专利名称：利用高通量组织芯片检测golph3在脑胶质瘤中的表达的方法
技术领域：
本发明属于检测 G0LPH3在脑胶质瘤中的表达领域，特别涉及一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法。
背景技术：
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是人类星形胶质细胞瘤中恶性程度最高、最顽固的肿瘤，大多数病人的生存期低于2年。其快速浸润性生长使得大多数肿瘤在诊断时已无法完全切除。治疗方案包括外科手术、放射治疗和辅助性化疗。手术切除是治疗过程中非常重要的一个部分，可以达到明确诊断、缩小肿瘤体积、减少细胞数目并提高患者生存期的目的。然而，尽管经过目前最有效的治疗，GBM患者在明确诊断后的预后生存期仍只有14个月。为了达到早期诊断和更好的疗效，已经付出了许多努力来寻找新的分子标记物和靶向疗法。在GBM基因和分子异常方面的最新发现使得治疗方向分子靶向药物和更多合理的靶向分子治疗转移。几个新的基因，如EGFR、RDA51、S0X2和VEGF，被发现参与了 GBM的肿瘤形成和进展过程。新的抗上述靶点的治疗药物(如贝伐单抗)已在临床试验中深度研究。最近FDA已批准了贝伐单抗用于复发胶质瘤的治疗。高尔基磷酸化蛋白3 (G0LPH3),也称为GPP34/GMx33/MIDAS，是一种具有34kDa分子重量的高度保守的蛋白质。它被发现横穿在从酵母菌到人类的全部真核生物系中。这个蛋白质位于反面高尔基网，由人类染色体5pl3的一个基因编码。G0LPH3参与了蛋白质的运输、受体的循环和从高尔基体到质粒膜的糖基化过程。最新的研究发现G0LPH3可以促进细胞性状转化和肿瘤生长。尤其是，G0LPH3在多种实体肿瘤中都高表达，包括黑色素瘤、结肠腺癌和非小细胞肺癌。G0LPH3提高了人类癌细胞中雷帕霉素(mTOR)信号对哺乳动物的靶向性，并调节了分子对mTOR抑制剂的反应。mTOR，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是雷帕霉素的靶向，作为蛋白质合成和细胞生长的初级调控者，是受体酪氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶通路(RTK-P13K)的关键整合分子，而RTK-PI3K通路则是GBM超激活通路中最常见的一条。在一项对76例胶质瘤患者的研究中，Li等人发现在高级别胶质瘤中G0LPH3表达更高。理解G0LPH3是如何失调的以及异常表达的G0LPH3对GBM的肿瘤发生和药物反应有何作用可有助于发现新的预后标记物和新的介入治疗途径。组织芯片(TMA)技术的发展，得益于生物芯片技术等的延伸。TMA具有高通量、快速、低误差、用途广泛等特点，目前主要应用在肿瘤病理学、实验室检测、药物研究等。利用组织芯片技术可以在细胞水平定位和蛋白水平检测相应靶标，从而实现基因及其表达产物与组织形态学研究以及临床数据相结合，同时还可以与原位杂交技术等相结合，因此TMA被广泛应用在肿瘤病理研究中，例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的关系，AlphaB-Crystallin与乳癌的关系，TMPRSS2和ETS转移因子在前列腺癌的重要作用等。TMA常见类型有演化TM、预后TMA等。演化TMA指将某一肿瘤疾病发展的各个阶段的标本(诸如原发间变和继发胶母、原发胶母和复发胶母等)集中在一块TMA中，能在一张切片上同时看到肿瘤组织在原位、转移、复发等不同进展阶段的变化情况，可用以检测特定肿瘤在不同发展阶段的分子病理改变，有助于对肿瘤发生、发展及浸润转移等过程的研究。预后TMA是将带有可利用的临床随访数据的肿瘤标本集中在一张TMA中。使用预后TMA可以研究已知的分子靶标的改变或信号传导通路的变化对肿瘤患者预后的影响[2]。TMA阵列中每个组织片段都对应于相应患者，因此利用TMA，结合临床数据和随访资料，可以对肿瘤患者进行大规模的回顾性数据分析，为疾病的早期诊断、早期治疗等提供指导。文献报道利用预后TMA发现Cyclooxygenase-2对鼻咽癌患者放疗预后有预测价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，该方法使得检测G0LPH3的表达的灵敏性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息；检测G0LPH3的表达具有重要的医学价值。本发明的一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，包括:(I)首先构建人胶质瘤细胞的组织芯片，然后进行免疫组化染色；(2)培养人胶质瘤细胞； (3)在G0LPH3的cDNA序列中采用下列两条候选序列对G0LPH3进行siRNA的敲减:5， -CAGCGCCTCATCAAGAAA-3，和 5， -GCCAACACCAATGAGGTT-3，；(4)使用Trizol试剂进行总细胞RNA的分离，采用工具箱合成第一股cDNA链，进行实时PCR扩增；(5)检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达并分析数据。