从多相混合物回收包含生物分子的水相的制作方法

从多相混合物回收包含生物分子的水相的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种从多相混合物回收包含溶解于其中的生物分子的水相的方法，所述多相混合物包含至少所述水相和与所述水相不混溶的其它液相，其中所述其它液相包含至少一种烃类化合物。本发明还涉及亲水性过滤材料的应用、包含所述过滤材料的装置或包含所述装置的试剂盒，用于从所述水相和包含至少一种烃类化合物的其它液相的混合物回收包含溶解于其中的生物分子的水相，所述其它液相与所述水相不混溶。
【专利说明】从多相混合物回收包含生物分子的水相
[0001]本发明涉及一种从多相混合物回收其中包含溶解的生物分子的水相的方法，所述多相混合物包含至少所述水相和与所述水相不混溶的其它液相，其中所述其它液相包含至少一种烃类化合物。本发明还涉及亲水性过滤材料的应用、包含所述过滤材料的装置或包含所述装置的试剂盒，用于从所述水相和包含至少一种烃类化合物的其它液相的混合物回收包含溶解于其中的生物分子的水相，所述其它液相与所述水相不混溶。
[0002]就长期贮存和/或组织学检测而言，生物学样品通过用化学固定剂(例如福尔马林)诱导所述样品内的蛋白质交联来常规贮存，从而保存组织结构和细胞形态学。固定之后，所述样品通常被包埋进蜡(最常用石蜡)中，从而允许对所述样品进行切片和封固，以供显微镜检和/或组织学应用。
[0003]近年来，已开发出用于分离和分析来自此类蜡包埋样品的大分子的方法，所述大分子包括DNA、RNA且最近也包括蛋白质。然而，这些应用通常需要在任何其它处理步骤之前从所述样品去除包埋介质(所谓“脱蜡”/ “脱石蜡(cbparaffinisation) ”)。并且，脱蜡也有利于许多组织学染色方法。
[0004]传统的脱蜡包括采用芳族溶剂，例如甲苯，特别是二甲苯。通常将新鲜切片或经封固的显微切片样品浸入二甲苯浴直至石蜡溶解。在后续步骤中，用醇浓度递减的一系列醇溶液洗涤该脱石蜡样品以去除二甲苯，最后用水洗涤，从而使该样品与水性反应物/试剂溶液(例如，裂解缓冲液或染色溶液)相容。可是，二甲苯是可燃、挥发性且有毒的有机溶剂。因此，在过去几年中，为用毒性较低的脱石蜡剂替换二甲苯，人们做了大量的努力。组织学应用中，替换二甲苯的例子包括矿物油和萜油，如d-柠檬烯，以及脂族烃类或异石蜡经类(R.J.Buesa, M.V.Peshov, Annals of Diagnostic Pathology2009, 13, 246-256)。在相同 申请人:的共同在审的欧洲专利申请号10165799.7中，描述了一种从蜡包埋样品提取生物分子的方法，其中为了释放所述生物分子进入溶液以供其进一步检测、分析、分离和/或纯化步骤的样品细胞的裂解在两相或多相系统中进行，所述系统包含含有蜡溶解试剂和溶解的蜡的至少一种有机相和水性裂解缓冲液相。
[0005]另一种方法是简单地使所述包埋的生物学样品悬浮于水性溶液中，然后使其在高于该包埋介质熔点的温度孵育，以将细胞物质释放进入溶液以供进一步处理(参见，例如，W002/46463A2)。
[0006]上述两种方法均避免了使用毒性脱石蜡试剂和费力的洗涤步骤，然而，仍需要从包含溶解于其中的生物分子的水相中物理移出所述溶解的、熔化的或再凝固的包埋介质的步骤。从由水相和含烃相形成的二相或多相混合物回收包含溶解于其中的生物分子的所述水相的步骤通过将上层疏水层轻轻倒出，抽吸出各层之一使其彼此分离或对各层进行移液使其彼此分离来进行。然而，所有前述的用于从其它层回收一层的方法均无法自动化进行，或者即便实现了自动化也至少无法避免故障。
[0007]过滤常规用于从液体分离固体材料，而传统的过滤部件(例如玻璃料、筛子等)通常不适于分离不混溶液体的混合物。
[0008] 在去除水污染领域中，采用所谓错流过滤法(也称为切线流过滤法)来分离水和烃类(例如，油)的液体混合物(参见，例如，US5，158，681和DE43 OO 438C1)。在错流过滤法中，沿与滤器表面(通常是膜)成切线的方向以正压引导进料，由此所述物质的部分能够穿过所述膜的孔通过该膜。在传统的所谓死端式(dead-end)过滤法中，在滤器表面上引导进料，使滤液通过该滤器并从其另一端离开，而渗余物被阻挡在所述滤器中和/或所述滤器的表面上。尽管错流过滤法允许连续处理，但其较不适于对多个小样品体积进行快速低成本处理，尤其是考虑到自动化方面。
[0009]因此，本发明的问题是提供一种从包含水相和与所述水相不混溶的至少一种其它液相的多相混合物回收包含溶解于其中的感兴趣生物分子的水相的方法，其中所述其它液相包含至少一种烃类化合物，其中所述方法可在完全自动化方法过程中用于分离所述生物分子。
[0010]该目标通过本发明方法实现。已经吃惊地发现，包含溶解于其中的感兴趣生物分子的水相可以快速且可靠的方式从包含至少一种所述水相和与所述水相不混溶且包含至少一种烃类化合物的其它液相的多相混合物中回收，所述方法通过如下方式进行:将所述多相混合物的进料导向过滤部件表面上，包含溶解于其中的任何感兴趣生物分子的水相能透过所述过滤部件，但包含至少一种烃类化合物的其它液相不能透过所述部件。 [0011]因此，本发明提供一种从多相混合物回收水相的方法，所述水相包含溶解于其中的感兴趣生物分子，所述多相混合物包含至少所述水相和与所述水相不混溶且包含至少一种烃类化合物的其它液相，所述方法包括如下步骤:将所述多相混合物进料导向过滤部件表面上，其中包含溶解于其中的任何感兴趣生物分子的水相能够透过所述部件，但包含所述至少一种烃类化合物的其它液相不能透过所述部件。具体而言，本发明方法可用于从所述多相混合物分离所述生物分子的方法。
