专利名称：快速聚合番茄黄化曲叶病毒病多个抗性基因的引物及方法
技术领域：
本发明属于农业育种领域，特别涉及利用分子标记聚合多个番茄黄化曲叶病毒病抗性基因，选育抗病自交系的番爺育种方法。
背景技术：
:
番茄是茄科(Solanceae)番茄属(Solanum)的一年生或多年生植物，原产于南美洲的秘鲁、厄瓜多尔等地。番茄是世界上重要且具有高经济价值的农作物之一，也是中国栽培最广、产量最高的蔬菜作物之一。但栽培番茄中记载的病害有将近200种，尽管生产者可以使用包括栽培技术和杀虫剂等综合策略，但是利用传统的育种方法将抗病基因导入到现代品种中依然是番茄抵抗疾病的重要方法。在上百种番茄病原体中，由番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)引起的疾病一直是生产者重中之重的难题。近10年来，烟粉虱传播的双生病毒已经发展成为中国乃至世界番茄生产的限制因子。通过烟粉虱，TYLCV可以迅速进入番茄中，一旦进入植物体内就会大量复制并传遍整个植物体。该病具有爆发突然、扩展迅速、危害性强、无法治疗的特点，是一种毁灭性的番茄病害，植株一旦发病，尤其是在开花前发病，果实产量及商品价值均大幅度下降，严重时造成的损失可达100%。TYLCV属于双生病毒属，其分布范围受媒介昆虫——烟粉虱的限制。化学方法控制烟粉虱是一种有效地方法，但是商业上杀虫剂的滥用使得烟粉虱产生抗性，并且诱变出20种不同的番茄侵染性病毒。就像化学杀线虫一样，由于TYLCV对杀虫剂产生抗性以及对过量使用杀虫剂对公众健康的考虑，化学方法控制TYLCV也逐渐减少。利用遗传工程创造转基因抗性植株同样的成为一种有效地措施。这种技术解决了化学方法的弊端，并且也使番茄对线虫、TYLCV及其他病原菌产生了抗性。直到今天，抗性基因的自然渗入依然是控制番茄病原体的重要方法。关于抗番茄黄化曲叶病(TYLCV)的报道已有近40年，Cohen于1964年首次报导了一些抗性基因型，随后在野生材料智利番爺(51多毛番爺(51 habrochaites)>秘鲁番爺(51.醋栗番爺(5: pimpinellifoliuni)都分离出了抗性基因，但这些基因对番茄黄化曲叶病毒病并不是完全免疫的。在1990’s，Pilowsky和Cohen (2000)报导了 5: 的抗性，其具有5个相关的隐性基因。以色列农业研究中心利用5:peruvianum (PI 126926, PI 126930, PI 390681 和 LA441)培育了一系列高抗 TYLCV 的育种系。Michelson发现了 5: 对TYLCV的抗性。抗性受控于I个主效基因(命名为Ty-1，为部分显性遗传)和至少2个以上的修饰基因。这个抗性位点指Ty位点,5: chiIense中的抗性位点命名为Ty-1。Zamir将该Ty位点定位在第6号染色体的着丝粒部位。Ty-1等位基因为显性基因，因此，Ty-1/ Ty-1和Ty-1/+都具有TYLCV抗性。由于整合单个显性基因相对容易，因此该主效抗性 基因Ty-1得以广泛应用，带有该抗性基因的杂交种也在市场上大面积推广种植。野生番茄5: habrochai tes中LA386、LA1777等对TYLCV也表现较高水平的抗性，研究发现该抗性是由I个主效基因和几个修饰基因所控制。另外该野生种5: habrochai tes ‘B6013’中，有2个上位基因控制其对TYLCV的抗性，育种家由此育成了H24，之后相关研究证明H24携带Ty-2基因。Hanson等(2000)将其定位在11号染色体长臂上；Garcia等(2007)进一步将其定位在长臂终端，与SCAR (Sequence characterizedamplified region)标记T0302紧密连锁，遗传距离在5.0 cM以内。引物T0302F/T0302R和T0302F/TY2R1能够有效地检测基因型ty2/ty2和TY2/TY2。亚疏中心(AVRDC)在番茄育种进程中将Ty-2基因作为基本抗源，利用H24培育了一系列抗病自交系。Ty-3是最新报导的TYLCV抗性基因。Ji等(2007)利用感病材料5: Iycopersicum (7781)和抗TYCV的高代自交系(021108)，5: Chilense中LA2779的渐渗系杂交得到的F2群体，将Ty-3基因定位于第6染色体长臂上cLEG-31-P 16 (20 cM)和C2_At5g41480 (27 cM)之间。