具有运铁蛋白肽的外切体的制作方法

具有运铁蛋白肽的外切体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在其表面上包括运铁蛋白靶向部分的外切体，产生它们的方法，和此类外切体用于体内递送遗传物质和/或生物治疗性蛋白或肽或化疗试剂的用途，尤其涉及此类外切体在基因疗法或基因沉默、或递送其他治疗剂的方法中的用途。
【专利说明】具有运铁蛋白肽的外切体 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及将外切体靶向期望的细胞类型或组织。具体而言，本发明涉及外切体， 和产生它们的方法，所述外切体包括在外切体的表面上表达的靶向部分。 【背景技术】
[0002] 核酸常规上用于基因疗法用于替换非功能基因[1]，并且经RNA干扰（RNAi)效应 器分子比如miRNAs[2]、 ShRNAs[3]和siRNAs[4]用于抵消致病的突变。由于快速清除[5]、 核酸酶[6]、缺乏器官特异性分布和低效的细胞摄取，裸露DNA和RNA难以在体内递送，通常 专用的基因递送载体用于递送。
[0003] 病毒载体和阳离子脂质体是最前沿的递送载体技术并且已经是相对成功的，大量 的这些递送载体已经在临床试验中[7]。尽管这些成功，仍有明显的局限限制许多应用，最 显著的局限是对于大部分病毒载体的免疫识别[8,9,10]和对于病毒比如慢病毒的诱变整 合[11];和炎症毒性和对于脂质体的快速清除[12,13,14,15]。通过先天免疫系统的识别 导致急性炎症反应，其可需要使用免疫抑制策略以克服现有策略潜在地将患者暴露于机会 性感染的冒险的摄取和再施用问题[16,17,18]。针对递送媒介产生的抗体也使得在随后的 施用中转基因表达急剧地减少[19]。
[0004] 现有策略的固有风险和限制已经通常将它们限于治疗的益处明显超过风险的威 胁人类生命的疾病，比如重症联合免疫缺陷[20]，限于特定环境比如类似眼的免疫豁免部 位中的疾病[1]，或用于基因接种[21]。但是，对于慢性的和使人虚弱但不是危及生命的遗 传疾病，比如肌强直性营养不良，需要相当更低的风险特征并且维持矫正基因治疗的能力 几十年，不是几年，用于治疗介入。对于次类疾病潜在地不可接受的风险的例子是以上讨论 的免疫抑制策略，突出的是由于试验管理员未知的对象服用的免疫抑制剂[22]引起的机 会性感染，在最近的风湿性关节炎的AAV基因治疗试验中健康患者的死亡。随着逐渐增多 数量的疾病显示具有遗传成分，包括肥胖、心脏疾病和精神疾病，有很大的可能性修饰易感 基因用于预先的遗传方案，但是仅仅如果风险进一步下降并且实现长期的维持能力。因此， 需要开发这样的技术，其能够避免免疫识别和炎症，同时保留好的递送效率，以便扩展基因 疗法在致死疾病之外的用途。
[0005] 方案之一可能在于使用特异性靶向待治疗的细胞类型或器官的外切体用于基因 递送。外切体是内吞起源的小膜结合囊泡（30-100nm)，其在多泡体与质膜融合之后释放进 入细胞外环境。已经对许多免疫细胞，包括B细胞、T细胞和树突细胞（DC)描述了外切体 产生。衍生自B淋巴细胞和成熟DC的外切体表达MHC-II、MHC-I、⑶86和ICAM-1 [23, 24]， 并且在实验模型和临床试验中已经用于诱导特定的抗肿瘤T细胞毒素应答和抗肿瘤免疫 [24, 25]。外切体介导的基因递送的潜能已经由递送鼠 mRNAs和miRNAs至人肥大细胞显示 [26]，并且神经胶质瘤衍生的外切体[27]已经表明将外源DNA质粒产生的mRNA转移至异 源细胞。也已经公开了具有外源DNA、siRNA和其他修饰寡核苷酸的外切体[28]。
【发明内容】

[0006] 本发明人也已成功地将靶向部分引入外切体，从而外切体可被靶向所选择的组 织。尤其，本发明人已成功地将运铁蛋白（Tf)肽靶向部分引入外切体，从而外切体可被靶 向表达运铁蛋白受体（TfR)的组织或细胞。本发明人已经显示表达Tf肽靶向部分的外切 体具有与商业上可获得的常规的转染试剂比如lipofectamine和RNAi max相当的摄取效 率。因此，本发明涉及在表面上包括Tf肽靶向部分的外切体、包括外切体跨膜蛋白和靶向 部分的融合蛋白，并且涉及编码此类融合蛋白的核酸构建体。Tf靶向外切体可用货物比如 外源遗传物质或生物治疗性蛋白和/或肽、和/或化疗试剂装载并且用于货物的递送，尤其 用于核酸的递送用于基因治疗和基因沉默，以及生物治疗性蛋白和肽和化疗试剂的递送用 于治疗。