步骤(3)中设计了一个shRNA序列，同时包含siRNA序列的正链和反链，采用一个环形序列来分离互补域。步骤(4)中所述的工具箱为ReverTra Ace qPCR RT工具箱。步骤(4)中所述的扩增为在ABI PRISM7900HT序列监测系统中进行。步骤(4)中所述的扩增条件为先在95°下进行3分钟，随后95°下10秒、55°下45秒重复循环40次。在本发明中，我们使用免疫组化方案和组织芯片分析检测了 97例原发GBM患者肿瘤中G0LPH3的表达量，并研究了 G0LPH3表达量对肿瘤预后的预测价值。G0LPH3对肿瘤生长的潜在作用则通过体外分离群进行siRNA实验来检测。最近的研究显示G0LPH3在多种类型的肿瘤中有致癌基因的作用。另外，还发现人胶质瘤中G0LPH3基因的表达水平与胶质瘤的病理级别密切相关，如胶质母细胞瘤中G0LPH3的表达水平最高。本发明最近利用基因芯片在8个高级别胶质瘤，12个低级别胶质瘤及一个正常脑组织样本中做了一些初步试验，结果显示高级别胶质瘤中更高水平的G0LPH3表达。这项结果的发现提示我们推测可以用G0LPH3作为GBM预后标志物的可能。目前的研究中41.2%的病人G0LPH3表达水平较高，58.8%的病人表达水平相对较低。G0LPH3的表达与病人总生存期及无进展生存期相关联，低水平表达G0LPH3的病人具有更长的总生存期或无进展生存期。Cox回归分析指出G0LPH3对于总生存期及无进展生存期是作为一个独立的影响因子。目前的相关结果提示高水平表达的G0LPH3是较差预后的一个预测标
O新的研究证据显示蛋白质的糖基化在癌症中起到重要作用，蛋白质糖基化的改变是许多癌症的一个重要特征。G0LPH3是在细胞内的反面高尔基网和内涵体结构之间运动，参与了许多细胞重要的生理过程，如物质运输，受体循环及蛋白糖基化。G0LPH3的过表达可以改变生长因子受体的内化及翻转，可以改变蛋白的糖基化。同样值得注意的是糖基化也介导了受体分选，配体结合及细胞内吞。因此，有理由推测G0LPH3过表达可以调节多个细胞信号通路，尤其是蛋白糖基化通路，最后导致肿瘤的发展。根据这个理论，我们的研究表明高水平G0LPH3表达与GBM病人较差的预后相关。在体外培养的GBM细胞实验显示RNA干扰技术下调G0LPH3的表达可以抑制肿瘤的增殖及克隆性生长。在人癌细胞中通过增强mTOR信号可以使G0LPH3产生致瘤作用；G0LPH3的过表达也提高了两种通过糖基化的mTOR相关复合物的蛋白水平。mTOR即作为一个下游启动子，也作为RTK-PI3K途径的上游调节子。据报道88%GBM的RTK-PI3K途径具有实质性改变，突出了其在GBM中的重要性。G0LPH3还与VPS35相互作用，VPS35是一种retromer复合物，可以管控蛋白质的逆向运输，可以改变作用在mTOR信号通路上雷帕霉素的敏感性。G0LPH3的表达水平及基因的复制数量可以作为mTOR信号通路敏感性的指示剂。G0LPH3高水平的表达相关于此通路对雷帕霉素的高度敏感。这种G0LPH3与VPS35的相互作用可能还可以管控fct信号通路，Wnt通路在肿瘤的发展中起到关键作用。几种mTOR通路的抑制剂如西罗莫司、替西罗莫司和依维莫司等，正在进行GBM病人的临床评估。尽管目前有关的机理尚 未阐明，实验数据同样缺乏，考虑到G0LPH3在蛋白糖基化通路及mTOR通路中的重要作用，我们可以假设G0LPH3很有可能通过mTOR途径促进GBM的瘤形成，我们有理由推测药物特异性靶向G0LPH3，尤其是GBM中过表达的G0LPH3，可以在GBM病人中取得良好效益。总的来说，我们证明了 G0LPH3高水平表达与GBM病人不好的预后相关。这些实验发现同样提示了 G0LPH3可以作为GBM病人预后的一个分子标志物。且在体外培养的GBM细胞实验显示RNA干扰技术下调G0LPH3的表达可以抑制肿瘤的增殖及克隆性生长。有益.效果(I)本发明通过小干扰RNA下调G0LPH3后在体外抑制了胶质母细胞的生长，通过RNAi下调G0LPH3后导致细胞周期停滞于Gl期；(2)本发明通过RNA干扰技术下调G0LPH3的表达可以抑制肿瘤的增殖及克隆性生长，为抗多形性胶质母细胞瘤药物的研究开拓了新途径；(3)本发明使得检测G0LPH3的表达的灵敏性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息；检测G0LPH3的表达具有重要的医学价值。