其为一个主效位点，可以解释60%的植株TYLCV抗性强度。LA4440是S.Chilense中LA2779的渐渗系，令人感兴趣的是，该品系兼抗TYLCV和ToMoV，抗性区域不仅包括Ty-3还包含Ty-1(Agrama and Scott, 2006),两者间的遗传距离仅15 cM。在一个基因型中同时存在Ty-1和Ty-3基因可能提供更高的抗性。Ty-4也来自于来源于野生智利番茄，位于3号染色体，为辅助增效基因，可以解释16%抗性程度变化。Ty-4单独存在时，抗性水平表现一般，与其他抗性标记同时存在时，能显著提高品系的抗性水平(Ji et al.2009)。Ty_5来自于4个秘鲁番爺，位于4号染色体,为专性抗病基因(Anbinder et al., 2009)。目前市场上推广应用的品种只是具有上述一个抗性基因，耐病品种只有Ty-1抗性基因，普遍抗性弱，仅有一定的耐病性。而具有Ty-2的抗性品种只有专性抗性，具有地区选择性。Ty-3抗性基因也是属于不完全显性抗性，在纯合的Ty-3基因型抗性强。目前尚没有一个抗性基因对TYLCV所有生理小种均有抗性。所以市场上推广的品种，普遍存在抗性效应差，抗性有选择性，抗 性退化等问题，如果能将上述2个或2个以上的抗性基因聚合到同一个品系中，就会产生更加稳定持久的抗性。但是由于番茄黄化曲叶病毒病的抗性遗传比较复杂，抗源材料不同，其抗性遗传规律也不同，有的抗源材料的抗性是属于不完全显性的单基因控制，有的是数量性状，还有的是显性单基因。所以通过杂交进行不同效应基因的聚合育种，并进行抗性评价，才能培育抗性更稳定的育种品系。综上所述，鉴于黄化曲叶病毒病发生的普遍性以及危害的严重性，必须兼具多个TYLCV抗性基因综合抗性，才有较高的并且稳定持久的抗病性，市场推广应用才有可能。但是采用常规技术很难把它们聚合在同一个基因型中。
发明内容
针对市场上缺乏具有TYLCV持久稳定抗性的优质番爺品种,而利用传 统技术难以对抗病基因Ty-2，Ty-3和Ty_4进行聚合，同时去除不利农艺 性状的连锁累赘的问题。本发明旨在提供一种快速聚合番茄黄化曲叶病毒 病多个抗性基因的引物及方法。快速聚合番茄黄化曲叶病毒病多个抗性基因的引物，包括三对引物，S卩引物对Ty2-caps, Ty3- caps 和 Ty4_scar,其中:
Ty2_caps 正向引物 Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5’- AGC TGA TGA aca cct cgt gacatC -3，;
Ty2_caps反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG-
3，；Ty3-caps正向引物Seq ID N0.3 Ty3-caps_F: 5，- AGT CTG GTG GTG MT AGG CAT CA
_3，；
Ty3_caps 反向引物Seq ID N0.4 Ty3_caps-R: 5’ TTA GTA CCC CAA GGG MC MG AGT-
3，；
Ty4-scar 正向引物 Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCCTG -3，;
Ty4-scar 反向引物Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5，GCT CAC TTT GCA MT CAC ATC CCCATC - 3，。一种利用所述的引物快速聚合番茄黄化曲叶病毒病多个抗性基因的方法，其步骤包括:
(1)将分别携有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3或Ty_4抗性基因的番茄植株进行杂交，获得Fl代杂交种，并进行多代自交，获得不同世代的自交系；
(2)利用所述的三对 引物对各自杂交系进行筛选，获得纯合Ty2/Ty2、Ty-3/Ty_3与Ty-4/ Ty-4基因，并具有稳定抗黄化曲叶病毒病的番茄自交系。所获得的番茄自交系至少包括Ty-2、Ty-3与Ty_4黄化曲叶病抗性等位基因。利用引物对 Seq ID N0.1 Ty2-caps_F 与 Seq ID N0.2 Ty2_caps-R 对自交系是否含有纯合Ty2/Ty2基因进行鉴定，鉴定方法为:
(1)提取各单株幼苗总DNA，利用引物对SeqID N0.1 Ty2-caps_F与Seq ID N0.2Ty2-capS-R 进行 PCR 扩增；
(2)对PCR产物进行TfeaI限制性内切酶进行酶切，利用琼脂糖凝胶电泳，若只有一条425 bp DNA片段，则该单株幼苗中含有纯合Ty2/Ty2基因。利用引物对 Seq ID N0.3 Ty3-caps_F 与 Seq ID N0.4 Ty3_caps-R 对自交系是否含有纯合Ty3/Ty3基因进行鉴定，鉴定方法为:
(1)提取番茄单株幼苗总DNA，利用引物对SeqID N0.3 Ty3-caps_F与Seq ID N0.4Ty3-capS-R 进行 PCR 扩增；
(2)对PCR产物进行Taql酶切，利用琼脂糖凝胶电泳，若有两条条带，则该单株中含有纯合的黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3/Ty_3。利用引物对 Seq ID N0.5 Ty4-scar-F 与 Seq ID N0.6 Ty4_scar-R 对自交系是否含有纯合Ty4/Ty4基因进行鉴定，鉴定方法为:
(1)提取番茄单株幼苗总DNA，利用引物对SeqID N0.5 Ty4-scar_F与Seq ID N0.6Ty4-scar-R 进行 PCR 扩增；
(2)利用琼脂糖凝胶电泳，若有一条600bp的条带，则该单株中含有纯合的黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-4/Ty_4。本发明所涉及的可供商业化品种满足市场多方面的需求，包括较好的农艺性状，较高的作物产量，较强的TYLCV抗性以及良好的商品性等更多。特别是，本发明涉及产生高抗TYLCV的番茄品种。商业杂种的选育需要首先形成纯合的稳定亲本。在育种项目中，从2个或更多个种质或基因池中存在的多个目标性状聚合到优势育种品种中。需要的自交系或亲本系通过连续的自交与选择最好的育种系，并利用分子标记加快选育过程。根据目前发明所指，一个是稳定的亲本材料，另一个包括配制的Fl代杂交种。稳定亲本材料是指能够开放授粉的自交系，目标性状通过多轮自交与种植以后还是稳定的。本发明的有益效果:
1.等位基因特异性PCR技术具有特异性高、重复性好以及费用低廉等优点。将其应用到植物的分子育种中可以加速育种世代，节约时间和人力。由于这样的分子标记实际上就是功能基因本身局部片断的扩增结果，所以能非常可靠地直接鉴别该功能基因，具有极好的实际应用效果。2.以分子标记为依据，可以准确地确定杂交后代单株中是否含有Ty-2，Ty-3和Ty-4基因的结合状态，从而筛选出同时含有Ty-2，Ty-3和Ty-4的单株，在短时间内实现这3个基因的聚合和纯化，进而选育出具有稳定抗性的番茄新品种。
图1 番茄单株利用 Seq ID N0.1 Ty2-caps_F /Seq ID N0.2 Ty2_caps-R 引物PCR扩增产物T&al酶切后电泳结果。M，100 bp DNA ladder; I为感病单株，有一条540 bp条带；2为抗病单株，有一条425 bp的条带。3为ddH20对照。图2 番茄单株利用 Seq ID N0.3 Ty3-caps_F/Seq ID N0.4 Ty3_caps-R 引物 PCR扩增产物T1ai7I酶切后电泳结果。M，100 bp DNA ladder; 1，2为感病单株，只有一条1235bp的条带；3，4为抗病单株，有2条分别为860 bp与375bp的条带；3为ddH20对照。图3番茄单株利用Seq ID N0.5 Ty4-scar_F/ Ty3_scar-R引物PCR扩增产物电泳结果。M, 100 bp DNA ladder; I为ddH20对照,2, 3为抗病单株,有一条600 bp的条带；4，5为抗病单株，无条带。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步的说明。利用分子标记技术可以有效地鉴别目标基因，实现目标基因的累加和聚合。为此我们快速聚合多个TYLCV不同效应的抗性基因，培育具有多个抗性位点的番茄新种质提供了可能性。本发明是以筛选TYLCV抗性基因特异性分子标记为核心，以分子标记辅助选择为基础，把Ty-2，Ty-3以及Ty_4多个抗性基因聚合到番茄同一自交系中，培育出对黄化曲叶病毒病具有稳定持久抗性的番茄新品种，具有非常广阔的市场前景和推广应用价值。本发明包括以下步骤:
(I)利用TYLCV抗性试验筛选抗病资源。TYLCV抗性试验筛选指的是:在自然状态下种植番茄植株，在这种环境下黄化曲叶病毒自然进行侵染，使用0-4的侵染指数来对植株的感病情况进行一次或多次评定。O级:无症状；1级:叶片轻微发黄；2级:叶片明显发黄，并且出现卷叶，植株部分组织有症状；3级:植株发育迟缓，叶片严重发黄且卷曲，整个植株出现严重症状；4级:植株发育严重迟缓，具有发黄的、卷缩的小叶。当一个番茄品种或株系平均病情指数在0-1级的，即可鉴定为其对TYLCV具有抗性；中度抗性平均发病指数大约为2 ; 而敏感型的病情指数均在3以上。(2)抗黄化曲叶病毒病基因Ty-2连锁分子标记的筛选
本发明利用分子标记分析方法筛选了一个同Ty-2紧密连锁的Caps分子标记，可用于早期鉴定具有Ty-2抗性的番茄种质以及分离单株。这对Ty2caps扩增引物包括正向引物:Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5，- AGC TGA TGA aca cct cgt gac atC _3，;与反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG- 3’。PCR反应扩增产物直接利用fcal限制性内切酶进行酶切反应，再根据电泳条带大小就可以区分抗病类型与感病类型，并从中鉴定出Ty-2/Ty-2类型的番茄单株。(3)抗黄化曲叶病毒病基因Ty-3连锁分子标记的筛选
本发明利用序列分析方法筛选了一个同Ty-3紧密连锁的Ty3-caps分子标记，可用于早期鉴定具有Ty3抗性的番茄种质以及单株。用于筛选的CAPs引物对为:正向引物Seq IDN0.3 Ty3-caps-F: 5’- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3’ 与反向引物 Seq ID N0.4Ty3-caps-R: 5’ TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3’。PCR 反应体系总体积 25 μ I,包括 2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 5 μ I 5X buffer, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I (0.5units) Taq DNA polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物，5μ I ddH20以及5 μ I DNA抽提物。PCR反应程序:94 °C变性3 min, 33次循环包括94° C变性30 S，55 °C退火I min, 72 °C延伸I min.最后72 °C保持7 min。PCR扩增产物通过Taql酶切后能较好地区分感病类型(ty-3)与抗病类型(Ty_3)，并从中筛选出纯合的Ty3/Ty3抗病植株类型。(4)抗黄化曲叶病毒病基因Ty-4连锁分子标记的筛选
本发明设计并验证了一对SCAR扩增引物，其中正向引物:Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCC TG -3，;与反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R:5’ GCT CAC TTT GCA AAT CAC ATC CCC ATC - 3’ 。PCR反应体系为:2.5μ1 2.5 mM dNTPs, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.2 μ I (1.0units) Taq polymerase, 2.5 μ I 10 μ M正向引物，2.5 μ I 10 μ M反向引物以及5 μ IDNA抽提物，5 μ I 5Χ buffer,加入约5 μ I dd H2O,使总反应体积为25 μ I。PCR反应程序:94 °C变性3 min,然后94 ° C变性30 s, 53 °C退火I min, 72 °C延伸I min,共循环35次。在72 0C温浴10 min后，在4 °C保存。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增片段，根据PCR条带可以成功地区分番茄植株是否携带有Ty-4基因。(6)稳定抗病自交系的培育