[0007] 根据本发明的一个方面，提供了包括外切体的组合物，其中外切体包括在外切体 的表面上表达的靶向部分，并且所述靶向部分是运铁蛋白（Tf)多肽或肽。Tf多肽靶向部分 或Tf肽靶向部分可以是保留与TfR结合的能力的任何Tf多肽或Tf肽。
[0008] 在另一方面中，本发明提供包括外切体的组合物，其用于体内递送遗传物质、蛋白 质和/或肽的方法中，该外切体包括在外切体的表面上表达的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶 向部分，其中该外切体衍生自不成熟的树突细胞。
[0009] 在另一方面中，本发明提供产生外切体的方法，该外切体包括在外切体的表面上 表达的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部分，该方法包括在用于产生外切体的细胞中表达包 括靶向部分和外切体跨膜蛋白的融合蛋白，其中随着该细胞产生融合蛋白，表达的融合蛋 白并入外切体。
[0010] 在另一方面中，本发明提供包括外切体跨膜蛋白和异源靶向蛋白、多肽或肽的多 肽，其中靶向蛋白、多肽或肽是与在待靶向的细胞表面上存在的TfR结合的Tf多肽或Tf 肽，并且其中当多肽存在于外切体中时，该靶向Tf多肽或Tf肽存在于外切体的表面上。
[0011] 在另一实施方式中，本发明提供编码多肽的多核苷酸构建体，其中该构建体包括 编码5'外切体跨膜信号序列的多核苷酸，例如内质网靶向信号肽，其可操作地连接至编码 本发明多肽的多核苷酸。
[0012] 在另一实施方式中，本发明提供将外切体靶向所选择的组织或细胞类型的方法， 所述方法包括用根据本发明的多核苷酸构建体转染宿主细胞，在宿主细胞中表达构建体， 和从已经表达该构建体的宿主细胞中获得外切体。 【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA应用至具有电穿孔的（E)非靶向的外切体（Exo非靶向的）、Tf-靶向的外切体（Exo Tf)或RVG靶向的外切体（Exo RVG)的HEK细胞的代表性图像。添加非电穿孔的外切体和 siRNA (NE)作为阴性对照并且添加 siRNA和常规的转染试剂（LIP0和RNAi max)作为阳性 对照。
[0014] 图2.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA 应用至具有电穿孔的（E)非祀向的外切体（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切体（Exo Tf) 或RVG靶向的外切体（Exo RVG)的B2M17细胞的代表性图像。添加非电穿孔的外切体和 siRNA(NE)作为阴性对照并且添加 siRNA和常规的转染试剂（LIPO和RNAi max)作为阳性 对照。
[0015] 图3.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA 应用至具有电穿孔的（E)非祀向的外切体（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切体（ExoTf)或 RVG靶向的外切体（Exo RVG)的脑神经瘤细胞（Neur〇2a)的代表性图像。添加非电穿孔的 外切体和siRNA (NE)作为阴性对照并且添加 siRNA和常规的转染试剂（LIP0和RNAi max) 作为阳性对照。
[0016] 图4.用外切体介导的siRNA递送敲低GAPDH: (a，b)是将Cy5-标记的GAPDH siRNA 应用至具有电穿孔的（E)非祀向的外切体（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切体（Exo Tf)或 RVG靶向的外切体（Exo RVG)的小鼠骨髓树突细胞的代表性图像。添加非电穿孔的外切体 和siRNA (NE)作为阴性对照并且添加 siRNA和常规的转染试剂（LIP0和RNAi max)作为阳 性对照。 【具体实施方式】
[0017] 本发明涉及外切体，以及它们作为递送媒介的用途。外切体是内吞起源的小膜结 合囊泡，其在多泡体与质膜融合之后被释放进入细胞外环境。因此，本申请涉及包括此类外 切体的组合物。典型地，外切体的直径在30和100nm之间，但是可包括多达200nm的相似 起源的膜颗粒。如本文所使用，外切体指由多泡体分泌的内体起源的纳米颗粒。