[0012]与本领域用于该目的的已知方法相比较，本发明方法允许从其它液相快速且可靠地分离包含溶解于其中的感兴趣生物分子的水相，所述其它液相例如包含溶解的包埋介质(如从FFPE样品溶解出的石蜡)，所述方法可完全自动化。本发明方法还可用于从生物学样品分离其它疏水性化合物(例如，脂肪或油)，所述方法采用一种或多种烷基溶剂以避免常用的耗时液-液提取步骤。
[0013]本发明的术语“从多相混合物回收水相”指一种相从另一种相物理(空间)分离，且不仅是例如使乳液瓦解(collapse)。术语“多相混合物”包括含有2、3、4等个相的混合物，前提是所述混合物包含含有溶解于其中的生物分子的至少一个水相，和与所述水相不混溶的其它液相，其中，所述其它液相包含至少一种烃类化合物。然而，所述多相混合物还可包含多于两种不同的相，例如，第三相是在所述水相和包含至少一种烃类化合物的其它液相中均不溶的固体，稳定的乳化相或任何一种或多种中间相。然而，在大多数情况中且优选地，本发明的多相混合物可是确切包含一种水相和包含所述至少一种烃类化合物的一种其它液相(独立于任何中间相)的液二相混合物。
[0014]本发明中，与水不混溶的其它液相是指与水在室温(23°C +/-2°C )下混合后不形成均一溶液的液相。本发明中，术语“至少一种烃类化合物”指包含碳和氢，优选由碳和氢组成的任何有机化合物，包括直链和支链脂族烃和环烃，包括芳族烃例如二甲苯或甲苯。优选地，本发明的至少一种烃类化合物选自下组:直链和环状烷烃，所述后者包括具有1、2、3或更多C = C双键的烃类，包括松节油，例如二戊烯、芳烃，优选经取代或未经取代的单环和/或双环同素环芳烃，例如二甲苯或甲苯，和/或各种经取代或未经取代的单环、双环和/或多环杂环芳烃，及其混合物。优选地，所述烃类化合物的大气压下(1，013.25毫巴)的熔点可高于室温(23 °C +/-2 °C ) ο
[0015]本发明中，所述其它液相中存在的烃类化合物可以是(I)烷基溶剂或烷基溶剂的混合物，例如，十四烷、十六烷或矿物油的混合物，(2)熔化的石蜡或溶解于有机溶剂中的石蜡，其与所述水相不混溶，但不是烷基溶剂。更优选地，所述液相可包含(3)烷基溶剂(I)和溶解于其中的石蜡(2)两者，因此包含烃类化合物的混合物。
[0016]优选地，所述至少一种烃类化合物(或所述其它液相中存在烃类化合物混合物的情况下的各烃类化合物)的链长是至少6个碳原子，更优选地是至少10个，甚至更优选地是至少14个，且最优选地是至少16个碳原子，分别对应于烷基溶剂形式的直链非支化的烷烃己烷、癸烷、十四烷和十六烷。所述其它液相与包含溶解的感兴趣生物分子的水相不混溶，并且优选包含不同烃类化合物的混合物，优选包含链长不同的烃类化合物的混合物，例如石蜡，其在室温下是主要由饱和烃类固体构成的混合物，其通常通过石油蒸馏来制备。所述其它液相可包含其它烃类化合物，例如直链烷基溶剂(室温下的直链烷烃液体)，例如，其可以是石蜡和有机溶剂(例如十六烷)的混合物，或内含石蜡的烃类溶剂(例如十六烷、矿物油、d-柠檬烯等)溶液。尽管所述其它液相可包含其它非烃类化合物成分，例如酯、醛等，所述烃类化合物在所述相中的量可优选高于50 %，更优选高于75 %，甚至更优选高于90%,且最优选高于95% (w/w) ο [0017]包含所述生物分子的水相从与所述水相不混溶的其它液相的物理分离通过将多相混合物进料导向过滤部件表面上来实现。在本发明中，过滤部件包含至少一种亲水性过滤材料，其优选可被支撑结构支持。此外或替代性地，所述过滤部件可包含预过滤结构。因此，本文术语“过滤部件”涵盖⑴亲水性过滤材料与(ii)预过滤和(iii)支撑结构的组合，前提是所述后者(ii和iii)之一存在或均存在。所述过滤部件中包含的亲水性过滤材料允许所述水相通过，但使所述其它液相滞留。因此，与本领域已知用于分离油水混合物的错流膜分离技术不同，该进料不以切线方向通过该膜，而是导向所述过滤材料(例如，膜)上，例如，冲击角是15~165°，优选是30~150°，更优选是45~135°，甚至更优选70~110°，且最优选基本垂直的方向(冲击角为90° +/-5° )。
[0018]该差异描述于图1和图2中:在错流过滤中(图1)，进料⑴沿切线方向通过滤器/膜表面(3)，之后该流的部分穿过该膜并且以约90°的角度从该流分离(滤液/透过物4)，而渗余物(2)随该流(I)沿该膜传送。
[0019]在本发明方法中(图2)，进料⑴导向滤器/膜表面上(3)，滤液(4)通过该滤器/膜(3)，而渗余物(2)滞留在所述滤器的相反侧。
[0020]在本发明方法中，设想所述水相和其它液相的分离(主要)依赖通过过滤的物理分离。基于此，本发明方法与基于吸附的方法相比还具有明显优势。例如，在基于吸附的方法中，总是需要考虑待去除的化合物的特定化学结构来选择吸附结构(例如，膜)，以允许所述吸附/结合结构和所述化合物之间的吸附/结合相互作用。此外，可从样品去除的化合物的量常受限于所述吸附/结合结构中的相互作用/结合位点的数量。相反，可将本发明方法应用于很多种不同化学化合物而无需特定地配合所述过滤部件。此外，可采用相当小的过滤部件从样品去除非常大量的化合物，因为本发明方法不受所述过滤部件中可能的相互作用/结合位点的数量的限制。因此，如果待从所述水相分离的分子数量与所述过滤部件中全部位点(其可通过静电、离子和/或范德华相互作用或共价结合与所述分子结合/相互作用)的数量的比>1，>10，>50或甚至>100，也可应用本发明方法。
[0021]在本发明中，过滤部件包含至少一种亲水性过滤材料，其优选可被支撑结构支持。此外或替代性地，所述过滤部件可包含预过滤结构。因此，本文术语“过滤部件”涵盖(i)亲水性过滤材料与(ii)预过滤和(iii)支撑结构的组合，前提是所述后者(ii和iii)之一或均存在。所述过滤部件中包含的亲水性过滤材料允许水相通过，但使所述其它液相滞留。
