呼吸道感染测定的制作方法

呼吸道感染测定的制作方法
【专利摘要】本发明提供核酸产品和相应的用于筛查生物样品存在引起呼吸道感染的微生物的方法，其使用实时PCR和在分开的孔中具有检测探针的测试卡进行。
【专利说明】呼吸道感染测定
[0001]本发明涉及核酸产品和相应地用于筛查生物样品存在引起呼吸道感染的微生物的方法。
[0002]呼吸道感染是全世界上最常见的人类疾病的起因(参见Murray和Lopez (1997)-Lancet，349，第1269-1276页)。缺乏抵抗力的个体(心脏、肺、免疫系统)、老年人和婴儿尤其有发展严重的并发症的危险。历史上，已经通过一组多路(multiplexed)实时(RT)PCR Taqman测定进行呼吸道感染的快速实验室诊断。然而，与该多路方法相关的一个显著的问题是需要制备、运行并且监测平行的筛查测定。由于进行的每个测定相对于单次测定引起消耗成本的加倍并且关于用于进行这些测定的昂贵的设备的磨损产生另外的操作负担，所以这表示不合需要的经济负担。所述多路方法还产生与多重测定的性能相关的另外的时间和人力负担。
[0003]因此，需要更有效的筛查系统。
[0004]本发明通过提供一种用于检测单一分离样品中存在或不存在多种引起呼吸道感染的微生物的简单的一步测定(即，单路形式)而解决上述问题中的一种或多种。
[0005]更详细地，本发明提供一种用于检测样品中存在至少六种引起呼吸道感染的微生物中的一种或多种或检测所述样品中不存在所述微生物的方法，所述方法包括:
[0006]A)将样品应用到测试卡上，其中所述测试卡包括六个分离的孔:
[0007]I)包含第一探针 的第一孔，其中所述第一探针具有包含与核酸序列GGCAATGCffG(SEQ ID NO:1)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0008]2)包含第二探针的第二孔，其中所述第二探针具有包含与核酸序列GAYGGGACCR(SEQ ID NO:2)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0009]3)包含第三探针的第三孔，其中所述第三探针具有包含与核酸序列CACCAGACAC(SEQ ID NO:3)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0010]4)包含第四探针的第四孔，其中所述第四探针具有包含与核酸序列GGTCATTGGR(SEQ ID NO:4)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0011]5)包含第五探针的第五孔，其中所述第五探针具有包含与核酸序列CACTGGGCAC(SEQ ID NO:5)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0012]6)包含第六探针的第六孔，其中所述第六探针具有包含与核酸序列RGTGTTCATT(SEQ ID NO:6)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0013]B)允许所述样品中存在的核酸与所述孔中的探针接触；
[0014]C)检测其中样品核酸已经结合所述探针中的一种或多种的结合核酸复合物的存在；
[0015]D)其中结合核酸复合物的存在证实在所述样品中存在来自所述六种引起呼吸道感染的微生物中的一种或多种的核酸，并且其中不存在结合核酸复合物证实在所述样品中不存在来自所有所述六种引起呼吸道感染的微生物的核酸。
[0016]本 申请人:已经阐明的一个重要的现有技术问题是提供在单一组测定条件下(即，单路形式)相互相容(即，保留准确的结合特异性)的一组强健的探针。与本发明的方法相关的一个特别的优点是速度。例如，本发明的方法典型地在2.5小时内完成，优选在2或
1.5小时内完成。相反，现有的多路测定典型地花费至少4-5小时，典型地至少5小时。
[0017]与本发明的单路(uniplex)(也称为单一通路(singleplex))测定方法相关的另一个优点是增加的灵敏性，其除了简单确定样品中存在或不存在特定病原体之外，还允许定量检测样品中的微生物(例如，病毒和/或细菌负荷)。
[0018]样品中的微生物(例如,病毒和细菌)可以进行针对每种微生物靶标的负荷校准。这允许定量样品中每种微生物的具体负荷。有利地，本发明的这种特质允许确定其中存在多种微生物的样品中的主要的微生物。例如，本发明的单路测定方法允许人们确定其中存在多种病毒的样品中的主要病毒。另外，本发明的方法允许随时间定量检测样品中的病毒，当存在特定病毒的病毒负荷的波动时，这是特别有用的。
[0019]此外，现有系统应用在膜上进行的杂交，而本发明的测定方法在封闭的(例如，无菌的)系统中进行，由此减少污染的可能性，这提供了另一种优点。
[0020]探针1-6分别允许灵敏检测下述:
[0021]I)呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV A 和 B)；
[0022]2)鼻病毒(Rhinoviruses)；
[0023]3)人变性肺病毒(Human Metapneumovirus, hMPV)；
[0024]4)流感病毒 B (F u B Quad)；
[0025]5)流感病毒 A (Flu A CDC DC);和
[0026]6) H5 亚型流感病毒 A (H5FRET)。
[0027]由此，上文限定的方法提供以单路(也称为单一通路)的测定形式检测所述引起呼吸道感染的微生物中的任一种或多种的快速测定。类似地，所述方法提供用于以单一(单路)测定证实样品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速测定。单路测定意指多个单个检测孔测定中的每一个在相同的测定条件和/或基本上同时进行。使用时，将单份样品应用到测试卡上，然后所述样品聚集在每个测试孔中。
[0028]在一个实施方案中，所述方法使用包含选自下述的一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针的测试卡:
[0029]7)包含第七探针的第七孔，其中所述第七探针具有包含与核酸序列TTTCCAGGGG(SEQ ID NO:7)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0030]8)包含第八探针的第八孔，其中所述第八探针具有包含与核酸序列CCGCAAGTCA(SEQ ID NO:8)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0031]9)包含第九探针的第九孔，其中所述第九探针具有包含与核酸序列TTGCCTGGTG(SEQ ID NO:9)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0032]10)包含第十探针的第十孔，其中所述第十探针具有包含与核酸序列TAARGTAGGT(SEQ ID NO:10)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0033]11)包含第十一探针的第十一孔，其中所述第十一探针具有包含与核酸序列CGGCRTCATY(SEQ ID NO:11)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0034]12)包含第十二探针的第十二孔，其中所述第十二探针具有包含与核酸序列ATARTGRTAA(SEQ ID NO:12)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0035]13)包含第十三探针的第十三孔，其中所述第十三探针具有包含与核酸序列ATAGTAATAA(SEQ ID NO:13)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；其中使用如前文所述相同的方法步骤。
[0036]在一个实施方案中，所述测试卡可以包括所述第七至第十三孔(加上相应的探针)中的两个以上、三个以上、四个以上、五个以上、六个以上或所有七个。
[0037]探针7-13分别允许灵敏检测下述:
[0038]7) I 型人副流感病毒(Human parainfluenza virus typel, HPIV1)；
[0039]8) 2型人副流感病毒(HPIV2)；
[0040]9) 3型人副流感病毒(HPIV3)；
[0041]10) 4型人副流感病毒(HPIV4)；
[0042]11)人腺病毒 #2 (Human Adenoviruses#2)；
[0043]12)达菲(Tamiflu)敏感型流感病毒A H12009 ;和
[0044]13)达菲耐药型流感病毒AH12009。
[0045]因此，上文定义的方法提供以单路形式测定检测所述引起呼吸道感染的微生物中的任一种或多种的快速测定。类似地，所述方法提供以单路形式测定证实样品中不存在所有所述引起呼吸道 感染的微生物的快速测定。
[0046]在一个实施方案中，所述方法使用包括选自下述的一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针的测试卡:
[0047]14)包含第十四探针的第十四孔，其中所述第十四探针具有包含与核酸序列TACTGTGACA(SEQ ID NO:14)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0048]15)包含第十五探针的第十五孔，其中所述第十五探针具有包含与核酸序列YRGCGGAACC(SEQ ID NO:15)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0049]16)包含第十六探针的第十六孔，其中所述第十六探针具有包含与核酸序列TAACGAGTGT(SEQ ID NO:16)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0050]17)包含第十七探针的第十七孔，其中所述第十七探针具有包含与核酸序列CGAATGAATG(SEQ ID NO:17)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0051]18)包含第十八探针的第十八孔，其中所述第十八探针具有包含与核酸序列YTCTAAGCAT(SEQ ID NO:18)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0052]19)包含第十九探针的第十九孔，其中所述第十九探针具有包含与核酸序列TTCTAAGCAT(SEQ ID NO:19)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0053]20)包含第二十探针的第二十孔，其中所述第二十探针具有包含与核酸序列GAGTAYCTSA(SEQ ID NO:20)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0054]21)包含第二十一探针的第二十一孔，其中所述第二十一探针具有包含与核酸序列ACTGCATCCG(SEQ ID NO:21)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0055]22)包含第二十二探针的第二十二孔，其中所述第二十二探针具有包含与核酸序列TGTCACCTCT(SEQ ID NO:22)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0056]23)包含第二十三探针的第二十三孔，其中所述第二十三探针具有包含与核酸序列AGTGTGTYAC(SEQ ID NO:23)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0057]24)包含第二十四探针的第二十四孔，其中所述第二十四探针具有包含与核酸序列GAATTTCTGG(SEQ ID NO:24)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；[0058]25)包含第二十五探针的第二十五孔，其中所述第二十五探针具有包含与核酸序列TTGCCGGATG(SEQ ID NO:25)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0059]26)包含第二十六探针的第二十六孔，其中所述第二十六探针具有包含与核酸序列CAGCAACTGT(SEQ ID NO:26)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0060]27)包含第二十七探针的第二十七孔，其中所述第二十七探针具有包含与核酸序列TGCTCCAGAA(SEQ ID NO:27)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0061]28)包含第二十八探针的第二十八孔，其中所述第二十八探针具有包含与核酸序列TNGCCATTGY(SEQ ID NO:28)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0062]29)包含第二十九探针的第二十九孔，其中所述第二十九探针具有包含与核酸序列GTYCCGTGRA(SEQ ID NO:29)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0063]30)包含第三十探针的第三十孔，其中所述第三十探针具有包含与核酸序列CTGGARTCTG(SEQ ID NO:30)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0064]31)包含第三十一探针的第三十一孔，其中所述第三十一探针具有包含与核酸序列CRACTGTGTC(SEQ ID NO:31)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0065]32)包含第三十二探针的第三十二孔，其中所述第三十二探针具有包含与核酸序列GTGTCACCGC(SEQ ID NO:32)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0066]33)包含第三十三探针的第三十三孔，其中所述第三十三探针具有包含与核酸序列GAYGGRACCR(SEQ ID N O:33)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0067]其中使用如前文所述相同的方法步骤。
[0068]在一个实施方案中，所述测试卡可以包括所述第十四至第三十三孔(加上相应的探针)中的两个以上、三个以上、四个以上、五个以上、六个以上、七个以上、八个以上、九个以上、十个以上、十一个以上、十二个以上、十三个以上、十四个以上、十五个以上、十六个以上、十七个以上、十八个以上、十九个以上或所有二十个。所述第十四至第三十三孔(加上相应的探针)中的一个或多个可以与所述第七至第十三孔(加上相应的探针)中的一个或多个组合使用或替代使用。
[0069]探针14-30分别允许灵敏检测下述:
[0070]14)呼吸道合胞病毒(RSV#2) ； (RSV#3)
[0071]15)肠病毒(Enteroviruses)；
[0072]16)严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndromecoronavirus, SARS)；
[0073]17)2组冠状病毒0043和！11^1(6?20(:43/!11^1)；
[0074]18) I 组冠状病毒 NL63 (GP1NL63)；
[0075]19) I 组冠状病毒 229E(GP1229E)；
[0076]20)人腺病毒；
[0077]21)牛犬细小病毒(Bocavirus)；
[0078]22)流感病毒 A (Flu A Quad)；
[0079]23)流感病毒 A H12009 (Hlsw2009)；
[0080]24)流感病毒 A N12009 (NlCFI)；