[0018] 外切体由许多不同类型的细胞产生，包括免疫细胞比如B淋巴细胞、T淋巴细胞、 树突细胞（DC)和肥大细胞。外切体也由以下产生，例如神经胶质瘤细胞、血小板、网织红细 胞、神经元、小肠上皮细胞、肿瘤细胞、HELA细胞、人胚胎肾细胞（HEK细胞）、B2M17细胞、 Bend3细胞、原代骨髓衍生的树突细胞、BV-2小胶质细胞和脑神经瘤（NEUR02A)细胞。根据 本申请使用的外切体可衍生自任何适合的细胞，包括以上识别的细胞。外切体也已经从生 理液体分离，比如血浆、尿、羊膜液和恶性积液。
[0019] 在本发明的优选方面中，外切体衍生自DC，优选不成熟的DC。由不成熟的DC产生 的外切体不表达MHC-II、MHC-I或⑶86。如此，此类外切体不明显刺激幼稚T细胞并且不 能在混合的淋巴细胞反应中诱导应答。因此，由不成熟的树突细胞产生的外切体是用于递 送货物，比如遗传物质，尤其用于体内使用，例如基因疗法中的理想候选物。
[0020] 因此，根据本发明的一个方面，提供衍生自树突细胞的外切体，用于货物--比如 遗传物质和蛋白质和/或肽生物治疗剂或化疗剂--的体内靶向递送。在优选的实施方式 中，本发明的外切体衍生自树突细胞并且提供用于遗传物质、蛋白质或肽生物治疗剂或化 疗剂的体内靶向递送。
[0021] 如上所概述，外切体由许多不同类型的细胞产生并且也已经从生理液体分离。因 此，根据本发明，外切体可从以上讨论的任何合适的细胞类型获得，或通过从生理液体分离 获得。典型地，本发明的方法包括从细胞培养基或组织上清液分离外切体。
[0022] 可通过任何合适的方法从培养基收集由细胞产生的外切体。典型地，外切体的 制品可通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织上清液制备。例如，外切体 可通过如下制备：差速离心，即低速（<20000g)离心以使较大颗粒成团，接着通过高速 OlOOOOOg)离心以使外切体成团、用合适的过滤器（例如，0.22 μ m过滤器）的粒度过滤、 梯度超速离心（例如，蔗糖梯度）或这些方法的组合。
[0023] 根据本发明，本发明的外切体可用外源遗传物质、蛋白质或肽或化疗剂装载。尤 其，根据本发明，可制备外切体并且然后用期望的遗传物质、蛋白质或肽、或化疗剂装载，用 于靶向递送。外切体也可用外源遗传物质或生物治疗性蛋白或肽装载，通过在细胞中过表 达编码遗传物质或蛋白质或肽的合适的构建体，从而将物质装载进入外切体。
[0024] 相比递送这种分子的常规手段，Tf_靶向的外切体递送外源遗传物质、蛋白质或肽 的用途提供了许多优势。例如，当化合物使用外切体递送时，它们被保护避免降解并且更 稳定；化合物可被递送至靶组织，比如特定类型的癌症，比如果没有封装在外切体内更有效 和/或更特异；和/或该货物可能不太可能引起免疫应答，因为它包含在外切体中并且所以 不能自由地被免疫细胞探测到，和/或结合抗体。Tf-靶向的外切体递送外源遗传物质、蛋 白质或肽或化疗剂用途的其他潜在的优势包括在外切体的全身性递送之后绕过肝细胞和/ 或避免耐药性，比如药物转运体比如ABC-转运体的上调。
[0025] 用于递送的适合的遗传物质包括外源DNA质粒和siRNA。合适的遗传物质也包括 修饰的寡核苷酸和其他RNA干扰效应器部分比如miRNA和shRNA。根据本发明的一个方面， 装载进入外切体的遗传物质不是通常与外切体相关的遗传物质，例如，核酸优选地不是当 其由细胞产生时并入外切体的mRNA或miRNA。尤其，遗传物质可装载进入已经与细胞分离 的外切体制品。可选地遗传物质可以在细胞中过表达，例如通过将合适的构建体引入细胞， 并且随后装载进入外切体。因此，外源遗传物质指包括通常与外切体不相关的核酸的遗传 物质。在尤其优选的实施方式中，核酸物质是通常不出现在外切体中的质粒DNA或其他核 酸比如siRNA和修饰的寡核苷酸。
[0026] 相似地，优选地装载进入外切体的蛋白质或肽不是通常与外切体相关的蛋白质或 肽，例如，蛋白质或肽优选地不是当其由细胞--比如未修饰的细胞--产生时被并入外 切体的蛋白质或肽。外源蛋白质或肽指包括通常与外切体不相关的蛋白质或肽的蛋白质或 肽。此类外源蛋白质或肽可装载进入已经与细胞分离的外切体，或通过在宿主细胞中过表 达合适的构建体，以便蛋白质或肽被装载进入外切体。在尤其优选的实施方式中，待装载进 入外切体的蛋白质或肽是抗体或抗体片段，更优选地是单克隆抗体或其片段。