利用含有纯合Ty-2基因的番茄自交系为母本，含有Ty-3以及Ty-4抗性基因的野生番茄自交系为父本杂交，获得同时含有Ty-2，Ty-3与Ty_4等三个抗性基因杂合体F1代，通过上述杂交获得的F1群体通过自交获得不同的F2群体。收获的F2代种子播于田间，利用实验室接种鉴定结合田间接种鉴定技术，对分离群体的每个单株进行抗黄化曲叶病毒病评价。同时取F2代单株苗期嫩叶，提取基因组DNA后利用上述筛选的3对分子标记引物组合进行检测，分析其抗病基因类型，选择同时出现这三个基因分子标记的个体，即含有纯合抗TYLCV病毒基因Ty2Ty2/Ty3Ty3/Ty4Ty4。上述含有Ty2\T y3\Ty4纯合基因型的番茄单株种植在温室，进一步在田间观察其抗病性。选择抗病性强的单株进行自交，并留下F3代种子。入选的F3株系在苗期利用室内接种法评价各株系的病情指数，并利用上述3对PCR引物组合鉴定抗TYLCV基因类型，选择包含有3个抗病基因的单株，种植于田间，待田间评价其抗病特性后，选择抗性株系中的优良单株自交留种，获得F4代种子。
F4代种子播于人工气候室内，评价其抗病性，并利用上述3对PCR引物组合鉴定抗TYLCV基因类型，选择包含有3个抗病基因的单株自交留种。F4代自交后筛选即可获得的性状稳定的目标自交系。
实施例(I)黄化曲叶病毒病(TYLCV)抗性鉴定方法
在天然的高发地块大田种植接种本地病毒鉴定植株抗性是一个优先选择的方法。番茄幼苗生长在田间通过接种人工饲养带毒(TYLCV)烟粉風(汝 isia tabaci )进行天然接种。在田间观察接种后植株的发病症状，每个单株发病严重程度都需统计3次，第3次统计分析数据才用于评价最准确的抗性水平，减少逃逸可能性。TYLCV病毒病的病症通常分为0-4级。O级:无症状；1级:叶片轻微发黄；2级:叶片明显发黄，并且出现卷叶，植株部分组织有症状；3级:植株发育迟缓，叶片严重发黄且卷曲，整个植株出现严重症状；4级:植株发育严重迟缓，具有发黄的、卷缩的小叶。当一个番茄品种或株系平均病情指数在0-1级的，即可鉴定为其对TYLCV具有抗性；中度抗性植株平均发病指数大约为2 ;而敏感型植株的病情指数均在3以上。(3)抗黄化曲叶病毒病基因Ty-2连锁分子标记的筛选。Ty-2来源于多毛番爺(5:是目前番爺抗TYLCV品种选育中主要抗性来源。Hanson等(2000)将其定位在第11染色体长臂上RFLP分子标记TG36与TG393相距19 cM片段区间，而Ji等(2009)进一步将其定位在C2_Atlg07960 (82.5 cM)与C2_At4g32930 (88 cM)之间共5.5 cM的片段上，其中SGN上公布的BAC_119J05位于这一区间内。根据业已公布的番爺全基因组序列(http://www.sgn.Cornell, edu),通过比较抗性品种与感病品种在这一端的DNA序列差异，利用Primerf.0设计了一对CAPs扩增引物，其中正向引物:Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5’- AGC TGA TGA aca cct cgt gac atC-3，;与反向引物 Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG- 3’。反应体系:2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 2.0 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I (0.5 units) Taqpolymerase, 2.5 μ I 10 μΜ正向引物，2.5 μ I 10 μΜ反向引物以及5 μ I DNA抽提物20 ng DNA)，5 μ I 5X buffer,加入约 5 μ I dd H2O,至 25 μ I 反应总体积。在PCR扩增仪上按以下反应程序进行:先94 °C变性3 min,然后34次循环包括94 °(:变性30 S，56 °C退火45 S，72 °C延伸I min，最后在72 °C保持7min。PCR扩增产物利用