[0081 ] 25)季节性流感病毒A Hl (Hl季节性CFI)；[0082]26)季节性流感病毒A H3 (H3季节性CFI)；
[0083]27)流感病毒 A H5 (H5CFI)；
[0084]28)流感病毒 A H7 (H7)；
[0085]29)流感病毒 A H9 (H9a)；
[0086]30)流感病毒 A H9 (H9b)；
[0087]31) I型人副流感病毒(HPIV1#2)；
[0088]32) 3型人副流感病毒(HPIV1#3);和
[0089]33)鼻病毒 #2。
[0090]由此，上文限定的方法提供以单路形式测定检测所述引起呼吸道感染的微生物中的任一种或多种的快速测定。类似地，所述方法提供用于以单路形式测定证实样品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速测定。
[0091]在一个实施方案中，所述方法使用包括一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针的测试 卡，其中所述另外的探针结合(由此检测)非典型肺炎(atypicalpneumonia)的致病因子。感染了非典型细菌性呼吸道感染的患者不与常规抗体反应，这通常加重其病症并且消耗健康护理资源。与非典型细菌性肺炎相关的生物体的常规实验室鉴定可能是难的、缓慢的且昂贵的，并且因此本发明在这一点上提供显著的改进。由此，在该实施方案中，使用一种或多种另外的探针来检测下述中的一种或多种:肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae),婴鸟踏衣原体(Chlamydophila psittaci),嗜肺军团菌(Leg1nella pneumophila),肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia)和伯氏考克斯氏体(Coxiella burnettii)。因此,在一个实施方案中,本发明的方法使用包括选自下述的一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针的测试卡:
[0092]34)包含第三十四探针的第三十四孔，其中所述第三十四探针具有包含与核酸序列AATTGGCTTT(SEQ ID NO:34)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0093]35)包含第三十五探针的第三十五孔，其中所述第三十五探针具有包含与核酸序列GGAGAGTGTG(SEQ ID NO:35)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0094]36)包含第三十六探针的第三十六孔,其中所述第三十六探针具有包含与核酸序列CAGACGCTGG(SEQ ID NO:36)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0095]37)包含第三十七探针的第三十七孔，其中所述第三十七探针具有包含与核酸序列CGGCGTTTAT(SEQ ID NO:37)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0096]38)包含第三十八探针的第三十八孔，其中所述第三十八探针具有包含与核酸序列CTTGGTGTGA(SEQ ID NO:38)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0097]39)包含第三十九探针的第三十九孔，其中所述第三十九探针具有包含与核酸序列CTTGGTGTGA(SEQ ID NO:39)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0098]其中使用如前文所述相同的方法步骤。
[0099]在一个实施方案中，所述测试卡可以包括所述第三十四至第三十九孔(加上相应的探针)中的两个以上、三个以上、四个以上、五个以上或所有六个。所述第三十四至第三十九孔(加上相应的探针)中的一个或多个可以与所述第十四至第三十三孔(加上相应的探针)中的一个或多个组合使用或替代使用和/或与所述第七至第十三孔(加上相应的探针)中的一个或多个组合使用或替代使用。[0100]探针34-39分别允许灵敏检测下述:
[0101]34)嗜肺军团菌；
[0102]35)肺炎支原体；
[0103]36)肺炎支原体；
[0104]37)伯氏考克斯氏体；
[0105]38)鹦鹉衣原体；和
[0106]39)流产衣原体(Chlamyd1philia abortus)。
[0107]由此，上文限定的方法提供以单路形式测定检测所述引起呼吸道感染的微生物中的任一种或多种的快速测定。类似地，所述方法提供用于以单路形式测定证实样品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速测定。
[0108]在一个实施方案中，本发明的方法使用包括选自下述的一个或多个另外的‘对照’孔和相应的一种或多种另外的‘对照’探针的测试卡:
[0109]40)包含第四十探针的第四十孔，其中所述第四十探针具有包含与核酸序列AGATCAAGGT(SEQ ID NO:40)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0110]41)包含第四十一探针的第四十一孔，其中所述第四十一探针具有包含与核酸序列ACCTGAAGGC(SEQ ID NO:41)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0111]其中使用如前文所述相同的方法步骤。
[0112]在一个实施方案中，所述测试卡可以包括所述第四十或第四十一孔(加上相应的探针)中的一个或两个。可以使用备选的‘对照’探针/探针靶标。所述‘对照’探针可以与前文所述的实施方案中的任一个组合使用。
[0113]对照探针40-41分别允许灵敏检测下述:
[0114]40)大肠杆菌卩遼菌体 MS2 (Escherichia coli Bacter1phage MS2, MS2IC);和
[0115]41)人核糖核酸酶P基因(RNAse P)。
[0116]一种或多种‘对照’探针的存在允许(基本上同时)证实所述测定正常进行。例如，样品在进行核酸提取之前掺加大肠杆菌噬菌体MS2 (MS2IC)。使用噬菌体MS2探针检测所述样品中的噬菌体MS2核酸允许证实单路测定所涉及的不同阶段被成功完成。噬菌体MS2仅提供一种内部对照的实例，但是任意适当的备选方案可以用于本发明的方法。
[0117]在一个实施方案中，所述测试卡包括允许检测人核糖核酸酶P基因(RNAse P)的探针。样品中存在人RNAse P核酸指示已经收集了人生物材料。备选地，可以使用其他人基因组标记作为探针靶标，并且其相应的探针可以包括在所述测试卡上。
[0118]本发明的测定方法可以包括核酸扩增步骤，在该情形中，本发明的每种探针与一对(正向和反向)引物组合使用-所述引物对协同扩增靶核酸片段，然后在检测步骤过程中该片段被所述探针识别(通过与其结合)。例如，引物If (正向)和Ir (反向)与第一探针协作，并且在实用中所有三种核酸序列都包括在第一孔中。同样适用引物2f和2r与第二探针的组合(在第二孔内)至引物41f和41r与第四十一探针的组合(在第四十一孔内)。
[0119]在一个实施方案中，所述方法使用包括选自下述的一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针的测试卡:
[0120]42)包含第四十二探针的第四十二孔，其中所述第四十二探针具有包含与核酸序列GTGCARTTYG(SEQ ID NO:338)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0121]43)包含第四十三探针的第四十三孔，其中所述第四十三探针具有包含与核酸序列YGCYTCGGAR(SEQ ID NO:339)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0122]44)包含第四十四探针的第四十四孔，其中所述第四十四探针具有包含与核酸序列CTTGTGGANC(SEQ ID NO:340)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0123]45)包含第四十五探针的第四十五孔，其中所述第四十五探针具有包含与核酸序列CATTCCATTC(SEQ ID NO:341)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0124]46)包含第四十六探针的第四十六孔，其中所述第四十六探针具有包含与核酸序列WGTGTTTGCA(SEQ ID NO:342)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0125]47)包含第四十七探针的第四十七孔，其中所述第四十七探针具有包含与核酸序列ACCACGGGAT(SEQ ID NO:343)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0126]48)包含第四十八探针的第四十八孔，其中所述第四十八探针具有包含与核酸序列GTCCTCGCTG(SEQ ID NO:344)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0127]49)包含第四十九探针的第四十九孔，其中所述第四十九探针具有包含与核酸序列GCCCGCGACG(SEQ ID NO:345)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0128]其中使用如前文所述相同的方法步骤。 [0129]探针42-49分别允许灵敏检测下述:
[0130]42)腺病毒；
[0131]43) ADP17 腺病毒；
[0132]44)小 RNA 病毒；
[0133]45)流感病毒B;
[0134]46)流感病毒B;
[0135]47)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；
[0136]48)结核分枝杆菌；
[0137]49)分枝杆菌属(一般的)。
[0138]因此，上文定义的方法提供以单路形式测定检测所述引起呼吸道感染的微生物中的任一种或多种的快速测定。类似地，所述方法提供以单路形式测定证实样品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速测定。
[0139]引物If包含与AAGCWGGATTCTACC(SEQ ID NO:42)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物Ir包含与TCCCATTATGCCTAG(SEQ IDNO:43)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0140]引物2f包含与CCTGAATGYGGCTAA(SEQ ID NO:44)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物2r包含与CGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:45)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0141]弓丨物3f包含与ATCCCACAAAAYCAG(SEQ ID NO:46)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物3r包含与CTACACATAATAARA(SEQ ID NO:47)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0142]引物4f包含与GATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO:48)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物4r包含与TARAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO:49)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0143]引物5f包含与CCTGTCACCTCTGAC(SEQ ID NO:50)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物5r包含与TGGACAAAKCGTCTA(SEQ ID NO:51)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0144]弓丨物6f包含与GGRTACGCTGCAGAC(SEQ ID NO:52)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物6r包含与AGTCCAGACATCTAG(SEQ ID NO:53)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0145]弓丨物If包含与ATACTCAGAGACCCA(SEQ ID NO:54)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物7r包含与ATAYTGTTGCATAGC(SEQ ID NO:55)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0146]引物8f包含与TGCTCCTGATCARCC(SEQ ID NO:56)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物8r包含与TCCCACCATRGCATA(SEQ ID NO:57)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0147]引物9f包含与TATCCTCAGAGATCC(SEQ ID NO:58)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物9r包含与ACATACTGTTGCATG(SEQ ID NO:59)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0148]引物1f包含与CTTGTACAGGARATG(SEQ ID NO:60)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物6r包含与TCCCACCATRGCATA(SEQ ID NO:61)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。 [0149]引物Ilf包含与RGTSGAYCCCATGGA(SEQ ID NO:62)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物Ilr包含与SGGYGTRCGSAGGTA(SEQ ID NO:63)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0150]引物12f包含与AGTCAAATCAGTCGA(SEQ ID NO:64)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物12r包含与CCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:65)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0151]引物13f包含与AGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO:66)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物13r包含与CCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:67)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0152]引物14f 包含与 CATCTGYTTAACAAG(SEQ ID NO:68)或GGARACATACGTGAA (SEQ ID NO:260)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物14r包含与AAGAIACTGATCCTG(SEQID NO:69)或ATTGTAYTGAACAGC (SEQ ID NO:261)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0153]引物15f包含与CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:70)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物15r包含与CGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:71)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0154]引物16f包含与TTATCCAAAATGTGA(SEQ ID NO:72)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物16r包含与GCATCACCGGATGAT (SEQ ID NO:73)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0155]引物17f包含与TTATCCTAARTGTGA(SEQ ID NO:74)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物17r包含与ATCACCACTRCTAGT(SEQ ID NO:75)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0156]引物18f包含与TTATCCCAAATGTGA(SEQ ID NO:76)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物18r包含与AGCRTCACCAGAAGT (SEQ ID NO:77)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0157]引物19f包含与CTATCCTAAGTGTGA(SEQ ID NO:78)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物19r包含与TGCATCACCAGAAGT (SEQ ID NO:79)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0158]引物20f包含与KCNTACATGCACATC(SEQ ID NO:80)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物20r包含与GGGRTTYCTRAACTT(SEQ ID NO:81)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0159]引物21f包含与CAGGAARTGACGTAT (SEQ ID NO:82)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物21r包含与TGTTCACTCGCCGGA(SEQ ID NO:83)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0160]引物22f包含与MGAGGTCGAAACGTA(SEQ ID NO:84)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物22r包含与CACGGTGAGCGTRAA(SEQ ID NO:85)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0161]引物23f包含与TGTAGACACAGTACT (SEQ ID NO:86)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物23r包 含与ATGCTTGTCTTCTAG(SEQ ID NO:87)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0162]引物24f包含与ATCAGTTGGCTAACA(SEQ ID NO:88)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物24r包含与AGCCACTGCCCCATT (SEQ ID NO:89)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0163]引物25f包含与GCCCCCCTACAATTG(SEQ ID NO:90)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物25r包含与ATTCTGGGTTTCCTA(SEQ ID NO:91)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0164]引物26f包含与TGTTGAACGCAGCAA(SEQ ID NO:92)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物26r包含与GCAACTAGTGACCTA(SEQ ID NO:93)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0165]引物27f包含与ATGATGCMATMAAYT(SEQ ID NO:94)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物27r包含与CCATTGGAGTTTGAC(SEQ ID NO:95)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0166]引物28f 包含与 CTTCGGGGCRTCATG(SEQ ID NO:96)或 YAGYGGITACMRGA (SEQ ID NO:262)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物28r包含与CYGCATGTTTCCRTT(SEQID NO:97)或AIRAARCATGAYGCC(SEQ ID NO:263)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0167]引物29f包含与IGGYYACCARTCAAC(SEQ ID NO:98)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物29r包含与YARCATYCCATTGTG(SEQ ID NO:99)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0168]引物30f包含与YGAYCARTGCATGGA(SEQ ID NO:100)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物30r包含与GGCRACAGTIGAATA(SEQ ID NO:101)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0169]引物31f包含与GGATGGAACCGTYAA(SEQ ID NO:102)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物31r包含与TTGTTGTGACCTCAT(SEQ IDNO:103)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0170]引物32f包含与RGCTTTCAGACAAGA(SEQ ID NO:104)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物32r包含与GACCGCATGATTGAC(SEQ ID NO:105)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0171]引物33f包含与CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:106)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物33r包含与CGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:107)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0172]引物34f包含与ATGCAAGACGCTATG(SEQ ID NO:108)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物34r包含与GTCTTTCATTTGCTG (SEQ ID NO:109)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0173]引物35f包含与GTGGCAGTTGGGTCA(SEQ ID NO:110)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物35r包含与CTTGATCCGCCCACA(SEQ IDNO:111)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0174]引物36f包含与TATAAAGGCGTTGCT (SEQ ID NO:112)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物36r包含与GATGGTCGCAGACTT(SEQ IDNO:113)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。 [0175]引物37f包含与CATCGTTCCCGGCAG(SEQ ID NO:114)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物37r包含与GTTTACTAATCCCCA(SEQ ID NO:115)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0176]引物38f包含与TGGGAAGGTGCTTCA(SEQ ID NO:116)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物38r包含与CGCGGATGCTAATGG(SEQ ID NO:117)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0177]引物39f包含与TGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO:118)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物39r包含与TCCTGCGCGGATGCT(SEQ IDNO:119)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0178]引物40f包含与CTCTCCGTATTCACG(SEQ ID NO:120)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物40r包含与GACCCCACGATGAC(SEQ ID NO:121)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0179]引物41f包含与TTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO:122)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物41r包含与GCTGTCTCCACAAGT(SEQ IDNO:123)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0180]引物42f包含与KCNTACATGCACATC (SEQ ID NO:80)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物42r包含与GGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO:81)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0181]引物43f包含与ITACATGCAYATCKC(SEQ ID NO:267)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物43r包含与 GGCRAAYTGCACCAG(SEQ IDNO:268)或GGCAMCTGCACGAG (SEQID NO:269)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0182]引物44f包含与AGATGGCGTRCCATA(SEQ ID NO:272)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物44r包含与ACTAGAGGATGGCTG(SEQ ID NO:273)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0183]引物45f包含与GCTATGAACACAGCA(SEQ ID NO:276)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物45r包含与TTGGACGTCTTCTCC(SEQ ID NO:277)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0184]引物46f包含与GATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO:48)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物46r包含与TARAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO:49)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0185]引物47f包含与GTAACACGTGGGTGA(SEQ ID NO:280)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物47r包含与ACCGCTAAAGCGCTT (SEQ ID NO:281)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0186]引物48f包含与TTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:284)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物48r包含与GGTCGGGACGGTGAG(SEQ ID NO:285)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0187]引物49f包含与TTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:284)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物49r包含与GGTCGGGACGGTGAG(SEQ ID NO:285)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列 。