[0027] 用于并入外切体的核酸可以是单链的或双链的。单链核酸包括具有磷酸二酯、 2' 0-甲基、2'甲氧乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和/或磷酸酯骨架化学的那些。通常，引 入的双链核酸包括例如质粒DNA和小干扰RNAs (siRNAs)。
[0028] 用于病况、疾病或不适的治疗和/或预防的任何生物治疗性蛋白和/或肽可并入 根据本发明的外切体。在优选的实施方式中，并入外切体的蛋白质或肽是抗体或抗体片段。 在更优选的实施方式中，抗体是单克隆抗体或其片段。
[0029] 外切体也可用化疗剂--比如治疗药剂--装载，用于化疗剂的递送。合适的药 剂的例子包括细胞毒素剂，例如用于癌症的治疗。
[0030] 基于遗传物质、蛋白质或肽对其期望递送进入细胞的效果和进行该效果的机理选 择待装载进入外切体的遗传物质、蛋白质或肽。例如，核酸可用于基因治疗，例如为了在细 胞或细胞组中表达期望的基因。此类核酸通常以编码期望基因的质粒DNA或病毒载体的形 式，并且其可操作地连接至合适的调节序列比如启动子、增强子等，使得一旦其被递送至待 治疗的细胞，则表达质粒DNA。对基因治疗易感的疾病的例子包括血友病B (因子IX)、囊性 纤维化（CTFR)和脊髓性肌萎缩（SMN-1)。
[0031] 核酸可也用于例如免疫以表达期望针对其产生免疫应答的一种或多种抗原。因 此，待装载进入外切体的核酸可编码期望针对其产生免疫应答的一种或多种抗原，包括但 不限于肿瘤抗原，来自病原体比如病毒、细菌或真菌病原体的抗原。
[0032] 核酸也可用于基因沉默。这种基因沉默可在治疗中用于关闭异常基因表达或在 动物模型研究中用于产生单个或更多个遗传敲除。通常，此类核酸以siRNAs的形式提供。 例如，包括siRNAs的RNAi分子可用于在肌细胞中敲低具有多个CUG重复的DMPK以治疗 肌强直性营养不良。在其他实施例中，表达减少造成亨廷顿病的突变体亨廷顿基因（htt) 的shRNA的质粒可用神经元特异外切体递送。其他靶基因包括用于治疗阿尔茨海默氏疾病 的BACE-1。一些癌基因也可用siRNA或shRNAs比如ras、c-myc和VEGFR-2靶向。脑靶向 siRNA装载的外切体可尤其用于阿尔茨海默氏疾病中BACE-1的沉默、帕金森疾病中α -突 触核蛋白（synuclein)的沉默、亨廷顿疾病中htt的沉默和用于治疗中风以降低缺血损坏 的神经元胱冬酶-3的沉默。
[0033] 可使用包括2' -Ο-Me化合物和PNA的反义修饰的寡核苷酸。例如，此类寡核苷酸 可设计为诱导外显子跳跃，例如突变体抗肌萎缩蛋白基因可被递送至肌细胞用于治疗杜兴 氏肌营养不良症，例如抑制发夹环的反义寡核苷酸用于治疗肌强直性营养不良和例如反式 剪接寡核苷酸用于治疗脊髓性肌萎缩。
[〇〇34] 作为用遗传物质装载本发明外切体的可选项，可装载蛋白质或肽。用于病况、疾病 或不适的治疗和/或预防的任何生物治疗性蛋白和/或肽可并入根据本发明的外切体。在 优选的实施方式中，并入外切体的蛋白质或肽是抗体或抗体片段。单个蛋白质或肽可并入 外切体。可选地，多于一种的蛋白质和/或肽可并入外切体。多于一种的蛋白质和/或肽 可作用在相同的或不同的靶上以带来其治疗和/或预防效果。
[0035] 待并入外切体的蛋白质和/或肽可例如用于癌症的治疗和/或预防。可使用蛋白 质或肽生物治疗剂治疗的癌症的例子包括白血病、结直肠癌、头颈癌、非霍奇金氏淋巴瘤、 乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、腺癌和实体肿瘤。此类生物治疗性蛋白和/或肽 典型地是抗体或其片段，尤其是单克隆抗体或其片段。
[〇〇36] 蛋白质和/或肽生物治疗也可用于自身免疫性疾病的治疗和/或预防。自身免疫 性疾病起因于身体对通常存在于身体中的物质、组织和器官的过度活跃的免疫应答。
[0037] 装载进入根据本发明的外切体的生物治疗性蛋白和/或肽也可用于治疗和/或预 防其他病况，包括心血管疾病、血友病、脓毒、中风、包括杜兴氏肌营养不良（DMD)的肌营养 不良、黄斑变性和阿尔茨海默氏疾病。