1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后，在紫外灯下拍照。结果显示利用该对引物在不同基因型中均可扩增540-bp左右的一条清晰条带。将上述PCR产物直接进行酶切反应。取上述10 μ I PCR混合产物，加入 0.25 μ I BSA, 0.5 μ I Rsal 限制性内切酶(NEB Inc.)，2.5μ I IOXbuffer (NEB Inc.)，加上约 12 μ I ddH20,至 25 μ I 的反应总体积。在 37 °C水浴锅温浴2 h.再利用1.8%琼脂糖凝胶电泳。结果显示酶切后感病植株有一条540 bp条带，而Ty-2类型植株酶切后变小，只有425 bp,酶切片段约70 bp左右不能显示(图1)。这样可以成功地区分番茄单株是否携带了 Ty-2基因。(4)抗黄化曲叶病毒病基因Ty-3连锁分子标记的筛选
Ty-3是最新报导的TYLCV 抗性基因。LA4440是L.Chilense中LA2779的渐渗系，该品系兼抗TYLCV和ToMoV，抗性区域不仅包括Ty-3还包含Ty-1，两者间的遗传距离小于15CM。在一个基因型中同时存在7>-7和基因可能提供更高的抗性。其中位于第六染色体上的Ty3区间可以解释65%的TYLCV抗性变异。通过该25 cM区间序列分析可以发现，Ty3同抗双生病毒的抗性株系连锁，而ty-3同感病植株连锁。进一步分析发现，在Ty3与ty-3植株类型中在BAC clone AY678298从171300-173050的位置存在着多个SNP差异标记。野生型(ty-3)在该区域无/^<7 I酶切位点，而抗性突变体Ty3类型有I个TaqI酶切位点。根据以上序列特性，成功设计了一对Caps引物，可以清楚地扩增单一条带，通过酶切后能较好地区分抗病与感病不同类型，筛选出纯合的Ty3/Ty3植株类型。利用Primer3.0设计扩增引物Ty3_caps,其中正向引物:Seq ID N0.3Ty3-caps-F: 5’- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3’；反向引物 Seq ID N0.4Ty3-caps-R: 5’- TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3’。PCR 反应体系:总体积 25μ I,包括2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 5 μ I 5X buffer, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I(0.5 units) Taq DNA polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物，5 μ I ddH20以及5 μ I DNA抽提物。PCR反应程序:94 °C变性3 min, 33次循环包括 94 0C 变性 30 S，55 °C 退火 I min, 72 °C 延伸 1.5 min.最后 72 °C 保持 10 min。PCR扩增产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳显示利用该对引物在不同基因型中均可扩增1235-bp左右的一条清晰条带。酶切反应体系:10 μ I PCR反应混合物，0.25 μ I BSA, I μ I T^I限制性内切酶，3 μ 10 X buffer,再加上11 μ I ddH20,至25 μ I的反应总体积。在65 °C水浴锅温浴3 h.再利用1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果显示酶切后野生型植株还是仅有一条1235bp条带，而Ty3植株类型有两条条带，分别为860 bp与375 bp (图1)
(4)抗黄化曲叶病毒病基因Ty-4连锁SCAR分子标记的筛选
Ty-4同Ty-3 —样来源于智利番爺(5:其位于第3染色体的长臂端分子标
