专利名称：产电基因工程菌的构建、菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种产电基因工程菌的构建、菌株及其应用。
背景技术：
微生物燃料电池(microbial full cells，MFCs)是一种利用微生物作为生物催化剂将生物质化学能转化为电能的装置，生活和工业污废水中含有的丰富有机物就可以作为其原料来源，从中直接获取电能。微生物电池除了具有很高的能量转化效率外，还有其他燃料电池不具备的若干特点:①燃料来源多样化；②操作条件温和；③无污染，可实现零排放；④无需能量输入；⑤能量利用的高效性；⑥生物相容性。因此，微生物燃料电池的研究已经成为治理和消除环境污染源，开发新型能源，是新能源研究工作者的关注热点。电子传递体是MFC的产电机制之一，它经常被加入到MFC中，从而使细菌甚至酵母能传递电子。通过细胞色素蛋白直接接触进行的电子传递只能在细胞与电子受体直接接触或者纳米级的距离内进行，而事实上，金属异化还原均可以在一定距离外进行，预示这些微生物可以分泌可溶性电子介体类物质还原不溶性电子受体，这使得电子中介体成为近年来的MFC研究热点之一。研究者曾使用多种电子中介体促进电子从胞内向胞外的电子传递。这些外源中介体包括中性红、2，6_蔥醌、铁氰化钾、甲基紫精。常见的内生电子中介体有醌类物质、绿脓素吩嗪类色素等。关于绿脓素化合物的产生原因还不是完全清楚，可能是由于外源电子传递的机 制或其他原因产生。这些化合物也具有抗生素特性。因此，分泌这些化合物的主要原因可能是作为呼吸作用的抑制剂或阻止其他竞争者生长。铜绿假单胞菌是产电子传递体的主要微生物之一，其主要的产电机制即为产生绿脓素作为电子传递体。绿脓素作为有效的电子传递介体，具备了以下特性:(I)为亲水性的物质；(2)氧化还原电位要与生物体电子传递链的氧化还原电位(NADH的氧化还电位是-0.32V)相匹配；(3)在电极上的氧化还原反应速率非常快，且有很好的可逆性。因此人为提高铜绿假单胞菌中绿脓素的量是提高纯菌产电量的有效措施。目前关于铜绿假单胞菌在MFC中应用的文献报道主要集中在绿脓素上。Rabaey等从微生物燃料电池中分离出铜绿假单胞菌，其能够代谢出吩嗪类色素，该类物质(如绿脓菌素)具有电化学活性，能够提高某些细菌的功率输出。目前有研究报道在微生物燃料电池中，以绿脓杆菌为主的混合菌作为微生物源能产生高浓度的电子传递介体，同时电能达到了 3.1-4.2 W/m2。此外也有文献报道，在绿脓杆菌接种的微生物燃料电池中检测出了具有电化学活性的绿脓菌素(pyocyanin)和1_酰胺-吩嗪(phenazine-1-carboxamide),将这些物质用于由某些微生物接种的微生物燃料电池时可以明显提高电池的电流输出。Rabaey等以绿脓杆菌为阳极微生物，以铁氰化钾为阴极电子受体，功率密度达到3.1 4.2 W /m2，研究表明假单胞菌可以通过自身分泌物或代谢产物作为电子传递介体
发明内容
本发明的目的在于提供一种产电基因工程菌的构建方法、菌株及其应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案为:
一株产电基因工程菌菌株，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAOl-phzM,已于2013年I月6日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号:CCTCCNO:M:2013001,本菌在普通LB培养基中就能生长，因可产生大量绿脓素而使菌落呈深蓝绿色，抗50 μ g/ml庆大霉素。上述产电基因工程菌菌株的构建方法，以铜绿假单胞菌PAOl菌株为宿主菌，将甲基转移酶基因插入pBBRlMCS-5载体的EcoRI和SpeI酶切位点之间，再将重组质粒导入表达宿主中，获得产电基因工程菌；具体步骤如下:
1)以铜绿假单胞菌PAOI基因组为模板，PCR扩增出phzim因，连接到测序载体PMD19-TSimple载体,经测序与Genebank上公布的序列(Gene ID:880514)比对完全正确后,设计酶切位点EcoRI和Spel，用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切phzM基因片段和pBBRlMCS-5载体，得到重组质粒pBBRlMCS-5-phzM ；
2)将构建好的重组质粒pBBRlMCS-5-/7Az#转化至DH5α感受态细胞，得到重组大肠杆菌 DH5 a -pBBRlMCS-5-/ ^#,选取阳性克隆；
3 )将鉴定后的阳性克隆的质粒电击转化导入到铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa PAOl的感受态细胞中，经50 μ g/mL的庆大霉素筛选得到基因工程菌PkOl-phzMo所述产电基因工程菌菌株在微生物燃料电池中的应用，包括如下步骤:
1)菌种活化:将产电基因工程菌/ 仍接种到含有50μ g/ml庆大霉素的LB平板上，培养过夜，挑取平 板上长出的单菌落到5ml LB培养基中，37°C，200rpm培养过夜，其中LB培养基配方(1L):蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，若是固体培养基则再加2%琼脂粉；