[0038] 在优选的实施方式中，装载进入根据本发明的外切体的生物治疗剂是治疗性 抗体。在更优选的实施方式中，治疗性抗体选自用于封闭Bace-Ι和b-淀粉样蛋白 (b-amyloids)的活化位点的单克隆抗体；针对成胶质细胞瘤激酶的单克隆抗体和针对α4 整联蛋白质用于治疗MS的抗体，例如那他珠单抗（Natalizumab)。
[0039] 在优选的实施方式中，装载进入根据本发明的外切体的生物治疗剂是肽。在 更优选的实施方式中，肽选自用于引起对病毒和/或肿瘤抗原的免疫应答的免疫显性 (immune-dominant)肽；神经保护肽，比如δ -阿片样物质受体配体，例如Biphalin ;用于 神经炎症的免疫抑制肽，例如肾上腺髓质素和结合并且抑制NfKB信号传导的NBD肽。
[0040] 外源遗传物质、蛋白质或肽或化疗剂可通过许多不同的技术引入外切体。例如，夕卜 切体可通过电穿孔或使用转染试剂装载。尽管外切体的小尺寸，仍可能使用电穿孔用外源 遗传物质装载外切体[W02010/119256]。考虑到与细胞相比外切体的小尺寸，这是令人吃惊 的。考虑外切体的尺寸，用于细胞电穿孔的电压的外推将提示外切体的电穿孔将需要超高 电压。但是，令人吃惊地，使用电穿孔用质粒DNA和siRNA装载外切体是可能的。电穿孔条 件可根据货物的电荷和尺寸而改变。典型的电压范围为20V/cm至1000V/cm，比如20V/cm 至100V/cm，电容通常在25 μ F和250 μ F之间，比如25 μ F和125 μ F之间。对于用抗体装 载本发明的外切体，范围为150mV至250mV，具体地200mV的电压是优选的。
[0041] 外切体也可使用转染剂装载。尽管外切体的小尺寸，常规的转染试剂可用于用遗 传物质转染外切体。根据本发明使用的优选的转染试剂包括阳离子脂质体。
[0042] 外切体也可通过用核酸构建体转化或转染宿主细胞装载，所述核酸构建体表达感 兴趣的遗传物质或生物治疗性蛋白或肽，以便随着在细胞中产生外切体，遗传物质、生物治 疗性蛋白或肽摄入外切体。
[0043] 靶向
[0044] 根据本发明，外切体靶向期望的细胞类型或组织。通过在外切体的表面上表达靶 向部分实现该靶向，所述靶向部分结合在待靶向的细胞表面上表达的细胞表面部分。根据 本发明，靶向部分是运铁蛋白（Tf)多肽或肽。在优选的实施方式中，靶向部分是Tf肽。典 型地，Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部分表达为与通常在外切体的表面上表达的跨膜蛋白 的融合蛋白。
[0045] Tf是糖蛋白，其以高亲和力可逆地结合铁。人运铁蛋白（Tf-h)由具有698个氨 基酸残基的单条多肽链组成并且分子量为约80kDa。Tf-h的多肽序列显示在SEQ ID NO: 1 中。人Tf基因的多核苷酸序列显示在SEQIDN0:2中。Tf-h以高亲和力结合两个Fe3+离 子。四个不同的具有不同铁含量的同种型Tf共存在血浆中 ：（l)ap〇-运铁蛋白（APOTf，没 有铁离子）；（2)单铁运铁蛋白（铁在C-末端结构域）；（3)单铁运铁蛋白（铁在N-末端结 构域）和（4)二铁运铁蛋白（铁在两个结合位点）。在本发明的上下文中，Tf包括任何这 四个同种型，单独或彼此组合。
[0046] Tf受体（TfR)是二硫化物-连接的同型二聚体糖蛋白，其在许多肿瘤的细胞表面 高度表达。在本发明的优选实施方式中，存在于待被本发明的外切体靶向的细胞上的部分 是TfR，其结合在外切体的表面上表达的Tf多肽或Tf肽靶向部分。
[0047] 更详细地，本发明的外切体可通过在它们表面上表达Tf多肽靶向部分或Tf肽靶 向部分，靶向具体的细胞类型或组织。合适的肽是结合在待靶向细胞的细胞表面上出现的 细胞表面部分比如受体或它们的配体的那些。在优选的实施方式中，Tf多肽靶向部分或Tf 肽靶向部分结合待靶向细胞的细胞表面上的TfR。合适的靶向部分的例子是短肽和完整的 Tf蛋白，只要靶向部分可在外切体的表面上表达并且不干扰膜蛋白插入外切体。典型地，靶 向肽相对于跨膜外切体蛋白是异源的。肽靶向部分的长度可通常小于100个氨基酸，例如 小于50个氨基酸的长度，小于30个氨基酸的长度，至10、5或4个氨基酸的最小长度。
[0048] 在优选的实施方式中，最小Tf靶向部分的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的Tf蛋白的 氨基酸50至56,即氨基酸序列PSDGPSV(SEQ ID N0:4)。
