组合物，其包含至少一种半胱天冬酶抑制剂和至少一种抗凝剂。
19.权利要求17或18的组合物，其具有一个或多个下述特征: a)它能够减少基因组DNA从所述样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放； b)它能够减少所述样品中存在的核酸、尤其是基因组DNA的降解； c)所述半胱天冬酶抑制剂具有如权利要求5中所定义的一个或多个特征； d)它包含至少一种如权利要求5中所定义的高渗剂； e)它包含至少一种如权利要求5中所定义的式I的化合物； f )当与生物样品、优选地与血液、血浆或血清混合时，得到的混合物包含浓度如权利要求7中所定义的半胱天冬酶抑制剂、高渗剂、式I的化合物和/或螯合剂； g)它以固体形式提供； h)它以液体形式提供；和/或 i)它能够在室温下使所述样品中包含的细胞外核酸群体稳定至少3天，优选地至少6天。
20.权利要求17至19中一项或多项的组合物，其中所述稳定化组合物作为与生物样品的混合物被提供，并且其中所述样品具有一个或多个下述特征: a)它包含细胞外核酸； b )它选自全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、液剂、脑脊液、腹水、乳液、粪、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、拭子/涂片、体液、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤□分泌物和排泄物以及细胞培养上清液； c)它是细胞贫化的体液或含细胞的体液；d)它选自全血、血浆和/或血清；和/或 e)它是全血。
21.权利要求20的组合物，其中所述稳定化组合物与特定体积的含细胞的样品的体积比选自 10:1 至 1:20,5:1 至 1:1`5、1:1 至 1:10 和 1:2 至 1:5。
【文档编号】C12N15/10GK103827322SQ201280046947
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年9月25日 优先权日:2011年9月26日
【发明者】马丁·霍利茨, 阿娜贝勒·舒伯特, 马库斯·施普伦格-豪塞尔斯 申请人:凯杰有限公司