图1为OS (a)和PFS (b)的Kaplan-Meier生存曲线。以肿瘤中G0LPH3表达量分层后的0S(c)和PFS(d)的Kaplan-Meier生存曲线。图2为将G0LPH3敲减和过表达后在mRNA和蛋白水平上的效果。U87和U251细胞分别被建立在慢病毒基础上的小干扰RNA(shG0LPH3-l和shG0LPH3_2)或空质粒(作为阴性对照，PSCN为shG0LPH3的对照，FUGW为G0LPH3过表达的对照)或过表达G0LPH3的病毒载体(OE)转染，48小时后用实时RT-PCR检测G0LPH3在mRNA转录产物的水平(a为U87，c为U251细胞)，并用免疫印迹法检测蛋白量(b为U87，d为U251细胞)。数据以平均值土标准差的形式显示。所有实验均单独重复3次以上。*相对空质粒P < 0.05。图3为G0LPH3敲减后对细胞增殖和克隆形成的影响。a, b U251细胞中CCK-8试验和克隆形成。c，d U87细胞中CCK-8试验和克隆形成。数据以平均值土标准差的形式显示。所有实验均单独重复3次以上。*相对PSCN P < 0.05 (shG0LPH3的空质粒对照)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1( 1)组织样本这项研究的方案和组织样本的获取是经过第二军医大学生物医学研究伦理委员会批准的。人体组织的获取和使用完全遵照中国国家临床样本使用规范。GBM组织样本来源于之前已收集的病人组织样本，这些样本是从2000年I月至2010年12月间在上海长征医院神经外科住院接受外科手术治疗的胶质瘤患者身上获得。术前已接受化疗和放疗的患者不纳入分析。GBM的诊断由两位富有经验的病理学家独立诊断确认。( 2)组织芯片和免疫组化高通量脑胶质瘤组织芯片的制备:一、实验材料(一 )组织标本实验所用的组织标本选取上海长征医院2002-2010年之间手术切除、经病理证实为脑胶质瘤的组织300例，正常脑组织16例(由外伤减压性手术中获得)，上述均经过第二军医大学伦理委员会许可和患者及其家属同意。所有病理诊断及分级均由两位病理医生按照2007年WHO分级标准独立阅片确定。( 二)主要仪器设备
权利要求
1.一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，包括: (O首先构建人胶质瘤细胞的组织芯片，然后进行免疫组化染色； (2)培养人胶质瘤细胞； (3)在G0LPH3的cDNA序列中采用下列两条候选序列对G0LPH3进行siRNA的敲减:5，-CAGCGCCTCATCAAGAAA-3，和 5，-GCCAACACCAATGAGGTT-3，； (4)使用Trizol试剂进行总细胞RNA的分离，采用工具箱合成第一股cDNA链，进行实时PCR扩增； (5)检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达并分析数据。
2.根据权利要求1所述的一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，其特征在于:步骤(3)中设计了一个shRNA序列，同时包含siRNA序列的正链和反链，采用一个环形序列来分离互补域。
3.根据权利要求1所述的一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的工具箱为ReverTra Ace qPCR RT工具箱。
4.根据权利要求1所述的一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的扩增为在ABI PRISM7900HT序列监测系统中进行。
5.根据权利要求1所述的一种利用高通量组织芯片检测G0LPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的扩增条件为先在95°下进行3分钟，随后95°下10秒、55°下45秒重复 循 环40次。
全文摘要
本发明涉及一种利用高通量组织芯片检测GOLPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，包括(1)首先构建人胶质瘤细胞的组织芯片，然后进行免疫组化染色；(2)培养人胶质瘤细胞；(3)在GOLPH3的cDNA序列中采用两条候选序列对GOLPH3进行siRNA的敲减；(4)使用Trizol试剂进行总细胞RNA的分离，采用工具箱合成第一股cDNA链，进行实时PCR扩增；(5)检测GOLPH3在脑胶质瘤中的表达并分析数据。本发明的方法使得检测GOLPH3的表达的灵敏性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息；检测GOLPH3的表达具有重要的医学价值。
文档编号C12Q1/68GK103103263SQ20131001330
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者陈菊祥, 周劲旭, 徐涛, 卢亦成, 严勇, 秦荣, 王洪祥 申请人:中国人民解放军第二军医大学