[0049] 在尤其优选的实施方式中，Tf靶向多肽或肽由下述组成或包括下述：氨基酸序列 CRTIGPSVC(SEQ ID N0:3)和/或SEQ ID N0:1的Tf蛋白的氨基酸50至56,即氨基酸序列 PSDGPSV(SEQ ID N0:4)〇
[0050] 包括SEQ ID N0S:3或4的氨基酸序列的肽片段可用作本发明的靶向部分。这些片 段的长度可为10个氨基酸或更短，20个氨基酸或更短的长度，30个氨基酸或更短的长度， 50个氨基酸或更短的长度，100个氨基酸或更短的长度或更多。在优选的实施方式中，片段 的长度为10个氨基酸或更短。片段优选地是SEQ ID NO: 1的Tf蛋白片段。全长Tf蛋白可 也用作本发明外切体中的靶向部分。
[0051] TfR在不成熟的红系细胞、胎盘组织和快速分裂的正常和恶性细胞中高度表达。因 此，比如例如Tf蛋白、多肽和肽靶向部分可用于靶向具体的组织类型，或靶向患病的组织 比如肿瘤。在本发明尤其优选的实施方式中，外切体靶向肿瘤。
[0052] 本发明的Tf靶向外切体可特别有利地使货物能够递送至所有的细胞类型并且跨 物种。这是因为Tf在跨物种中是高度保守的并且TfR在许多细胞类型的表面上普遍表达。 因此，例如，本发明的小鼠外切体可被人细胞摄取并且本发明的人外切体可被小鼠细胞摄 取。如此，Tf靶向外切体可认为是通用的体外转染试剂。另外，体内Tf靶向外切体理想地 用于靶向具有提高的TfR表达的靶向组织，比如血脑屏障（BBB)的内皮细胞，肿瘤细胞和局 部缺氧的位点（如在心脏的局部缺血或中风后的局部缺血）。
[0053] 因此，本发明的Tf靶向外切体的潜在用途包括横跨BBB的遗传和非遗传货物的靶 向；癌症疗法对肿瘤的靶向，因为相对于周围组织，肿瘤细胞表达显著提高水平的TfR ;和 疗法对涉及局部缺血的疾病的靶向，比如其中也具有提高水平的TfR表达的缺血性心脏病 和中风。
[0054] 与非靶向的外切体相比，在根据本发明的外切体的表面上Tf靶向部分的表达可 增加由靶细胞对所述外切体和其货物的摄取至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至 少十倍或至少二十倍。与使用常规商业上可获得的转染试剂比如lipofectamine或RNAi max递送相同的货物的摄取水平相比，在根据本发明的外切体的表面上Tf靶向部分的表达 可产生的靶细胞对外切体货物的摄取水平相当。可选地，与使用常规商业上可获得的转染 试剂递送相同的货物的摄取水平相比，在根据本发明的外切体的表面上Tf靶向部分的表 达可增加通过靶细胞对外切体货物的摄取至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少 十倍或至少二十倍。
[0055] 通过将其表达为与外切体跨膜蛋白的融合蛋白，Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部 分在外切体的表面上表达。已知许多蛋白质与外切体相关；即随着其形成，它们被并入外 切体。根据本发明使用的优选的蛋白质是跨膜蛋白的那些。例子包括但不限于Lamp-1、 Lamp-2、CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、 ICAM-1、整合蛋白 a4、LiCAM、LFA-l、Mac-la 和 @、Vti-lA 和B、CD3e 和 4、CD9、CD18、 CD37、CD53、CD63、CD81、CD82、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I 或MHC-II组分、TCRi3和四次跨膜蛋白。在本发明尤其优选的实施方式中，跨膜蛋白选自 Lamp-1、Lamp-2、0)13、0)86、Floti 11 in、Syntaxin-3。在尤其优选的实施方式中，跨膜蛋白 是Lamp-2。Lamp-2的序列在SEQ ID N0:5中示出。
[0056] 以下部分涉及本发明的所有多肽的一般特征，并且尤其涉及包括在本发明的多肽 内的氨基酸序列的变体、改变、修饰或衍生。应当理解，本文所述的多肽的此类变体、改变、 修饰或衍生遵守这样的要求，使多肽保留如可在本公开的随后部分详细说明的任何进一步 要求的活性或特征。