[0188]所述生物样品典型地是已经取自患者的样品(即，离体和/或分离的样品)。在一个实施方案中，可以对所述样品进行核酸提取步骤-常规的核酸提取方案在本领域中是公知的。然后将提取的核酸样品应用到所述测试卡上，以使其接触每个孔(并且由此接触所述孔内的每条探针)。
[0189]本发明的核酸‘杂交反应’(包含一起起作用的探针和引物)步骤典型地在50-700C (例如，55-65°C或 56-64°C或 57-63°C或 58-62°C或 59-61°C或约 60°C )的温度进行。所述温度典型地保持10-30秒的时间期间(例如，15-25秒或17-23秒或19-21秒或约20秒)。如果本发明的方法中包括核酸扩增步骤，则在每个扩增步骤循环中优选地包括所述‘杂交反应’(包含在开始时过量添加的探针和引物)步骤。
[0190]如果使用核酸扩增步骤，则该步骤典型地在90-100°C (例如，92-98°C或94-96°C或约95°C )的温度进行典型的0.1-10秒的时间(例如，0.5-5秒或0.7-2秒或约I秒)，接着在50-700C (例如，55-65°C或57-63°C或59-6TC或约60°C )的降低的温度进行10-30秒的时间(例如，15-25秒或17-23秒或19-21秒或约20秒)。如果使用核酸扩增步骤，则所述步骤典型地包括35-55个循环(例如，40-50个循环或44-46个循环或约45个循环)。在每次起始典型地使用反转录步骤，所述反转录步骤在40-60°C (例如，45-55°C或48-52°C或约50°C )的温度进行3-7分钟的时间期间(例如，4-6分钟或约5分钟)。
[0191]在一个实施方案中，所述方法可以在应用生物系统(AppliedB1systems) 7900HT(高通量)仪器上进行。例如，所述一起可以使用384孔测试卡(也称为平板)RT-PCR平台，其允许，例如，通过单一测试卡上存在的8个不同的柱平行分析8份不同的样品-参见图1。每个柱可以包含48个单个的靶标孔，由此允许(对每份样品基本上同时)筛查48种不同的引起呼吸道感染的微生物(有效地，46种引起呼吸道感染的微生物，使用两个‘对照’孔)。备用的装置和系统(包括相应的测试卡)可商购，并且在本发明的情形中具有同等的应用。
[0192]在一个实施方案中，所述方法使用PCR，诸如RT-PCR。
[0193]使用时，样品(典型地是提取的核酸样品)与2倍或5倍浓缩的缓冲液(例如，PCR缓冲液；还称为反应混合物)混合。例如，Χμ I样品与相同体积(Χμ I)的2倍浓缩的缓冲液混合。然后将所述样品(包含缓冲液)应用到所述测试卡上(并且应用到每个孔中)_典型地，0.1-50 μ I或0.5-30 μ I或0.5-20 μ I或0.5-10 μ I或1-5 μ I范围内的体积被递送至每个孔中。优选地，约0.5μ 1、1μ 1、2μ 1、3μ 1、4μ I或5μ I样品(包含缓冲液)被递送至每个孔中。
[0194]在包括柱状排列的孔的测试卡的情形中(参见，例如，图1)，样品(包含缓冲液)可以仅应用到每个柱顶部的储库中，然后将所述测试卡在离心机中旋转以将样品加试剂混合物(在上文定义的体积范围内)递送至在每个柱中形成的每个孔中。在AB7900HT系统的情形中，每个孔典型地包含48个孔，因此通过离心递送将样品应用至所述48个孔的每一个中。更详细地，多至8种样品可以分别添加到每个柱顶端的8个储库中(例如，使用翼形移液器(fin pipette)。参考图1,小沟(little pods)表示分离的测定孔,其又包括相应的探针(并且任选地包括相应的引物)。所示的测试卡显示其中每个通道存在48个孔(还称为沟)的设置-使用时，通过沿着柱形通道的离心递送每个孔典型地接收最终I μ I的反应体积。
[0195]每个孔包括本发明的一种特定的探针类型(以及任选地相应的引物对)。在一个实施方案中，所述探针以冻干形 式存在于其所在的孔中。由此，一旦向所述孔表面应用液体样品，则冻干的探针(任选地包含相应的引物对)变得再水合，由此允许在液体介质中进行检测步骤。
[0196]设计本发明的孔容纳略微多于要在所述孔中进行的测定的相关液体体积(样品加缓冲液/反应混合物)。每个孔是分离的，以允许单个孔中放置单种探针类型，由此允许所述方法检测特定的目标微生物的存在或不存在。将样品应用到测试卡上后，可以使用一种或多种薄膜/薄片将含有探针的所有孔密封关闭，由此防止孔间液体(以及潜在的探针)的意外迁移。本发明的孔可以放置在与测试卡相同的水平面上，但是同等地可以放置高于或低于所述平面。
[0197]与多路反应设置的标准排列架(battery)相比，本发明提供反应设置操作中的时间和资源的双重节约，并且允许整理来自多个仪器的数据。
[0198]本发明还提供用于上文所述的方法的测试卡。在一个实施方案中，所述测试卡由塑料材料制成。为了辅助使用者的目的，例如，当在正常使用过程中使用者典型所保持的基本上水平的位置上时，所述测试卡应该具有充分的硬度以支撑卡(包括应用的样品)的重量。
[0199]所述测试卡包括多个孔(任选地以柱状形式排列以允许通过离心递送进行样品上样)，其中提供至少六个孔，并且其中第一孔包含第一探针，第二孔包含第二探针，第三孔包含第三探针，第四孔包含第四探针，第五孔包含第五探针，以及第六孔包含本发明的第六探针，如本文所定义。每个孔典型地仅包含本发明的(多个)一种特定的探针。例如，在一个实施方案中，第一探针存在于第一孔中(尽管典型地不存在于任一个其他的孔中)，并且第二探针存在于第二孔中(尽管典型地不存在于任一个其他的孔中)，等等。
[0200]每条探针可以任选地与其相应的引物对相关联。因此，除了第一探针，第一孔可以包含第一对相应的正向和反向引物。每个孔典型地仅包含本发明的(多对)一对特定的引物对。例如，在一个实施方案中，第一引物对(以及第一探针)存在于第一孔中，但是典型地不存在于任一个其他的孔中，并且第二引物对(以及第二探针)存在于第二孔中，但是典型地不存在于任一个其他的孔中，等等。备选地，多于一种探针(以及任选地其相应的引物对)可以存在于单个孔中。
[0201]每条探针可以固定在其各自的孔中-所述固定可以是永久性的(例如，通过共价连接，任选地通过任意商购的化学交联剂引入)或暂时的(例如通过非共价键，诸如氢键，或通过离子键)。例如，第一探针可以固定在第一孔中，并且第二探针可以固定在第二孔中，等等。各种探针的固定使得测试卡更容易处理，提高了储存的稳定性，并且使探针在孔间迁移的风险最小化。探针优选地通过简单吸附在孔中存在的表面上，诸如简单吸附在孔的壁上，而固定在所述孔内。由此，在一个实施方案中，制备含有探针的溶液，应用到孔的表面上，任何允许干燥在所述孔的表面上。在应用到孔表面上之前，可以向含有探针的溶液中加入常规的稳定化合物(例如，糖)。
[0202]所述测试卡可以包括选自本文所述的第七孔至第十三孔(分别包括第七至第十三探针)的一个或多个另外的孔。例如，所述卡可以包括第七孔至第十三孔(分别包括第七至第十三探针)中的每一个。 [0203]所述测试卡可以备选地或另外包括选自本文所述的第十四孔至第三十三孔(分别包括第十四至第三十三探针)的一个或多个另外的孔。例如，所述卡可以包括第十四孔至第三十三孔(分别包括第十四至第三十三探针)中的每一个。
[0204]上述测试卡实施方案的每一个可以进一步包括用于检测引起非典型微生物(例如，细菌)呼吸道感染的介质的一个或多个孔。在该实施方案中，所述测试卡可以进一步包括选自本文所述的第三十四孔至第三十九孔(分别包括第三十四至第三十九探针)的一个或多个另外的孔。例如，所述卡可以包括第三十四孔至第三十九孔(分别包括第三十四至第三十九探针)中的每一个。
[0205]上述测试卡实施方案的每一个可以进一步包括一个或多个‘对照’孔。在该实施方案中，所述测试卡可以进一步包括本文所述的第四十和第四十一孔(分别包括第四十和/或第四十一探针)中的一个或两个。
[0206]定义部分
[0207]述及至少80%的序列同一性包括(针对本文所述的每一种核酸序列和/或本文所述的每一种SEQ ID NO)至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和100%的序列同一性。
[0208]在整个本说明书中所用的单字母参考密码意指:
[0209]A腺嘌呤
[0210]C胞嘧啶
[0211]G鸟嘌呤[0212]T胸腺嘧啶
[0213]U尿嘧啶
[0214]I 肌苷
[0215]X 肌苷
[0216]R鸟嘌呤或腺嘌呤
[0217]Y胸腺嘧啶或胞嘧啶
[0218]K鸟嘌呤或胸腺嘧啶
[0219]M腺嘌呤或胞嘧啶
[0220]S鸟嘌呤或胞嘧啶
[0221]W腺嘌呤或胸腺嘧啶
[0222]B非腺嘌呤
[0223]D非胞嘧啶 [0224]H非鸟嘌呤
[0225]V非胸腺嘧啶
[0226]N任意核酸碱基
[0227]本文所述的所有核酸序列都是以5’ -至-3’ (由左至右)方向表示。
[0228]设计本发明的探针与其存在于怀疑引起目标呼吸道感染的微生物上的靶核酸序列杂交。优选地，结合条件是这样的，以提供高水平的特异性-即，探针的杂交在“严格条件下”发生。通常，这样选择严格条件:比特定序列在限定的离子强度和pH的热解链温度(Tm)低约5°C。Tm为其中(在限定的离子强度和pH) 50%的靶序列(或互补序列)与完美匹配的探针杂交的温度。在这一点上，例如，本发明的探针在约0.02M以下的盐浓度和pH7的^高于60°C，诸如约70°C。
[0229]预混合的缓冲液是商购的(例如，购自CLONTECH Laboratories, Inc.的EXPRESSHYB杂交液)，并且杂交可以按照供应商的使用说明进行。
[0230]筛选本发明的探针以使自我互补性和二聚体形成(探针-探针结合)最少化，并且进行选择以与人DNA具有最少的同源性。选择方法典型地包括将候选探针序列与人DNA进行比较，并且如果同源性大于50%，则弃用该探针。该选择方法的目的是减少探针与污染的人DNA序列的退火，并且由此允许该测定的提高的特异性。
[0231]本文所述的任一种探针可以包含标签和/或标记。例如，所述标签和/或标记可以(彼此独立地)位于靠近本文所述的探针的中间或靠近其5’或3’末端或位于其5’或3’末端，例如，位于5’末端。
[0232]因此，在带有标签/标记的探针与靶核酸杂交后，所述标签/标记与所述靶核酸缔合。备选地，如果使用扩增步骤，则所述探针可以在本发明方法的过程中作为引物，并且因此所述标签/标记可以随着引物延伸结合到扩增产物中。
[0233]适当的标记的实例包括可检测的标记，诸如放射性标记或荧光或有色分子，酶标记或生色标记-例如，当与探针杂交时产生可见颜色变化的染料。例如，所述标记可以是洋地黄毒苷(digoxygenin)、突光素-异硫氰酸酯(FITC)、R-藻红蛋白、Alexa532或Cy3。探针优选地包含Fam标记(例如，5’Fam标记)和/或小沟结合物(MGB)。所述标记可以是报道分子，其被直接检测，诸如通过暴露于胶卷或X-线胶片。备选地，所述标记不是直接检测的，但是可以间接检测，例如，在两相系统中。间接标记检测的实例是抗体与标记的结合。
[0234]适当的标签的实例包括“补体/抗-补体对”。术语“补体/抗-补体对”表示在适当条件下形成非共价缔合的稳定的配对的不相同的结构部分。适当的标签的实例包括生物素和链霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)。例如，生物素标签可以用链霉抗生物素蛋白捕获，所述链霉抗生物素蛋白可以包被到基底或支持物(如珠子(例如，磁珠)或膜)上。同样地，链霉抗生物素蛋白标签可以用生物素捕获，生物素可以包被到基底或支持物(如珠子(例如，磁珠)或膜)上。其他示例性的补体/抗-补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对等。另一种实例是与互补序列结合的核酸序列标签。后者自身可以是被预先标记的，或可以连接到被独立标记的表面(例如，珠子)上。后一实施方案的实例是公知的LumineXK珠子系统。其他示例性的标签和捕获分子对包括受体/配体对和抗体/抗原(或半抗原或表位)对。在需要补体/抗-补体对的后续解离的情形中，所述补体/抗-补体对具有例如小于19IT1的结合亲和力。
[0235]本发明的探针可以用不同的标记或标签来标记，由此允许在用于本发明的方法中时分开鉴定每种探针。
[0236]可以利用任意常规方法将核酸标签连接到本发明的探针上(例如，连接到所述探针限定的结合区的5’末端)。备选地，本发明的核酸探针(具有预先连接的核酸标签)可以由商业供应者构建。
[0237]例如，所述样品是临床样品(或来源于临床样品)，诸如:粪便或血液、痰、鼻和喉擦拭物、支气管肺泡灌洗、气管吸出物、鼻咽吸出物、肺组织样品、脑脊液、考古学样品。所述样品优选是人组织/样品或是来源于其的样品(例如，提取自样品的核酸)。 [0238]如果使用扩增步骤，则该步骤可以使用本领域已知的方法和平台进行，例如，PCR (例如，使用“快速DNA聚合酶”，生命技术(Life Technologies))，诸如实时PCR，基于块的PCR(block-based PCR)，连接酶链式反应，玻璃毛细管，等温扩增法，包括环介导的等温扩增，滚环扩增转录介导的扩增(rolling circle amplificat1n transcript1n mediatedamplificat1n)，基于核酸序列的扩增，RNA技术信号介导的扩增，链置换扩增，等温多置换扩增，解旋酶依赖性扩增，单引物等温扩增和环式解旋酶依赖性扩增。
[0239]如果使用，扩增可以使用任意扩增平台进行-由此，该测定实施方案的优点是其是独立于并且不依赖于任何特定的仪器的平台。
[0240]在一个实施方案中，可以使用通用扩增步骤(例如，预检测)来增加样品存在的靶核酸的量。在该实施方案中，PCR扩增引物典型地用来扩增靶标/包含本发明的核苷酸靶标的互补核酸的大约100-400个碱基对的区域。在存在适当的聚合酶和DNA前体(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)的条件下，正向和反向引物在5’至3’方向上延伸，由此起始与靶核酸的单条链互补的新核酸链的合成。由此所述引物驱动靶核酸序列的扩增，由此产生包含所述靶核酸序列的扩增产物。
[0241]在一个实施方案中，可以使用其中本发明的探针作为引物的扩增步骤。在该实施方案中，所述探针(作用为引物)从其3’末端(B卩，以5’-至-’3’)方向延伸。产生的扩增产生典型地包含所述靶标/互补核酸的100-400个碱基对的区域。该实施方案可以与通用扩增步骤(诸如前文所述的步骤)联合使用。
[0242]检测步骤可以通过任意已知的方式进行。在这一点上，探针或扩增产物可以被添加标签和/或标记，标签因此检测方法可以包括检测所述标签和/或标记。
[0243]在一个实施方案中，所述探针可以包含标签和/或标记。因此，在一个实施方案中，在带有标签的/标记的探针与靶核酸杂交后，所述标签/标记与所述靶核酸缔合。因此，在一个实施方案中，所述测定可以包括检测所述标签/标记并且将标签/标记的存在与感染性微生物核酸的存在相关联。
[0244]在一个实施方案中，标签和/或标记可以在探针的延伸过程中结合。这样做时，扩增产物被添加标签/标记，并且因此测定可以包括检测所述标签/标记并且将标签/标记的存在与扩增产物的存在、由此与感染性微生物核酸的存在相关联。
[0245]例如，在一个实施方案中，扩增产物可以结合标签/标记(例如，通过带有标签/标记的dNTP，如生物素-dNTP)作为扩增方法的一部分，并且所述测定可以进一步包括使用与所述标签(例如，链霉抗生物素蛋白)互补的结合配偶体，其包括可检测的标签/标记(例如，荧光标记，诸如R-藻红蛋白)。以这种方式，扩增的产物结合可检测的标签/标记(例如，突光标记，诸如R-藻红蛋白)。