记 C2_Atlg02140 (71 cM)与 TG599 (85 cM)之间(Ji et al.2009)。根据其公布的序列结合测序结果，发现在抗性品种基因组的DNA序列中存在少数Indel片段(Maxwell，2009)，根据这些片段设计引物，最终利用Primerf.0设计了并验证了一对SCAR扩增引物(Ji etal.2009)，其中正向引物:Seq ID N0.5 Ty4-scar-F: 5’- P3-81-F:5’ -GCG GAC TTGGAT GAT GAC ACG GCC TG -3’ ;与反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5’ -GCT CAC TTTGCA AAT CAC ATC CCC ATC - 3’ 。PCR 反应体系为:2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.2 μ I (1.0units) Taq polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物以及 5μ I DNA 抽提物( 20 ng DNA), 5 μ I 5X buffer,加入约 5 μ I dd H2O,使总反应体积为25 μ I。PCR反应程序:94 °C变性3 min,然后94 °C变性30 s, 53 °C退火Imin, 72 °C延伸I min,共循环35次。在72 ° C温浴10 min后，在4 °C保存。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增片段，EB染色后，在紫外灯下拍照。结果显示利用该对引物在抗性品种中可以扩增一条600-bp左右的一条清晰条带，而对照与感病基因型中并没有相应条带。由此可以成功地区分番茄植株是否携带有Ty-4基因。(5)聚合Ty-2，Ty_3和Ty_4基 因到同一个基因型中
利用含有纯合Ty-2基因的栽培番茄自交系H24 (美国番茄种质资源库)为母本，以含有Ty-3以及Ty-4抗性基因的野生番茄5: Chilense LA2779/LA1932的渐渗系024525为父本杂交，获得同时含有Ty-2，Ty-3与Ty_4等3个抗性基因杂合体F1代，通过上述杂交获得的F1群体通过自交获得不同的F2群体。收获的F2代种子播于田间，利用实验室接种鉴定结合田间接种鉴定技术，对分离群体的每个单株进行抗黄化曲叶病毒病评价，在不同生育期评价3次。同时取F2代单株苗期嫩叶，提取基因组DNA后利用上述筛选的3对分子标记引物组合进行检测，分析其抗病基因类型。在匕分离群体中，会出现不同的基因型，其中有少量植株同时含有Ty-2，Ty-3与Ty-4纯合基因型，从自交后代中剔除杂合基因型，选择同时出现这3个基因分子标记的个体，即含有纯合抗TYLCV病毒基因Ty2Ty2/Ty3Ty3/Ty4Ty4。(6)高抗黄化曲叶病毒病番茄优良自交系的选择
上述含有Ty2\Ty3\Ty4纯合基因型的番茄单株种植在温室，进一步在田间观察其抗病性。选择抗病性强的单株进行自交，并留下F3代种子。入选的F3按株系播种后，在苗期利用室内接种法评价各株系的病情指数以及抗病植株所占比例。利用上述3对PCR弓丨物组合鉴定抗TYLCV基因类型，选择包含有3个抗病基因的单株，种植于田间，待田间评价其抗病特性后，选择抗性株系中的优良单株自交留种，获得F4代种子。F4代种子播于人工气候室内，在苗期利用室内接种法评价各株系的病情指数以及抗病植株所占比例。利用上述3对PCR引物组合鉴定抗TYLCV基因类型，选择包含有3个抗病基因的单株，种植于田间，待田间评价其抗病特性后，选择抗性株系中的优良单株自交留种。F4代自交后筛选即可获 得的性状稳定的目标自交系。
权利要求
1.一种快速聚合番茄黄化曲叶病毒病多个抗性基因的引物，其特征在于，包括三对引物，即引物对 Ty2_caps, Ty3- caps 和 Ty4_scar,其中:Ty2_caps 正向引物 Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5’- AGC TGA TGA aca cct cgt gacatC -3，;Ty2_caps反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG-3，；Ty3_caps 正向引物Seq ID N0.3 Ty3-caps_F: 5’- AGT CTG GTG GTG MT AGG CAT CA_3，；Ty3_caps 反向引物Seq ID N0.4 Seq ID N0.4 Ty3_caps-R: 5’ TTA GTA CCC CAA GGGAAC AAG AGT- 3，；Ty4-scar 正向引物Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCCTG -3，;Ty4-scar 反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5’ GCT CAC TTT GCA AAT CAC ATC CCCATC - 3，。