[0022]本发明中所用的亲水性过滤材料能透过包含溶解于其中的任何感兴趣生物分子的水相，但不能透过包含至少一种烃类化合物的其它液相。本发明中“能透过包含溶解于其中的任何感兴趣生物分子的水相”指，在所述水相通过所述过滤部件的步骤中，在所述样品的进一步处理过程中待检测、分析、分离和/或纯化的任何生物分子基本不被所述过滤部件的任何部分排斥、保留、吸附或与所述过滤部件的任何部分结合等。优选被保留的感兴趣生物分子少于0.1 μ g/mg膜。本发明中，若在以每分钟1，OOOxg,优选2，OOOxg,更优选3，500xg,甚至更优选5，OOOxg且最优选6，OOOxg离心时，100 μ L所述其它液相中有少于10 μ L，优选少于5 μ L，更优选少于I μ L且最优选少于0.1 μ L通过过滤材料，则所述过滤材料不能透过其它液相。
[0023]优选地，所述过滤部件包含至少一种亲水性过滤材料，优选具有以下形式:膜、滤器、带小孔径(例如，约0.2 μ m)的玻璃料、薄膜、绒料(fleece)、有孔的整体块状物，或含有亲水性过滤材料的粉末、粒子、珠、颗粒或球体的滤床。优选地,所述亲水性过滤材料不以中空纤维形式存在。
[0024]优选地，所述亲水性过滤材料可选自下组:乙酸纤维素(CA)、聚酰胺(PA)、聚醚砜(PES)和聚偏二氟乙烯(PVDF)或其混合物，例如以下混合物:CA和PA 'Ck和PES 'Ck和PVDF ;CA、PA 和 PES ;CA、PA 和 PVDF ;CA、PA、PES 和 PVDF ；PA 和 PES ；PA 和 PVDF，PA、PES 和PVDF或PES和PVDF。更优选地，所述亲水性过滤材料选自下组:乙酸纤维素和聚酰胺。优选地，所述过滤材料的最大孔径是0.45 μ m,更优选地是0.40 μ m,甚至更优选地是0.35、
0.30、0.29或0.25 μ m,且最优选是0.22 μ m。最小孔径优选至少是0.01 μ m，更优选是至少
0.05 μ m,甚至更优选是至少0.10或0.15 μ m且最优选至少0.20 μ m。
[0025]所述亲水性过滤材料的厚度优选可以是至少10 μ m,更优选是至少25 μ m,甚至更优选是至少50 μ m,特别优选地是至少75 μ m,且最优选是至少100 μ m。
[0026]所述亲水性过滤材料的供于水的流速优选是每平方厘米约5~50mL/min，更优选是约10~30mL/min (根据DIN58355以I巴压强差测定)。
[0027]所述亲水性过滤材料供于水的起泡点优选是至少2.0巴，更优选是至少2.5巴，且甚至更优选是至少2.9巴(根据DIN58355在室温下测定)。除了至少一层亲水性过滤材料以外，本发明的过滤部件可包含预过滤结构和/或支撑结构，所述预过滤结构能透过所述水相和其它液相以防止固体颗粒堵塞所述亲水性过滤材料的表面，所述支撑结构支持所述亲水性过滤材料并固定其位置。所述预过滤结构和所述支撑结构均可独立地以玻璃料、筛板等形式存在，且不限于此，并可由既不干扰所述烃类化合物又不干扰所述水相或溶解于其中的任何生物分子的任何惰性材料(例如，聚乙烯)制成。
[0028]本发明方法中，所述水相可优选利用重力、压强、真空、吸力或离心通过所述过滤部件。为了使分离过程加速，可优选地通过施加压强、真空/吸力或离心力(不限于此)迫使所述水相通过所述过滤部件。优选向所述过滤部件施加的力/功率取决于待分离的相和所用的过滤材料。允许以合理速度分离而不损坏所述过滤部件和/或使其能透过其它液相的所述力的合适范围可通过常规实验来容易地确定。
[0029]如上所述，所述多相混合物优选是包含水相和与所述水相不混溶的其它液相的二相混合物。所述其它液相优选可包含上述烃类化合物的混合物。
[0030]优选地，导向所述过滤部件的表面上的多相混合物不是内含所述水相的所述其它液相的乳液，反之亦然(分别是w/o或o/w乳液)。优选地，所述水相和所述其它液相以两个基本分开的液相形式存在，尽管彼此有物理接触。优选地，所述水相和其它液相的密度不同，从而所述两相的混合物优选以在液-液中间相处彼此物理接触的两个不同层的形式存在。优选地，所述其它液相的密度可低于所述水相的密度，更优选地，所述其它液相的密度低于lg/mL。优选地，多于50%，更优选地多于75%，甚至更优选地多于90%且最优选地多于95% (w/w)的所述多相混合物在接触所述过滤部件表面时不以乳液形式存在。若所述多相混合物以乳液形式存在，则可使该乳液在接触所述过滤部件之前在离心机中离心，从而将所述乳液分成在液-液中间相处彼此物理接触的两个不同的层。
[0031]所述多相混合物可通过使蜡包埋的生物学样品接触至少一种水性裂解缓冲液并任选地使所述样品在所述水性裂解缓冲液的存在下升温来获得。
[0032]优选地，所述多相混合物可通过如下方法获得:
[0033]I)使蜡包埋生物学样品接触含有与水不混溶的至少一种有机溶剂的蜡溶解试剂；
[0034]2)任选地孵育步骤I中获得的样品；
[0035]3)向仍含有所述蜡溶解试剂的样品添加水性裂解缓冲液；
[0036]4)孵育步骤3中获得的混合物以获得多相混合物，所述多相混合物包含作为至少一个其它液相的至少一个有机相和水相，所述有机相基本包含溶解的蜡和蜡溶解试剂，所述水相包含溶解的感兴趣生物分子，
[0037]其中若省略步骤2，步骤I和3可作为一个合并步骤进行。