[0246]在一个实施方案中，所述探针和/或扩增产物可以包含其他的标签/标记(作为补体成分)以允许捕获所述扩增产物。
[0247]例如，可以使用“补体/抗-补体”配对，其中抗-补体捕获成分与所述其他标签/标记(补体成分)结合，由此允许捕获所述探针和/或扩增产物。适当的“补体/抗-补体”配偶体的实例已经 在本说明书的前文中描述，诸如核酸序列的互补对，互补的抗体-抗原对等。抗-补体捕获成分可以连接到(例如，包被到)基底或固体支持物上-适当的基底/支持物的实例包括膜和/或珠子(例如，磁珠或荧光珠)。捕获方法是本领域中公知的。例如，可以使用LumineXK珠子。备选地，使用磁珠可能是有利的，原因在于所述珠子(加上捕获的、带有标签/标记的扩增产物)能够使用本领域已知的常规技术容易地进行浓缩并与样品分离。
[0248]固定提供抗-补体捕获成分(或探针)的物理定位，标签可以起作用将捕获成分/探针固定在需要的位置和/或促进探针的回收或分离。支持物可以是由例如玻璃或塑料制成的刚性固体支持物，诸如珠子(例如，荧光珠或磁珠)。备选地，所述支持物可以是膜，诸如尼龙或硝基纤维素膜。3D基质(3D matrices)也是用于本发明的适当的支持物-例如，聚丙烯酰胺或PEG凝胶。支持物/平台的固定可以通过多种常规方式实现。例如，在诸如尼龙膜的支持物上的固定可以通过UV交联实现。备选地，生物素标记的分子可以结合在链霉抗生物素蛋白包被的基底上(并且反之亦然)，并且用氨基接头制备的分子可以固定到甲硅烷化的表面上。另一种固定方式是通过聚-T尾巴或聚-C尾巴，例如，在3’或5’末端的聚-T尾巴或聚-C尾巴。所述固定技术同等地适用于本发明的探针成分(以及引物对成分，如果存在的话)。
[0249]在一个实施方案中，本发明的探针包含核酸序列标签/标记(例如，在所述探针的限定的与靶标/互补核酸结合的序列的5’末端连接到每个探针上)。更详细地，所述探针中的每一种提供有不同的核酸序列标签/标记，其中所述标签/标记中的每一种(特异性)结合存在于珠子表面上的互补核酸序列。所述不同的标签/标记中的每一种与其互补序列对应体结合(并且不与其他标签的任一种互补序列对应体结合)，其互补序列对应体位于独特的可鉴定的珠子上。在这一点上，珠子是独特的可鉴定的，例如，通过特定波长的荧光的方式鉴定。因此，使用时，本发明的探针与靶核酸(如果样品中存在)结合。然后，在存在一种或多种标记的dNTP (例如，生物素标记的dNTPs，诸如生物素-dCTPs)的条件下，(只有)结合的探针可以被延伸(在3’方向)。
[0250]延伸的引物可以与针对所标记的dNTPs的结合配偶体对应体(例如，链霉抗生物素蛋白标记的荧光团，诸如链霉抗生物素蛋白标记的R-藻红蛋白)接触，所述对应体结合已经结合到延伸的引物中的那些标记的dNTPs。然后，所标记的延伸的引物可以通过允许其与其存在于独特的可鉴定的珠子上的核酸对应体结合而进行鉴定。然后，后者可以被“读出(called) ”(例如，以通过波长发射确定存在的珠子的类型)并且可以确定引物延伸的性质(由此确定存在的靶标/互补核酸的类型)。
[0251]本发明的优选实施方案
[0252]第一探针包含与TAGGCAATGCWGC(SEQ ID NO: 124)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0253]第二探针包含与TCYGGGAYGGGACCRACTA (SEQ ID NO: 125)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0254]第三探针包含与TCAGCACCAGACACACC (SEQ ID NO:126)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0255]第 四探针包含与TCTGGTCATTGGRGCC (SEQ ID NO:127)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0256]第五探针包含与CGCTCACTGGGCACGGT (SEQ ID NO:128)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0257]第六探针包含与AACTGRGTGTTCATTTTGT (SEQ ID NO: 129)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0258]第七探针包含与ATARTTTCCAGGGGCAAA(SEQ ID NO:130)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0259]第八探针包含与CCATCCGCAAGTCAATG (SEQ ID NO:131)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0260]第九探针包含与ATAGTTGCCTGGTGCGAA (SEQ ID NO: 132)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0261]第十探针包含与CTGATAARGTAGGTGCTT(SEQ ID NO:133)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0262]第—^一探针包含与CGCGGCRTCATYGA (SEQ ID NO:134)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0263]第十二探针包含与CCTCATARTGRTAATTAG (SEQ ID NO: 135)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0264]第十三探针包含与CCTCATAGTAATAATTAG (SEQ ID NO: 136)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0265]第十四探针包含与ATGGTACTGTGACAATGC(SEQ ID NO:137)或CACGARGGCTCCACRTAC(SEQ ID NO:286)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0266]第十五探针包含与TCTGYRGCGGAACCGACT (SEQ ID NO: 138)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0267]第十六探针包含与AGCTAACGAGTGTGCG(SEQ ID NO:139)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0268]第十七探针包含与CTTGCGAATGAATGYGC (SEQ ID NO: 140)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0269]第十八探针包含与TTGGGYTCTAAGCATGTTA (SEQ ID NO:141)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0270]第十九探针包含与TTAGGTTCTAAGCATGTCA (SEQ ID NO:142)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0271]第二十探针包含与CYTCGGAGTAYCTSAGYCC (SEQ ID NO:143)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0272]第二—^一探针包含与TCAGACTGCATCCGGTCT (SEQ ID NO: 144)具有至少 80 % 的序列同一'I"生的核酸序列。
[0273]第二十二探针包含与TCYTGTCACCTCTGAC (SEQ ID NO: 145)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0274]第二十三探针包含与ACAGAGTGTGTYACTGT (SEQ ID NO:146)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0275]第二十四 探针包含与TTGGAATTTCTGGCCC(SEQ ID NO:147)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0276]第二十五探针包含与CGTTGCCGGATGGA (SEQ ID NO:148)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0277]第二十六探针包含与CCTACAGCAACTGTTACC (SEQ ID NO: 149)具有至少80 %的序列同一'I"生的核酸序列。
[0278]第二十七探针包含与CATTGCTCCAGAAWAT(SEQ ID NO:150)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0279]第二十八探针包含与TTCTNGCCATTGYAA (SEQ ID NO:151)或 TGGTTTAGCTTCGGG (SEQID NO:255)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0280]第二十九探针包含与CAATGTYCCTGTRACACA (SEQ ID NO: 152)具有至少80 %的序列同一'I"生的核酸序列。
[0281]第三十探针包含与AARCTGGARTCTGARG(SEQ ID NO:153)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0282]第三^^一探针包含与CCTTCRACTGTGTCTCC (SEQ ID NO:154)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0283]第三十二探针包含与CACTGTGTCACCGCTCA(SEQ ID NO:155)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0284]第三十三探针包含与TCYGGGAYGGRACCRACTA (SEQ ID NO:156)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0285]第三十四探针包含与CGCTCAATTGGCTTTAACC(SEQ ID NO:157)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。[0286]第三十五探针包含与CGTGGAGAGTGTGTG (SEQ ID NO:158)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0287]第三十六探针包含与CAACAGACGCTGGCG (SEQ ID NO:159)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0288]第三十七探针包含与TGTCGGCGTTTATTGG (SEQ ID NO: 160)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0289]第三十八探针包含与CTACTTGGTGTGAYGC (SEQ ID NO:161)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0290]第三十九探针包含与CTACTTGGTGTGAYGC (SEQ ID NO: 162)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0291]第四十探针包含与TCGATAGATCAAGGTGCCT (SEQ ID NO:163)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0292]第四^^一探针包含与TTCTGACCTGAAGGCTCTG (SEQ ID NO: 164)具有至少 80 % 的序列同一'I"生的核酸序列。
[0293]第四十二探针包含与CTGGTGCARTTYGCCCG(SEQ ID NO:247)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0294]第四十三探针包含与CAGGAYGCYTCGGARTACCT (SEQ ID NO:248)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0295]第四十四探针包含与CCAYGCTTGTGGANCTTATGC(SEQ ID NO:249)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列。
[0296]第四十五探针包含与TTYCCCATTCCATTCATTGT(SEQ ID NO:250)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0297]第四十六探针包含与CCCWGTGTTTGCAGTRGA(SEQ ID NO:251)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0298]第四十七探针包含与TAGGACCACGGGATGCA(SEQ ID NO:252)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0299]第四十八探针包含与AAGTTGTCCTCGCTGCCACTC (SEQ ID NO:253)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列。