2.一种利用如权利要求1所述的引物快速聚合番茄黄化曲叶病毒病多个抗性基因的方法，其特征在于，其步骤包括: (1)将分别携有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3或Ty_4抗性基因的番茄植株进行杂交，获得Fl代杂交种，并进`行多代自交，获得不同世代的自交系； (2)利用所述的三对引物对各自杂交系进行筛选，获得纯合Ty2/Ty2、Ty-3/Ty_3与Ty-4/ Ty-4基因，并具有稳定抗黄化曲叶病毒病的番茄自交系。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所获得的番茄自交系至少包括Ty-2、Ty-3与Ty-4黄化曲叶病抗性等位基因。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用引物对SeqID N0.1 Ty2-caps_F与SeqID N0.2 Ty2-caps-R对自交系是否含有纯合基因进行鉴定，鉴定方法为: (1)提取各单株幼苗总DNA，利用引物对SeqID N0.1 Ty2-caps_F与Seq ID N0.2Ty2-capS-R 进行 PCR 扩增； (2)对PCR产物进行TfeaI限制性内切酶进行酶切，利用琼脂糖凝胶电泳，若只有一条425 bp DNA片段，则该单株幼苗中含有纯合Ty2/Ty2基因。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用引物对SeqID N0.3 Ty3-caps_F与Seq ID N0.4 Ty3-caps-R对自交系是否含有纯合Ty3/Ty3基因进行鉴定，鉴定方法为: (1)提取番茄单株幼苗总DNA，利用引物对SeqID N0.3 Ty3-caps_F与Seq ID N0.4Ty3-capS-R 进行 PCR 扩增； (2)对PCR产物进行Taql酶切，利用琼脂糖凝胶电泳，若有两条条带，则该单株中含有纯合的黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3/Ty_3。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用引物对SeqID N0.5 Ty4-scar_F与Seq ID N0.6 Ty4-scar-R对自交系是否含有纯合Ty4/Ty4基因进行鉴定，鉴定方法为: (1)提取番茄单株幼苗总DNA，利用引物对SeqID N0.5 Ty4-scar_F与Seq ID N0.6Ty4-scar-R 进行 PCR 扩增；(2)利用琼脂糖凝胶电泳，若有一条600bp的条带，则该单株中含有纯合的黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-4/Ty-4。`
全文摘要
本发明公开了一种快速聚合番茄黄化曲叶病毒病多个抗性基因的引物及方法。根据番茄基因组DNA序列特征筛选两对分别与抗黄化病毒病Ty-2与Ty-3紧密连锁的CAPs分子标记，筛选了一对与抗黄化曲叶病毒病基因Ty-4紧密连锁的SCAR分子标记；将分别含有黄化病毒病抗性基因Ty-2，Ty-3，Ty-4的番茄亲本杂交，并通过多代自交，利用筛选的分子标记为依据鉴定单株，获得含有Ty-2，Ty-3与Ty-4纯合基因，并具有稳定黄化曲叶病毒病抗性的优良自交系。本发明具有特异性高、重复性好以及费用低廉等优点，可以加速育种世代，节约时间和人力。短时间内实现这3个基因的聚合和纯化，进而选育出具有稳定抗性的番茄新品种。
文档编号C12Q1/68GK103103185SQ20131003344
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者卢钢, 郑积荣, 陈景丽, 王洁, 朱翔飞, 陈丽妃 申请人:浙江大学