[0038]本发明中，术语“蜡包埋样品”包含如制备用于组织化学或其它化学和/或生物分析的用蜡包埋的任何生物样品。所述蜡通常由高级烃的复杂混合物组成，并可包含其它组分如高级脂肪酸和/或糖醇的酯类等。然而，也可采用适合用作生物学样品的包埋介质的可溶于烃类的任何其它蜡，例如聚酯蜡。所述蜡可来源于天然和/或合成，并且可额外包含增强或改善所述蜡的样品包埋性质或特定特性的添加剂，例如少量的有机聚合物、DMSO或高级聚烯烃类。优选地，所述蜡可以是石蜡，石蜡是主要由饱和烃类组成的混合物，室温下为固体，其通常通过石油蒸馏制备。无论采用何种类型的石蜡，无论采用所谓高熔点或低熔点石蜡或其混合物，所述样品都可以采用本发明的方法、装置和/或试剂盒来处理。
[0039]优选地，所述样品可以是福尔马林固定石蜡包埋的样品，其中生物学样品在用石蜡包埋之前已用甲醛固定。所述生物学样品可以是来源于人、动物或植物，或微生物(如细菌、酵母病毒或真菌)的完整生物体，生物体的部分，特别是组织碎片或组织切片。也可采用分离自细胞培养物的经包埋的细胞。
[0040] 作为裂解缓冲液，可采用能够裂解/破坏含细胞物质内的细胞的任何水性溶液，由此将其中包含的生物分子释放进入溶液但不破坏所述感兴趣的生物分子。哪种裂解缓冲液适合于从细胞释放所述感兴趣的生物分子取决于所述细胞的类型并且为技术人员已知。本领域已知可用于本发明方法的多种水性裂解缓冲液。若被包埋的样品是已固定的样品，例如福尔马林固定的样品，则所述裂解缓冲液可包含本领域已知的用于减少样品中的交联数的额外成分。然而，所述裂解缓冲液中并非必须有此类额外成分存在，因而日所述交联可在上述实施方式的步骤4的孵育过程中被有效移除，甚至在不存在用于减少交联数的化合物的情况下也能被有效移除，例如，若在约90°C的温度下施行孵育。
[0041]本发明方法的这个实施方式的一大优势在于，所述样品的脱蜡无需采用有毒化学物。此外，从样品分离溶解蜡无需繁复的洗涤步骤或专用的树脂。此外，步骤3中所用的裂解缓冲液以及用于在收集回收的水相之后从所述水相分离和/或纯化所述核酸的任选步骤中的任何其它试剂和手段可几乎不受限地在宽范围的方法和/或手段中进行选择。这意味着所述方法可特定地适应样品的特殊要求。
[0042]所述蜡溶解试剂优选可以是无毒的并且可包含与水不混溶的至少一种有机溶剂/化合物。所述蜡溶解试剂可以是液体，至少其在与含蜡样品接触时是液体。优选地，所述溶剂可以是烃类化合物，优选地选自下组:直链、支链和环状C6-C16烷烃或其混合物，更优选地选自下组=Cltl-C16烷烃或其混合物，甚至更优选地选自下组=C13-C16烷烃或其混合物，并且最优选地可以是十四烷、十五烷或十六烷。也可采用芳族试剂，例如二甲苯、甲苯或其混合物。无论是纯溶剂形式还是溶剂混合物形式，施加至所述蜡包埋样品用于脱蜡的任何溶剂的熔点优选在大气压下低于室温(23±2°C)。此外，所述溶剂或溶剂混合物应既不溶于水(即，其在水中的溶解度应少于0.01% (w/w))又不与水混溶(即，其在与水混合后应不形成均一溶液)。本文中的术语“纯的形式”指施加至蜡包埋样品以使蜡溶解的试剂，该试剂先前未经稀释 和/或与其它溶剂混合。然而，这并不表示关于其它非溶剂化合物的存在的特定纯度级别。若某一溶剂以纯的形式施加至所述样品，优选该溶剂的熔点低于室温。然而，若熔点高于室温的“溶剂”在溶剂混合物中存在时，在大气压下的室温条件下(23±2°C )是液体，则此类溶剂也可施用于所述蜡包埋样品。
[0043]优选地，所述溶剂或溶剂混合物的大气压下的沸点高于150°C，更优选地高于200°C，且最优选闻于250°C。选择的腊溶解试剂的沸点闻于150°C使得所述样品的石腊一旦溶解即保持在液态且不因蜡溶解试剂的不希望的蒸发而再凝固。此外，发现上述有机溶剂或其混合物与步骤3中添加所述裂解缓冲液之后获得水相形成稳定乳液的趋势较低。令人吃惊的是，甚至在去污剂(如SDS)的存在下也是如此。此外，上述溶剂能够使固体石蜡在室温下于数秒内或至多数分钟内(优选约15秒~约15分钟)溶解。
[0044]可向所述蜡溶解试剂添加或所述蜡溶解试剂中可包含染料/着色剂，所述染料/着色剂可溶于所述蜡溶解试剂但不溶于水，例如不溶于水的蒽醌溶剂染料，如作为“油绿(oil green) ”市售可得的1，4_ 二 [ (4-甲基苯基)氨基]-9，10-蒽二酮。
[0045]例如，内含少至约I μ g量的〃油绿〃的约30mL所述蜡溶解试剂(例如，十六烷)(等同于约0.003% (w/v))即足以使所述有机相具有强色，而所述水相的颜色保持不变，这非常便于对完全相分离和水相回收的视觉控制。
[0046]步骤2的蜡包埋样品中蜡溶解试剂的混合物的孵育步骤可在15~85°C的温度范围进行，优选20~55°C，更优选室温~35°C，且最优选室温。若进行该孵育步骤，则该步骤优选持续I秒~3小时，更优选10秒~I小时，甚至更优选20秒~30分钟，且最优选30秒~5分钟。并且，可同时或“几乎同时”对所述样品施用所述蜡溶解试剂和所述水性裂解缓冲液，即，一种紧接着另一种施用，即，所述脱蜡剂紧接着所述裂解缓冲液施用，反之亦然。在这种情况下，任选省略步骤2，并步骤I和3同时或“几乎同时”地进行。
[0047]在本发明方法的采用上述烷烃作为蜡溶解试剂的优选实施方式中，尤其有利的是，可在低温下非常快速地且以(几乎)定量的方式从所述样品回收包埋介质，即使向所述样品同时或“几乎同时”地添加水性裂解缓冲液和蜡溶解试剂。因此，细胞裂解前无需繁复且耗时的脱蜡以及相分离步骤。
[0048]因此，不同于现有技术已知的若干方法，在脱蜡时无需升温和/或长时间孵育，而升温和/或长时间孵育可能对生物分子(例如，核酸)的品质和得率有负面影响，在样品中存在尚未被蛋白酶灭活的核酸消化酶如RNA酶和DNA酶时尤其如此。在裂解前或同时脱除石蜡也缩短了所需裂解时间，因为与包埋样品相比，水性裂解缓冲液能更快及有效地渗透脱石蜡样品，即，可采用更短裂解时间和/或更低裂解温度。然后，含生物分子的水相的回收通过本发明方法以快速且可靠的方式进行，从而包括裂解和分离的整个方法快速且可实现自动化。