[0057] 本发明多肽的变体可通过具体水平的氨基酸同一性限定，其在本公开随后部分详 细描述。氨基酸同一性可使用任何适合的算法计算。例如PILEUP和BLAST算法可用于 计算同源性或排列（line up)序列（比如鉴定等同或相应的序列（通常根据它们的缺省 设置），例如如在 Altschul S.F. (1993) J Mol Evol36:290-300 ;Altschul，S，F 等（1990) J Mol Biol215:403-10中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国立生物技术信息中心 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)公众可获得的。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中 的短字长W鉴定高打分序列对（HSPs)，当与数据库序列中相同的长度的字比对时，所述长 度W的短字匹配或满足一些正值阈值打分T。T称为邻近字打分阈值（Altschul等，见上）。 这些初始邻近词命中用作开始搜索的种子，以发现包含它们的HSP。词命中沿着每条序列 的两个方向延伸，只要积累的比对打分可以增加。在下述情况下，停止在每个方向上词击 中的延伸：积累比对打分从其最大达到的值减少了 X值；由于一个或多个负打分残基比对 的积累，积累打分变成零或更小；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比 对的灵敏度和速度。BLAST程序使用11的字长（W)、BL0SUM62打分矩阵（见Henikoff和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89 :10915-10919)、50 的比对（B)、10 的期望（E)、 Μ = 5、N = 4,和比较两条链作为缺省。
[0058] BLAST算法进行两条序列之间的相似度的统计分析；见例如，Karl in和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5787。BLAST 算法提供的相似度的一种 测量是最小和概率（P (N))，其提供两个核苷酸序列或者氨基酸序列之间偶然发生匹配的概 率的指示。例如，如果比较第一序列与第二序列，最小和概率小于约1，更优选小于约0.01， 以及最优选小于约〇. 001，那么认为序列与另一序列相似。可选地，UWGCG包提供BESTFIT 程序，其可用于计算同源性（例如使用其缺省设置）（Devereux等（1984)Necleic Acids Researchl2,387-395)。
[0059] 应当理解多肽的变体也包括替代变体。替代变体优选地涉及一个或多个氨基酸用 相同数量的氨基酸的替代并且产生保守氨基酸替代。例如，氨基酸可用具有类似性质的可 选氨基酸替代，例如，另一碱性氨基酸，另一酸性氨基酸，另一中性氨基酸，另一带电的氨基 酸，另一亲水性氨基酸，另一疏水性氨基酸，另一极性氨基酸，另一芳族氨基酸或另一脂肪 族氨基酸。20种主要氨基酸的可用于选择合适替代的一些性质如下：
【权利要求】
1. 包括外切体的组合物，其中所述外切体包括在所述外切体的表面上表达的靶向部 分，并且所述靶向部分是运铁蛋白（Tf)多肽或肽。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述Tf多肽包括与SEQ ID NO: 1具有至少80% 序列同一性的多肽序列或所述Tf肽来自所述多肽。
3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述Tf肽包括来自SEQ ID NO: 1的所述多 肽序列的至少10个连续氨基酸残基。
4. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述肽选自：CRTIGPSVC(SEQIDN0:3) 或PSDGPSV(SEQ ID N0:4)。
5. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括与存在于待靶向的 细胞上的部分结合的肽。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述存在于待靶向的细胞上的部分是运铁蛋白 受体（TfR)。