[0300]第四十九探针包含与CAGTGCCCGCGACGGACG (SEQ ID NO:254)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0301 ]引物 If 包含与 GGGWGGWGAAGCWGGATTCTACC (SEQ ID NO: 165)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物Ir包含与ACCTCTRTACTCTCCCATTATGCCTAG(SEQ ID NO:166)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0302]引物2f 包含与 CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:167)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物Ir包含与GAAACACGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:168)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0303]引物3f包含与CATCAGGTAAYATCCCACAAAAYCAG(SEQ ID NO:169)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物3r包含与GTGAATATTAARGCACCTACACATAATAARA(SEQ ID NO:170)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。[0304]引物4f 包含与 GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT(SEQ ID NO:171)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物 4r 包含与 CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTCT(SEQ ID NO:172)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0305]引物5f 包含与 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC(SEQ ID NO:173)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物5r包含与AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA (SEQ ID NO:174)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0306]引物6f 包含与 AGTGGRTACGCTGCAGAC(SEQ ID NO:175)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列，并且引物6r包含与GTTCAGCATTATAAGTCCAGACATCTAG(SEQ ID NO:176)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0307]引物7f包含与GCYCCTTTYATATGTATACTCAGAGACCCA(SEQ ID NO:177)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物7r包含与TGTTCTTCCAGTTACATAYTGTTGCATAGC(SEQ IDNO:178)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0308]引物8f包含与AAGTGYATGACTGCTCCTGATCARCC(SEQ ID NO:179)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物8r包含与TTGCCAATRTCTCCCACCATRGCATA(SEQ ID NO:180)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0309]引物9f 包含与 GCTCCTTTYATCTGTATCCTCAGAGATCC(SEQ ID NO:181)具有至少 80%的序列同一1注的核酸序列，并且引物9r包含与TGATCTTCCCGTCACATACTGTTGCATG(SEQ IDNO:182)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0310]引物1f 包含与 GGTTATAAGACAATTTCTTGTACAGGARATG(SEQ ID NO:183)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物1r包含与TTTGCAATRTCTCCCACCATRGCATA(SEQ IDNO:184)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0311]引物Ilf 包含与 ATGACTTTTGARGTSGAYCCCATGGA(SEQ ID NO:185)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物Ilr包含与GCCGAGAASGGYGTRCGSAGGTA (SEQ ID NO:186)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0312]引物12f 包含与 AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO:187)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物12r包含与CAGTTATCCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:188)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0313]引物13f 包含与 AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO: 189)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物13r包含与CAGTTATCCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:190)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0314]引物14f 包含与 GAAGGGTCMAACATCTGYTTAACAAG(SEQ ID NO:191)或GGGCAAATATGGARACATACGTGAA(SEQ ID NO:256)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物 14r 包含与 GCTWGTGGGAARAAAGAIACTGATCCTG(SEQ ID NO:192)或 TCTTTTTCTARGACATTGTAYTGAACAGC(SEQ ID NO:257)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0315]引物15f 包含与 CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:193)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物15r包含与GAAACACGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:194)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0316]引物16f 包含与 ATGGGTTGGGATTATCCAAAATGTGA (SEQ ID NO:195)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物16r包含与AGCAGTTGTAGCATCACCGGATGAT (SEQ ID NO:196)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0317]引物17f 包含与 ATGGGTTGGGATTATCCTAARTGTGA (SEQ ID NO:197)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物17r包含与GCAGTAGTTGCATCACCACTRCTAGT(SEQ ID NO:198)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0318]引物18f 包含与 ATGGGTTGGGATTATCCCAAATGTGA (SEQ ID NO: 199)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物18r包含与GCTGTACTAGCRTCACCAGAAGT (SEQ ID NO:200)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0319]引物19f 包含与 ATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGA (SEQ ID NO:201)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物19r包含与GCTGTAGTTGCATCACCAGAAGT (SEQ ID NO:202)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0320]引物20f 包含与 GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC (SEQ ID NO:203)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物20r包含与GCCACIGTGGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO:204)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0321]引物21f 包含与 CACKCCCAGGAARTGACGTAT (SEQ ID NO:205)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物21r包含与CCAGAGATGTTCACTCGCCGGA(SEQ ID NO:206)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0322]弓丨物22f 包含与 GAGTCTTCTAACMGAGGTCGAAACGTA (SEQ ID NO:207)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物22r包含与GGGCACGGTGAGCGTRAA(SEQ ID NO:208)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。 [0323]引物23f 包含与 TCAACAGACACTGTAGACACAGTACT (SEQ ID NO:209)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物23r包含与GTTTCCCGTTATGCTTGTCTTCTAG(SEQ ID NO:210)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0324]引物24f 包含与 ATGGCATCAGTTGGCTAACA(SEQ ID NO:211)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物24r包含与ACAGCCACTGCCCCATT(SEQ IDNO:212)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0325]引物25f 包含与 GGAATAGCCCCCCTACAATTG(SEQ ID NO:213)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物25r包含与AATTCGCATTCTGGGTTTCCTA(SEQ ID NO:214)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0326]引物26f 包含与 CCTTTTTGTTGAACGCAGCAA(SEQ ID NO:215)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物26r包含与CGGATGAGGCAACTAGTGACCTA(SEQ ID NO:216)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0327]引物27f 包含与 GCCGAATGATGCMATMAAYT (SEQ ID NO:217)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物27r包含与CGCACCCATTGGAGTTTGAC(SEQ ID NO:218)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0328]引物28f包含与 TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCATG(SEQ ID NO:219)或GTNAAACTGAGYAGYGGITACAARGA (SEQ ID NO:258)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物 28r 包含与 AATRGTGCACYGCATGTTTCCRTT(SEQ ID NO:220)或GGCIAGAAGIAIRAARCATGAYGCC(SEQ IDNO:259)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列。
[0329]引物29f 包含与 TGCATIGGYYACCARTCAAC(SEQ ID NO:221)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物29r包含与GTTGCACAYARCATYCCATTGTG (SEQ ID NO:222)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0330]引物30f 包含与 AATGTGAYGAYCARTGCATGGA(SEQ ID NO:223)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物30r包含与GAGATGAGGCRACAGTIGAATA(SEQ ID NO:224)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0331]引物31f 包含与 ATTCAGACAGGATGGAACCGTYAA(SEQ ID NO:225)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物31r包含与GATACTAAGCTTTGTTGTGACCTCAT(SEQ ID NO:226)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0332]引物32f 包含与 ACCCGATTRGARGCTTTCAGACAAGA (SEQ ID NO:227)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物32r包含与CTGTTGRGACCGCATGATTGAC(SEQ ID NO:228)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0333]引物33f 包含与 CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:229)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列，并且引物33r包含与GAAACACGGACACCCAAAGTA (SEQ ID NO:230)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0334]引物34f 包含与 AAAGGCATGCAAGACGCTATG(SEQ ID NO:231)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物34r包含与TGTTAAGAACGTCTTTCATTTGCTG(SEQ ID NO:232)具有至少80%的序列同一 性的核酸序列。