[0049]如上所述，甚至不必在添加水性裂解缓冲液之前使所述样品与蜡溶解试剂接触孵育。并且所述蜡溶解试剂和所述水性裂解缓冲液可同时加入样品。在这种情况下，优选混合所述样品以确保证完全的相接触，例如但不限于通过涡旋，实验室振荡器振荡，移液器上下吹打等。也可添加其它化合物，如蛋白酶。
[0050]另一个优势在于，本发明方法可与现有技术已知的多种裂解缓冲液和裂解方案联合通用，例如包含在QIAamp FFPE试剂盒中的ATL缓冲液，包含在QIAsymphony DNA试剂盒中的Pl缓冲液(皆可获自德国希尔顿的恰根公司(QIAGEN))，或PBS缓冲液。例如，所述裂解缓冲液可包含缓冲剂和至少一种去污剂，所述缓冲剂优选选自下组:Tris、Mops、Mes、H印es、硼酸盐、磷酸盐和碳酸盐，所述去污剂优选选自下组:非离子型、阴离子型、阳离子型及两性离子型去污剂或其混合物。更优选的去污剂选自阴离子或两性离子去污剂。甚至更优选的裂解缓冲液可包含阴离子去污剂，最优选十二烷基硫酸钠。此外，可以使用非离子表面活性剂，如取代苯酚或聚乙氧基化糖，市售可得如曲通(Triton)X-114 (陶氏化学品公司(Dow Chemical C0.)，美国密歇根州米德兰)，曲通X_100 (陶氏化学品公司，美国密歇根米德兰)或吐温20(默克公司(Merck)，德国达姆施塔特)，以及阳离子表面活性剂如季铵表面活性剂，例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)或正辛基三甲基溴化铵(OTAB)。
[0051]所述裂解缓冲液可包含一种或多种其它物质，所述其它物质优选选自下组:螯合剂、还原剂、无机盐如硫酸铵、PH指示剂和稳定剂如叠氮钠。所述裂解缓冲液的pH优选在4~11范围内，优选7~10，且最优选8~9。
[0052]除裂解缓冲液外，也可在步骤3中向所述混合物添加蛋白水解剂。所述蛋白水解剂也可已包含于向所述样品添加的裂解缓冲液中。所述蛋白水解剂可优选选自下组:蛋白酶和非酶促蛋白水解化合物，且更优选地可以是蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C、溴化氰、重组芽孢杆菌蛋白酶例如QIAGEN蛋白酶溶菌酶(Lysozyme)或其混合物。[0053]如步骤4所述的孵育向所述样品添加水性裂解缓冲液之后获得的混合物的步骤可优选地在15~95°C的温度范围进行，优选20~70°C，且最优选37~65°C，包括56°C。该孵育可优选地进行30秒~24小时,更优选45秒~12小时,甚至更优选50秒~5小时，且最优选I分钟~2小时。然而，孵育的温度与时间可随样品的种类、量和新鲜程度以及所用裂解缓冲液而变化。这是本领域技术人员熟知的，且本领域技术人员可通过常规实验容易地确定最适裂解条件，特别就孵育时间和温度而言。在一些情况下，还可优选进行〃两步孵育〃法，首先在37~65°C的温度范围孵育所述混合物约I分钟~约3小时，然后任选地如本发明所述从有机相回收水相，并在升高的温度下(例如，至高约90°C)孵育该水相例如约10分钟~约5小时。同样地，任选可在升高的温度(如90°C )下孵育之后从所述有机相回收所述水相。在该情况下，减少了所述水相的不希望的蒸发的程度。本发明方法可包括其它步骤:收集通过所述过滤部件后的水相。用于收集通过所述过滤部件后的样品溶解的手段和装置是本领域已知的。此外，所述方法还可包括从所述水相检测、分析、分离和/或纯化感兴趣生物分子 的任何步骤，其中所述方法、装置和试剂取决于待检测、分析、分离和/或纯化的生物分子，这是本领域技术人员熟知的。
[0054]本发明中，“生物分子”包括任何核酸，如DNA或RNA，具体是线性的、分支的或环状的，单链或双链的核酸分子，更具体地是(但不限于)mRNA、siRNA、mi RNA, snRAN、tRNA、hnRNA或核糖酶、基因组、质粒或细胞器DNA ;任何核苷酸、寡核苷酸或多聚核苷酸，包括合成的、经修饰的或经标记的寡核苷酸或多聚核苷酸；PCR引物、用于杂交的短DNA或RNA片段；PNA(肽核酸)；任何蛋白质、肽或氨基酸，包括未经标记或经标记的抗体、受体、激素、生长因子和经修饰的蛋白质、核酸、传染性来源的蛋白质和肽；代谢物、任何脂质；糖(单体、寡聚物或聚合物)；蛋白聚糖；任何低分子量的通路产物、信号分子、受体或酶活化剂或抑制剂；药物和药物代谢物。
[0055]优选地，所述生物分子是核酸。优选地，所述核酸可选自下组:核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，包括天然产生的，重组和/或化学或生物技术工程改造的真核、原核或病毒来源的核酸，包括但不限于:gDNA、cDNA、rRNA、mi RNA, siRNA、piRNA、snRNA、LNA(锁定核酸)、PNA(肽核酸)、或其片段。使用合适的裂解缓冲液(如市售购自恰根公司(QIAGEN)(德国希尔顿)的PKD缓冲液)时，甚至DNA和RNA均可用本发明方法从同一样品分离。所述核酸优选是DNA，更优选长度至少有IOObp的DNA。
[0056]优选地，分离和/或纯化溶解于所述水相的生物分子的步骤可通过至少一种色谱和/或基于固相的方法进行，包括常规和反向色谱、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、三螺旋亲和色谱、离液剂介导的或不含离液剂的亲和结合(吸附)，包括由结合试剂介导的对二氧化硅或聚苯乙烯基质/表面的吸附。优选地，所述至少一种色谱和/或基于固相的方法可选自下组:凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反向色谱和亲和结合。此外或替代性地，所述生物分子还可通过选择性沉淀所述感兴趣生物分子或样品中存在的杂质/不需要的其它化合物来纯化。若感兴趣的生物分子是核酸，可例如通过添加阳离子表面活性剂(例如CTAB(溴化十六烷基三甲基铵))来使蛋白质沉淀。