7. 根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述外切体包括外切体跨膜蛋白，其已经被 修饰以并入所述肽靶向部分。
8. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述外切体跨膜蛋白选自Lamp-1、Lamp-2、 CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin_3〇
9. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述外切体跨膜蛋白是Lamp-2b。
10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述靶向部分存在于Lamp-2b的N-末端处或 其附近并且用接头序列与Lamp-2b分开。
11. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述外切体衍生自树突细胞。
12. 根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述外切体用外源遗传物质、蛋白质 和/或肽或化疗剂装载。
13. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述外源遗传物质是编码治疗性蛋白或免疫 原的DNA质粒。
14. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述外源遗传物质是siRNA。
15. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述质粒编码用于基因治疗方法中的治疗性 蛋白。
16. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述质粒编码免疫原，其用于对所述免疫原 产生免疫应答的方法中。
17. 根据权利要求12至16的任一项所述的组合物，其中所述外切体衍生自不成熟的树 突细胞，其用于体内递送所述遗传物质、蛋白质和/或肽或化疗剂的方法中。
18. 产生外切体的方法，所述外切体包括在所述外切体的表面上表达的Tf多肽靶向部 分或Tf肽靶向部分，所述方法包括在用于产生外切体的细胞中表达包括所述靶向部分和 外切体跨膜蛋白的融合蛋白，其中随着所述细胞产生所述融合蛋白，表达的所述融合蛋白 并入所述外切体。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中编码所述融合蛋白的多核苷酸构建体转染进入 所述细胞，所述多核苷酸构建体进一步包括启动子和信号肽序列。
20. 根据权利要求18或19所述的方法，其中所述细胞是树突细胞。
21. 包括外切体跨膜蛋白和异源靶向Tf多肽或Tf肽的多肽，其中所述靶向Tf多肽或 Tf肽与待靶向的细胞表面上存在的Tf受体（TfR)结合，并且其中当所述多肽存在于外切体 中时，所述靶向Tf多肽或Tf肽存在于所述外切体的表面上。
22. 编码如权利要求22所限定的多肽的多核苷酸构建体，其中所述构建体包括编码5' 外切体跨膜信号序列的多核苷酸，其可操作地连接至编码本发明所述多肽的多核苷酸。
23. 根据权利要求22所述的多核苷酸构建体，其中所述外切体跨膜信号序列是内质网 革巴向信号肽。
24. 将外切体靶向所选择的组织或细胞类型的方法，所述方法包括用如权利要求22或 23所限定的多核苷酸构建体转染宿主细胞，在所述宿主细胞中表达所述构建体，和从其中 已经表达所述构建体的所述宿主细胞中获得外切体。
25. 在非人动物模型中基因沉默的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求 14所述的外切体，其中所述siRNA引向待沉默的所述基因。
【文档编号】C12N15/11GK104066453SQ201280060555
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2011年12月7日
【发明者】M·伍德斯, S·拉卡尔-利特雷顿, S·伊兰德鲁斯 申请人:Isis创新公司