[0335]引物35f 包含与 CCTTTCGTGGCAGTTGGGTCA(SEQ ID NO:233)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物35r包含与ACTGAGCTTGATCCGCCCACA (SEQ ID NO:234)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0336]引物36f 包含与 CAAGGGCTATAAAGGCGTTGCT (SEQ ID NO:235)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物36r包含与CATGATAATTGATGGTCGCAGACTT (SEQ ID NO:236)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0337]引物37f 包含与 AATTTCATCGTTCCCGGCAG(SEQ ID NO:237)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物37r包含与GCCGCGTTTACTAATCCCCA(SEQ ID NO:238)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0338]引物38f 包含与 GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA(SEQ ID NO:239)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物38r包含与CTGCGCGGATGCTAATGG(SEQ ID NO:240)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0339]引物39f 包含与 GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO:241)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列，并且引物39r包含与GTAGTATCCTGCGCGGATGCT(SEQ ID NO:242)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0340]引物40f 包含与 TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCACG (SEQ ID NO:243)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物40r包含与GTACGGGCGACCCCACGATGAC(SEQ ID NO:244)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0341]引物41f 包含与 AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO:245)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物41r包含与GAGCGGCTGTCTCCACAAGT (SEQ ID NO:246)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0342]引物42f 包含与 GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC (SEQ ID NO:203)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物42r包含与GCCACIGTGGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO:204)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0343]引物43f 包含与 CARTGGKCITACATGCAYATCKC (SEQ ID NO:264)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物43r包含与GCRCGGGCRAAYTGCACCAG(SEQ ID NO:265)或GCGCGGGCAAACTGCACGAG(SEQ ID NO:266)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0344]引物44f 包含与 GGTGGYAGATGGCGTRCCATA(SEQ ID NO:270)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物 44r 包含与 TCTRACAAACTTACTAGAGGATGGCTG(SEQ ID NO:271))具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0345]引物45f 包含与 ATGGTYTCAGCTATGAACACAGCA(SEQ ID NO:274)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物45r包含与TGCCAGYTTTTGGACGTCTTCTCC(SEQ ID NO:275)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0346]引物46f包含与GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT(SEQ ID NO:171)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物 46r 包含与 CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTCT(SEQ ID NO:172)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0347]引物47f 包含与 CGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGA (SEQ ID NO:278)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物47r包含与CTCATCCCACACCGCTAAAGCGCTT (SEQ ID NO:279)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0348]引物48f 包含与 GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:282)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物48r包含与GAGTGCTAGGTCGGGACGGTGAG(SEQ ID NO:283)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0349]引物49f 包含与 GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:282)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物49r包含与GAGTGCTAGGTCGGGACGGTGAG (SEQ ID NO:283)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0350]序列表同源性/同一性
[0351]多种序列比对方法中的任一种可以用来确定同一性百分数，包括但不限于，整体方法、局部方法和混合法(hybrid methods),诸如例如，片段接近法(segmentapproach methods)。确定同一性百分数的方法是本领域技术人员能力范围内的常规程序。整体方法从分子的开头到末尾比对序列，并且通过加合单个碱基对的评分和通过征收缺口罚分而确定最佳比对。非限制性的方法包括，例如，CLUSTAL W，参见，例如，Julie D.Thompson 等，CLUSTAL W:1mproving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting, Posit1n-Specific Gap Penalties andWeight Matrix Choice，22 (22) Nucleic Acids Research (核酸研究)4673-4680 (1994)；和迭代细化(iterative refinement)，参见，例如，Osamu Gotoh, Significant Improvementin Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement asAssessed by Reference to Structural Alignments, 264 (4) J.Mol.B1l.(分子生物学杂志)823-838 (1996)。局部方法通过鉴别所有输入序列所共有的一个或多个保守基序而比对序列。非限制性的方法包括，例如，匹配盒(Match-box)，参见，例如，Eric Depiereux和 Ernest Feytmans, Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the SimultaneousAlignment of Several Protein Sequences，8 (5) CAB10S501-509 (1992) ;Gibbs 取样，参见，例如，C.E.Lawrence 等，Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategyfor Multiple Alignment, 262 (5131) Science (科学)208-214 (1993) ;Align_M，参见，例如，Ivo Van WaIIe 等,Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly DivergentSequences, 20 (9) B1informatics (生物信息学):1428-1435 (2004)。因此,序列同一性百分数通过常规方法确定。参见，例如，Altschul等，Bull.Math.Bi0.48:603-16,1986以及Henikoff 和 Henikoff，Proc.Natl.Acad.ScL USA(美国国家科学院学报)89:10915-19,1992。
[0352]上文提供的特定序列的变体可以备选地通过引用在所述变体序列与上文提供的具体的参比序列之间不同的核苷酸数目而定义。因此，在一个实施方案中，所述序列可以包含与上文提供的具体序列在不超过2个核苷酸位置处(例如，在不超过I个核苷酸位置处)不同的核苷酸序列(或由其组成)。优选是保守置换。
[0353]例如，关于定义的第一探针(GGCAATGCWG ；SEQ ID NO:1)的变体探针序列可以包含选自下述的核酸序列:GGCAATGCIG(SEQ ID NO:287) ；GGCAATGCAG(SEQ ID NO:288)；GGCAATGCTG(SEQ ID NO:289) ；AGGCAATGCff(SEQ ID NO:290)或 GCAATGCWGCWCC(SEQ ID NO:291)
[0354]关于定义的第二探针(GAYGGGACCR ；SEQ ID NO:2)的变体探针序列的其他实例包括:GAYGGRACCR(SEQ ID NO:292) ；GAYRGGACCR(SEQ ID NO:293) ；GATGGGACCR(SEQ ID NO:294) ；GACGGGACC R(SEQ ID NO:295) ；GAYGGGACCG(SEQ ID NO:296) ；GAYGGGACCA(SEQ ID NO:297) ；AYGGGACCRA(SEQ ID NO:298) ；GGAYGGGACC(SEQ ID NO:299) ；GAYGGGACCI(SEQ ID NO:300) -M GAIGGGACCR(SEQ ID NO:301)。
[0355]关于定义包含限定的核苷酸序列(CACCAGACAC ; SEQ ID NO: 3)的第三探针的变体序列的实例还包括:ACCAGACACA (SEQ ID NO:302) ；GCACCAGACA (SEQ ID NO:303)；CACIAGACAC (SEQ ID NO:304) ；CACCAGAIAC (SEQ ID NO:305) ；CACCffGACAC (SEQ ID NO:306)；CACCAGACffC(SEQ ID NO:307);或 CACCARACAC(SEQ ID NO:308)。
[0356]关于定义包含限定的核苷酸序列(GGTCATTGGR ；SEQ ID NO:4)的第四探针的变体的更多实例包括:GGTCATYGGR(SEQ ID NO:309) ；GGTCATTGGG(SEQ ID NO:310)；GGTCATTGGA(SEQ ID NO:311) ；GTCATTGGRG(SEQ ID NO:312) ；TGGTCATTGG(SEQ ID NO:313)；GGTCATCGGR(SEQ ID NO:314) ；RGTCATTGGR(SEQ ID NO:315) ；AGTCATTGGR(SEQ ID NO:316)；GGTIATTGGR(SEQ ID NO:317);或 GGTCATTIGR(SEQ ID NO:318)。
[0357]关于具有已经限定的核酸序列(CACTGGGCAC:SEQ ID NO:5)的第五探针的变体探针序列的其他实例还包括:ACTGGGCACG(SEQ ID NO:319) ；TCACTGGGCA(SEQ ID NO:320)；CRCTGGGCAC(SEQ ID NO:321) ；CGCTGGGCAC(SEQ ID NO:322) ；CACTGGGIAC(SEQ ID NO:323)；CAITGGGCAC(SEQ ID NO:324) ；CACTGGRCAC (SEQ ID NO:325) ；CACTRGGCAC (SEQ ID NO:326)；或 CACYGGGCAC(SEQ ID NO:327)。
[0358]关于限定的第六探针(RGTGTTCATT ；SEQ ID NO:6)的变体探针序列的实例包括:GRGTGTTCAT (SEQ ID NO:328) ；GTGTTCATTT (SEQ ID NO:329) ；AGTGTTCATT (SEQ ID NO:330)；GGTGTTCATT(SEQ ID NO:331) ；RGTGTTIATT(SEQ ID NO:332) ；RGTRTTCATT(SEQ ID NO:333)；RGTGTTCAffT(SEQ ID NO:334) ；RGTGTffCATT(SEQ ID NO:335) ；RGTGTTCffTT(SEQ ID NO:336)；或 RGIGTTCATT(SEQ ID NO:337)。[0359]还可以使用上文提及的序列(以及上文限定的其序列变体)的片段，例如，包含本文所述的限定的序列的10，9，8，7，6，5，4，3，2或I个碱基对的片段。
[0360]实施例1-H5组攻击
[0361]为了证实我们的测定的准确性，制备包含41个孔的测试卡-所述孔分别负载有各
自的第一至第四十一探针。
[0362]我们用已知的病毒H5 流感水平组(H5influenza proficiency panel of viruses)对测试卡进行攻击。所用的方法包括下述步骤:50°C，5mins(RT) ;95°C，20秒；95°C，1秒x45 ;和 60°C, 20 秒。
[0363]参见表1 (见下)，预测的Ct结果显示在左侧列，并且测试卡结果显示在最右侧列。在实时PCR测定中，阳性反应通过荧光信号的累积进行检测。Ct(循环阈值(cyclethreshold))值定义为荧光信号超过阈值(即，超过背景水平)所需要的循环数。
[0364]测试卡的结果正确地指明所有的样品。显著地，测试卡探针正确地指明样品G*中的达菲抗药性/敏感 性混合物，并且两种H5N1分离株正确地响应所有三种相关的探针。测试卡探针还正确地将所有样本分型为H1/H3季节性和Hlv2009，所有其他探针的结果是阴性的。