[0057]有若干试剂盒市售可得以供生物分子的检测、分析、分离和/或纯化，其中的许多可用于检测、分析、分离和/或纯化从本发明所述的多相混合物回收的水相中存在的生物分子。若核酸待分离和/或纯化，这些试剂盒包括但不限于，例如，QIAamp、AllPr印DNA/RNA和QIAsymphony组织试剂盒(其全部来自德国希尔顿的恰根公司(QIAGEN))。
[0058]本发明还涉及亲水性过滤材料、包含所述过滤材料的装置或包含所述装置的试剂盒用于从与水相不相容的其它液相回收所述水相的应用，所述水相包含溶解于其中的生物分子(优选核酸或蛋白质)，其中所述其它液相包含至少一种烃类化合物，优选是如上所述溶解于至少一种有机溶剂的蜡。所述有机溶剂优选选自下组:直链、支链和环状C6-C16烷烃、烯烃或其混合物，所述其它液相更优选地是溶解于十四烷、十五烷、十六烷或其混合物的石蜡。用于进行本发明方法的装置包含具有进口和出口的中空主体，所述中空主体包含亲水性过滤材料，所述亲水性过滤材料优选由支撑结构支持，所述支撑结构优选是玻璃料或筛板形式。
[0059]所述亲水性过滤材料可优选地具有以下形式:膜、滤器、带小孔径(例如，约
0.2 μ m)的玻璃料、薄膜、绒料(fleece)、有孔的整体块状物，或含有亲水性过滤材料的粉末、粒子、珠、颗粒或球体的滤床。优选地，所述亲水性过滤材料不以中空纤维形式存在。
[0060]优选地，所述亲水性过滤材料可选自下组:乙酸纤维素(CA)、聚酰胺(PA)、聚醚砜(PES)和聚偏二氟乙烯(PVDF)或其混合物，例如以下混合物:CA和PA 'Ck和PES 'Ck和PVDF ;CA、PA 和 PES ;CA、PA 和 PVDF ;CA、PA、PES 和 PVDF ；PA 和 PES ；PA 和 PVDF，PA、PES 和PVDF或PES和PVDF。更优选地，所述亲水性过滤材料选自下组:乙酸纤维素和聚酰胺，及其混合物。优选地，所述过滤材料的最大孔径是0.45 μ m,更优选地是0.40 μ m,甚至更优选地是0.35、0.30、0.29或0.25 μ m,且最优选是0.22 μ m。最小孔径优选至少是0.01 μ m，更优选是至少0.05 μ m,甚至更优选是至少0.10或0.15 μ m且最优选至少0.20 μ m。
[0061]所述亲水性过 滤材料的厚度优选可以是至少10 μ m,更优选是至少25 μ m,甚至更优选是至少50 μ m,特别优选地是至少75 μ m,且最优选是至少100 μ m。
[0062]所述亲水性过滤材料的供于水的流速优选是每平方厘米约5~50mL/min，更优选是约10~30mL/min (根据DIN58355以I巴压强差测定)。
[0063]所述亲水性过滤材料供于水的起泡点优选是至少2.0巴，更优选是至少2.5巴，且甚至更优选是至少2.9巴(根据DIN58355在室温下测定)。
[0064]所述中空主体可由适合样品收集、贮存或处理的任何材料制成，如塑料、金属、玻璃、瓷器等。优选地，所述主体可由塑料制成，更优选地，所述主体可由热塑树脂制成，例如但不限于:聚丙烯、聚乙烯、聚丙烯共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚交酯、乙烯-聚醋酸乙烯酯、氯乙烯酯、醋酸乙烯酯共聚物、聚乙酸酯、聚醚醇、醋酸乙烯酯共聚物等。优选所述装置的进口开于所述装置的“上端”，而出口开于所述装置的“底侧”。特别优选所述进口和所述出口彼此相对。任选地，所述装置可包含至少一个可移动的关闭装置以关闭所述装置的进口和/或出口。在所述中空主体内部或其底端，即，在出口侧，所述中空主体配备有至少一层所述亲水性过滤材料，所述亲水性过滤材料以如下方式布置在流动区域中:进料中的基本全部水相在通过所述出口离开该中空主体之前必经所述亲水性过滤材料层。合适的亲水性过滤材料及其性质已在上文有描述。
[0065]优选地，所述装置还包含支持亲水性过滤材料层的支撑结构，以改善该层的机械稳定性并将该材料保留在所述中空主体内部。所述支撑结构可以具有，例如，玻璃料、筛板等形式。所述装置还可包含预过滤结构，所述预过滤结构被置于所述亲水性过滤材料上方以保留进料中存在的固体颗粒，否则所述固体颗粒会阻挡所述亲水性膜。所述预过滤结构可以具有，例如，玻璃料、筛板、滤器等形式。优选地，所述预过滤结构以及所述支撑结构均不通过共价或非共价结合、吸附、化学反应、静电或离子相互反应等与形成进料的所述多相混合物中存在的化合物尤其是感兴趣的生物分子或溶剂相互反应。本发明中，亲水性过滤部件如上所述包含至少一种亲水性过滤材料和至少一种预过滤或支撑结构。
[0066]优选地，所述装置可以是漏斗、柱体、注射器或多孔板，更优选地是配备有如上所述的亲水性过滤材料或亲水性过滤部件的离心柱。优选地，本发明装置是配备有所述亲水性过滤材料/亲水性过滤部件的离心柱。
[0067]用于进行本发明方法的试剂盒包含亲水性过滤材料(优选地,所述亲水性过滤材料如上所述包含在所述装置中)，和选自下组的至少一种其它组成部分:所述试剂盒的使用说明书、裂解缓冲液、蜡溶解试剂、蛋白水解剂和用于通过色谱和/或亲和结合来纯化所述感兴趣生物分子的固相。优选地，所述裂解缓冲液、蜡溶解试剂和蛋白水解剂可以是上述那些。
【专利附图】

【附图说明】
[0068]图1说明错流过滤法的原理。
[0069]图2说明死端式过滤法的原理，后者用于本发明方法。 [0070]图3显示本发明装置的一个实施方式，其为离心柱，该离心柱包含中空主体(5)、进口(6)和出口(7)，所述中空主体(5)配备有亲水性过滤材料(3)，所述亲水性过滤材料
(3)由多孔玻璃料形式的支撑结构(8)支持。
[0071]图4显示对包含gDNA的四个样品的OD扫描，所述样品已根据本发明方法从FFPE组织切片分离并纯化(参见实施例2)。
[0072]图5显示对上述FFPE样品的凝胶电泳分析结果(实施例2)。
[0073]图6显示对采用本发明方法从FFPE样品获得的人扁桃体DNA中的KRAS的密码子12和13中的突变的分析结果(实施例2)。
[0074]图7显示采用本发明方法的由水性裂解缓冲液和d-柠檬烯与十六烷的混合物形成的乳液的分离(实施例3)。
[0075]图8显示采用本发明方法的由水性裂解缓冲液和二甲苯形成的乳液的分离(实施例4)。
实施例
[0076]实施例1:本发明的装置的制备
[0077]向配备有玻璃料的标准离心柱(德国希尔顿的恰根公司(QIAGEN))放置带0.2μπι孔径的乙酸纤维素滤器(0Ε66，德国达塞尔的施莱些许尔微型科学有限公司(Schleicher&Schiill Microscience GmbH))，该滤器用手术刀切割成合适形状。为在操作过程中固定该滤器，用塑料环将其固定。
[0078]实施例2:从FFPE样品分离gDNA
[0079]将来自大鼠肝脏FFPE块的切片(样品1:一片切片，样品2:两片切片，样品3:三片切片)和来自女性人类扁桃体FFPE块的切片(样品4:一片切片)置于反应管中。各切片厚度为ΙΟμπ?。向所述样品添加包含十六烷和油可溶性染料的200μ L如共同再审申请10165799.7中所述的蜡溶解试剂，以及作为裂解缓冲液的180 μ L缓冲液ATL (德国希尔顿的恰根公司(QIAGEN))和20 μ L蛋白酶K(德国希尔顿的恰根公司(QIAGEN))。所述样品通过润旋并在振汤鮮育箱中以1，OOOrpm在56 C下振汤I小时来混合。所述样品在室温下以20，400xg离心I分钟。然后，使所述样品在约90°C孵育I小时，以去除甲醛诱导的交联。上部烃层避免了该步骤中的水相蒸发。使所述样品冷却至室温并转移至实施例1的离心柱。然后，以2，OOOxg离心所所述样品，之后，水相通过所述亲水性过滤部件，而包含溶解石蜡和蜡溶解试剂的烃相留在柱中。收集水相，并按照QIAamp FFPE Minelute手册，采用该试剂盒中提供的柱来纯化所述水相。样品用100 μ L ATE缓冲液(德国希尔顿的恰根公司(QIAGEN))从所述Minelute柱洗脱，并在光学密度(OD)测量之前另用100 μ L ATE缓冲液稀释，以测定所述样品中存在的gDNA的量。图4所示结果显示,在ATE缓冲液中稀释的gDNA样品的常规光谱。所述样品中存在的gDNA的量是:
[0080]样品16.2 μ g gDNA (一片10 μ m FFPE大鼠肝脏组织切片)
[0081 ] 样品215.8 μ g gDNA (两片10 μ m FFPE大鼠肝脏组织切片)
[0082]样品320.4 μ g gDNA (三片IOym FFPE大鼠肝脏组织切片)
[0083]样品422.8 μ g gDNA ( 一片IOym FFPE人扁桃体组织切片)
[0084]在含有2.5 μ L Gel Red (凝胶红)的0.8 %琼脂糖凝胶(50mL)上分析IOyL的各样品，该凝胶在100V下于Ix TAE缓冲液内跑胶40分钟。采用ATE缓冲液作为空白对照。结果示于图5，显示分离自FFPE样品的gDNA的典型凝胶。
[0085]作为对采用本发 明方法分离自FFPE样品的核酸进行可能的下游分析的示例，采用市售可得的therascreen? KRAS Pyro?试剂盒(德国希尔顿的恰根公司(QIAGEN))通过焦磷酸测序对获自样品4的gDNA筛选KRAS基因的密码子12和13中的突变，所述测序按照生产商的方案如下进行:各包含来自样品4的IOnggDNA的四个样品用靶向密码子12/13的引物在PCR中扩增。使所述扩增子固定在链霉亲和素Sepharose?高效珠上。制备单链DNA并进行焦磷酸测序。
[0086]结果示于图6。全部四个示例显示无突变的野生型KRAS密码子12/13的典型直方图(还显示野生型的理论直方图以供比较)。这进一步证明采用本发明方法可从FFPE样品获得高质量的DNA，其无需进一步纯化即可用于下游分析。
[0087]实施例3:从水相和含d-柠檬烯的相的混合物回收所述水相
[0088]向300 μ L水性裂解缓冲液(50mM Tris硫酸盐；50mM十二烷基磺酸钠，pH8.5)添加200 μ L CitriSolv (德国施韦特的费舍尔科技公司(Fisher Scientific))和200 μ L十六烷(含有油绿作为着色剂)。涡旋该双相混合物(图7a)以形成乳液(图7b)。将所述乳液转移至实施例1的离心柱(图7c)。使该柱以1，500xg离心2分钟，之后所述水相通过所述亲水性过滤部件，而包含d-柠檬烯和十六烷的烃相保留在柱中(图7d)。该实施例显示，甚至水相和其它液相的乳液也可通过本发明方法分离。
[0089]采用亲水性聚酰胺滤器(Sartolon Polyamid,孔径0.2 μ m,来自德国哥廷根的赛多利斯公司(Sartorius))获得相似结果。
[0090]实施例4:从所述水相和二甲苯的混合物回收水相
[0091]为了更好地观察，使用前通过添加少量油绿对二甲苯染色。使200yL 二甲苯与水性裂解缓冲液(50mMTris硫酸盐；50mM十二烷基磺酸钠，pH8.5)混合。将该混合物涡旋直至形成乳液(图8a)。将所述乳液转移至离心柱上，所述离心柱配备有玻璃料，并且所述膜之一已用于实施例3，其由乙酸纤维素或聚酰胺制成。然后，将所述柱置于收集管内，并在台式离心机内以3，OOOxg离心I分钟。如图Sb所示，两种情况下，所述乳液均被破坏并且所述水相与所述有机相清晰 分开。采用乙酸纤维素膜获得的结果示于图8b的左侧，而采用聚酰胺膜获得的结果示于右侧。