【权利要求】
1.一种用于检测样品中存在至少六种引起呼吸道感染的微生物中的一种或多种或检测所述样品中不存在所述引起呼吸道感染的微生物的单路方法，所述方法包括: A)将样品应用到测试卡上，其中所述测试卡包括六个分离的孔: 1)包含第一探针的第一孔，其中所述第一探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与核酸序列GGCAATGCWG(SEQ ID NO:1)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 2)包含第二探针的第二孔，其中所述第二探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与核酸序列GAYGGGACCR(SEQ ID NO:2)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 3)包含第三探针的第三孔，其中所述第三探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与核酸序列CACCAGACAC(SEQ ID NO:3)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 4)包含第四探针的第四孔，其中所述第四探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与核酸序列GGTCATTGGR(SEQ ID NO:4)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 5)包含第五探针的第五孔，其中所述第五探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与核酸序列CACTGGGCAC(SEQ ID NO:5)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 6)包含第六探针的第六孔，其中所述第六探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与核酸序列RGTGTTCATT (SEQ ID NO:6)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； B)允许所述样品中存在的核Ife与所述孔中的探针接触； C)检测其中样品核酸已经结合所述探针中的一种或多种的结合核酸复合物的存在； 其中结合核酸复合物的存在证实在所述样品中存在来自所述六种引起呼吸道感染的微生物中的一种或多种的核酸，并且其中不存在结合核酸复合物证实在所述样品中不存在来自所有所述六种引起呼吸道感染的微生物的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试卡包括选自下述的一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针: 7)包含第七探针的第七孔，其中所述第七探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQID NO:7的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 8)包含第八探针的第八孔，其中所述第八探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQID NO:8的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 9)包含第九探针的第九孔，其中所述第九探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQID NO:9的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 10)包含第十探针的第十孔，其中所述第十探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 11)包含第十一探针的第十一孔，其中所述第十一探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:11的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 12)包含第十二探针的第十二孔，其中所述第十二探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:12的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 13)包含第十三探针的第十三孔，其中所述第十三探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
3.根据权利要求8所述的方法，其中所述测试卡包括所述另外的第七至第十三孔以及相应的第七至第十三另外的探针中的每一种。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试卡包括选自下述的一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针: 14)包含第十四探针的第十四孔，其中所述第十四探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 15)包含第十五探针的第十五孔，其中所述第十五探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 16)包含第十六探针的第十六孔，其中所述第十六探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:16的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 17)包含第十七探针的第十七孔，其中所述第十七探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:17的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 18)包含第十八探针的第十八孔，其中所述第十八探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:18的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 19)包含第十九探针的第十九孔，其中所述第十九探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:19的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 20)包含第二十探针的第二十孔，其中所述第二十探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:20的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 21)包含第二十一探针的第二十一孔，其中所述第二十一探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:21的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 22)包含第二十二探针的第二十二孔，其中所述第二十二探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:22的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 23)包含第二十三探针的第二十三孔，其中所述第二十三探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 24)包含第二十四探针的第二十四孔，其中所述第二十四探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:24的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 25)包含第二十五探针的第二十五孔，其中所述第二十五探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:25的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 26)包含第二十六探针的第二十六孔，其中所述第二十六探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:26的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 27)包含第二十七探针的第二十七孔，其中所述第二十七探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:27的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 28)包含第二十八探针的第二十八孔，其中所述第二十八探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 29)包含第二十九探针的第二十九孔，其中所述第二十九探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:29的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 30)包含第三十探针的第三十孔，其中所述第三十探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:30的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 31)包含第三十一探针的第三十一孔，其中所述第三十一探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:31的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 32)包含第三十二探针的第三十二孔，其中所述第三十二探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:32的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列；33)包含第三十三探针的第三十三孔，其中所述第三十三探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:33的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述测试卡包括所述另外的第十四至第三十三孔以及相应的第十四至第三十三另外的探针中的每一种。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试卡包括选自下述的一个或多个另外的孔和相应的一种或多种另外的探针: 34)包含第三十四探针的第三十四孔，其中所述第三十四探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:34的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 35)包含第三十五探针的第三十五孔，其中所述第三十五探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:35的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 36)包含第三十六探针的第三十六孔，其中所述第三十六探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:36的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 37)包含第三十七探针的第三十七孔，其中所述第三十七探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 38)包含第三十八 探针的第三十八孔，其中所述第三十八探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 39)包含第三十九探针的第三十九孔，其中所述第三十九探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述测试卡包括所述另外的第三十三至第三十九孔以及相应的第三十三至第三十九另外的探针中的每一种。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试卡包括选自下述的一个或多个另外的对照孔和相应的一种或多种另外的对照探针: 40)包含第四十探针的第四十孔，其中所述第四十探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:40的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 41)包含第四十一探针的第四十一孔，其中所述第四十一探针具有核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:41的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述测试卡包括所述另外的第四十或第四十一孔以及相应的第四十或至四十一另外的探针中的一个或两个。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在检测之前包括核酸扩增步骤。
11.用于根据前述权利要求中任一项所述的方法的测试卡，其中所述测试卡包括多个孔，其中提供至少六个孔，并且其中第一孔包括前述权利要求限定的本发明的所述第一探针，第二孔包括前述权利要求限定的本发明的所述第二探针，第三孔包括前述权利要求限定的本发明的所述第三探针，第四孔包括前述权利要求限定的本发明的所述第四探针，第五孔包括前述权利要求限定的本发明的所述第五探针，并且第六孔包括前述权利要求限定的本发明的所述第六探针。
12.根据权利要求11所述的测试卡，其还包括另外的第七至第十三孔中的一个或多个(优选全部)，其中所述孔包含各自的第七至第十三探针。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的测试卡，其还包括另外的第十四至第三十三孔中的一个或多个(优选全部)，其中所述孔包含各自的第十四至第三十三探针。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的测试卡，其还包括另外的第三十四至第三十九孔中的一个或多个(优选全部)，其中所述孔包含各自的第三十四至第三十九探针。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的测试卡，其还包括另外的第四十和第四十一孔中的一个或两个(优选两个)，其中所述孔包含各自的第四十和第四十一探针。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的测试卡，其中所述探针固定在各自的孔的表面上；优选其中所述探 针以吸附在所述各自的孔的表面上的冻干形式存在。
【文档编号】C12Q1/70GK104039981SQ201280060710
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月10日 优先权日:2011年12月9日
【发明者】马丁·柯伦 申请人:英国卫生部