【权利要求】
1.用于从多相混合物回收水相的方法，所述水相包含溶解于其中的生物分子，所述多相混合物包含至少所述水相和与所述水相不混溶且包含至少一种烃类化合物的其它液相，所述方法包括如下步骤:将所述多相混合物进料导向过滤部件表面上，其中包含溶解于其中的任何感兴趣生物分子的所述水相能透过所述过滤部件，但包含所述至少一种烃类化合物的所述其它液相不能透过所述过滤部件。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤部件包含至少一种亲水性过滤材料，所述过滤部件优选为以下形式:膜、滤器、玻璃料、薄膜、绒料、有孔的整体块状物，或含有亲水性过滤材料的粉末、粒子、珠、颗粒或球体的滤床。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述亲水性过滤材料选自下组:乙酸纤维素、聚酰胺、聚醚砜和聚偏二氟乙烯，及其混合物。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法，其特征在于，利用重力、压强、真空、吸力或离心使所述水相通过所述过滤部件。
5.如权利要求1~4中任一项所述的方法，其特征在于，所述多相混合物是包含所述水相和与所述水相不混溶的其它液相的二相混合物。
6.如权利要求1~5中任一项所述的方法，其特征在于，所述多相混合物通过使蜡包埋的生物学样品接触水性裂解缓冲液并任选地在所述水性裂解缓冲液存在下加热所述样品来获得。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多相混合物通过以下方式获得: 1)使蜡包埋的生物学样品接触含有与水不混溶的至少一种有机溶剂的蜡溶解试剂； 2)任选地孵育步骤I中所得的混合物； 3)向仍然含有所述蜡溶解试剂的混合物添加水性裂解缓冲液； 4)孵育步骤3中获得的混合物以获得所述多相混合物，所述多相混合物包含至少一种有机相和水相，所述有机相基本包含溶解的蜡和所述蜡溶解试剂，所述水相包含溶解的生物分子， 其中步骤I和3也能作为一个合并步骤进行。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品是石蜡包埋样品，优选是福尔马林固定的石蜡包埋样品(FFPE样品)，并且所述蜡溶解试剂包含至少一种有机溶剂，优选选自下组:直链、支链和环状C6-C16烷烃、烯烃或其混合物，更优选地选自下组:直链、支链和环状C6-C16烷烃或其混合物，甚至更优选地选自下组=C13-C16烷烃或其混合物，最优选地是十四烷、十五烷或十六烷。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，除所述裂解缓冲液之外还向步骤3中的混合物添加蛋白水解剂，或者在步骤3中向样品添加的裂解缓冲液中已包含蛋白水解剂，所述蛋白水解剂选自下组:蛋白酶和非酶促蛋白水解化合物，优选是蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C、溴化氰、重组芽孢杆菌蛋白酶、溶菌酶或其混合物。
10.如权利要求1~9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含收集通过所述过滤部件后的水相的附加步骤，和检测、分析、分离和/或纯化来自所述水相的感兴趣生物分子的任选附加步骤，所述生物分子优选是核酸。
11.如权利要求1~10所述的方法，其特征在于，所述分离和/或纯化溶解于所述水相的生物分子的步骤通过至少一种色谱法和/或基于固相的方法进行，优选通过选自下组的方法进行:凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反向色谱法和亲和结合法。
12.亲水性过滤材料、包含所述亲水性过滤材料的装置或包含所述装置的试剂盒用于从与水相不混溶的其它液相回收所述水相的应用，所述水相包含溶解于其中的生物分子，优选是核酸，所述其它液相包含至少一种烃类化合物，优选是溶解于至少一种有机溶剂的蜡，所述有机溶剂选自下组:直链、支链和环状C6-C16烷烃、烯烃或其混合物，或优选地是溶解于十四烷、十五烷、十六烷或其混合物的石蜡。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述装置包含具有进口(6)和出口(7)的中空主体(5)，所述中空主体(5)包含亲水性过滤材料(3)，所述亲水性过滤材料(3)优选由支撑结构(8)支持，所述支撑结构(8)优选是玻璃料或筛板形式。
14.如权利要求12或13所述的应用，其特征在于，所述装置是漏斗、柱体、注射器或多孔块状物，优选是离心柱。
15.如权利要求12~14中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含亲水性过滤材料和选自下组的至少一种其它组成部分:所述试剂盒的使用说明书、裂解缓冲液、蜡溶解试剂、蛋白水解剂和通过色谱和/或亲和结合来纯化所述感兴趣生物分子的固相，所述亲水性过滤材料优选包含 在如权利要求13或14所述的装置中。
【文档编号】C12Q1/68GK103998608SQ201280060197
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2011年12月6日
【发明者】约尔格·胡克伦布罗奇, F·纳兹 申请人:恰根有限公司