2)诱导培养:将活化的菌液按照体积比2%的接种量接入25mlLB培养基中，37°C，200rpm，有氧培养菌体OD600至3.7时加入1.34mM的IPTG诱导IOh ；
3)产电:将诱导培养后的菌液与PBS、葡萄糖混合成阳极液接入电池中，电池置于37°C培养箱中恒温培养，其中阳极液的配比:菌液25ml，10 g/L葡萄糖20ml，50mmol PBS缓冲液5ml ο有益效果:本发明采用基因工程手段将绿脓素合成途径中关键基因-甲基转移酶基因在铜绿假单胞菌中进行重组表达，使重组铜绿假单胞菌能够多产绿脓素2.7倍，从而大幅提高产电能力，与原始菌株相比输出电压提高了 2倍，为产电铜绿假单胞菌的基因工程研究奠定了良好的基础。
图1铜绿假单胞菌中绿脓素的合成途径；
图2表达载体PBBR1MCS-5-/7AZ#的构建图谱；
图3表达载体pBBRlMCS-5-/7Az#导入铜绿假单胞菌PAOl的酶切鉴定图谱；
图4铜绿假单胞菌PAOl原始菌和基因工程菌PAOI绿脓素产量HPLC图谱；
图5铜绿假单胞菌PAOl原始菌输出电压 图6产电工程菌PA01-/7Az#输出电压图；本发明的产电基因工程菌菌株，其分类命名为铜绿假单胞菌aeruginosa ) VhQl-phzM;其保藏机构全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国.武汉.武汉大学；保藏号编号为=CCTCC NO:2013001。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明的生物材料的来源的说明:
1、质粒来源:
(1)PMD19-T S imple:购自 Takara 公司；
(2)pBBRlMCS-5:赠自李顺鹏教授；申请人在此声明，保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。2、基因组模板来源:
铜绿假单胞菌基因组DNA:赠自西北大学段康民教授；
3、原始菌株铜绿假单胞菌PAOl的来源:赠自西北大学段康民教授。4、引物的设计及合成:自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。实施例1
本实施例说明构建包含表达基因PhzM的中间质粒PMD19-T-/7Az#。其过程包括:
1、设计合成不带有酶切位点的上游引物和下游引物，
Primerl 上游引物:5’ -CGATGAATAATTCGAATCTTGCTGCTGCG-3’ ；
Primer2 下游引物:5，- TCACGTATTTTTACAGCA -3，。2、以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段/^KGeneID:880514)，反应条件为:98。C 预变性 2min ;98。C IOs, 60° C 15s, 72。C lmin, 35个循环后，72°C，5 min，4°C，过夜。PCR扩增出的/7如#基因后，经T-A克隆连接到测序载体PMD19-T Simple质粒，挑取正确的转化子，经测序，比对正确。实施例2
本实施例说明构建包含表达基因PhzM的中间质粒pBBRlMCS-5-/7Az#。其过程包括:
1、设计合成带有及J酶切位点的上游引物和带有分e I酶切位点的下游引物(下划线部分为相应的酶切位点)，
Primerf 上游引物:5’ - CGGAATTCATGAATAATTCGAATCTTGCTGCTGCG-3> ；
Primer4 下游引物:5’ - GGACTAGTTCAGGCCCTGGCAGCGACGATCATGCG-3，。2、以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为:95°C，10 min ；(95°C 30 s，60°C 30s, 72°C 1.5min，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的
基因(参照Takara DNA片段纯化试剂盒说明书)和表达质粒pBBRlMCS-5分别用EcoR/和分e I双酶切、连接转化至DH5a感受态细胞(购自Takara公司)，使用汝./JJ酶切鉴定重组质粒pBBRlMCS-5-/7Az#，得到两条带大小分别是1200bp和4475bp，酶切结果表明，重组质粒pBBRlMCS-5-/7Az#构建成功，获得重组质粒pBBRlMCS-5-/7Az#，构建过程见图2。3、铜绿假单胞菌PAOl的感受态制作:从铜绿假单胞菌PAOl甘油菌接种于装液量为5mL LB液体培养基的50mL离心管中，37°C，200 rpm振荡培养过夜。以1%的接种量转接至另一个50mL LB液体培养基的500mL摇瓶中，37°C，200 r/min振荡培养；A_值为0.5左右时终止培养，冰浴IOmin ;4°C，2300Xg离心10 min ;菌体沉淀依次用IOOOmL冰浴SMEB溶液重新悬浮，洗涤菌体；4°C，2300Xg离心10 min，最后根据菌体量加入不同体积的SMEB溶液混匀；分装成每管IOOuL电转化。4、将鉴定后的阳性克隆的质粒经电击转化导入铜绿假单胞菌PAOl的感受态细胞
(1)重组质粒IOul、空质粒10ul与铜绿假单胞感受态细胞IOOuL混勻，加入预冷的
0.2cm电转化杯中，冰浴IOmin ；
(2)在Bio-Rad电转化仪上(输出电压1.5 kV，电容25uF，电阻200ohm)电击4
(3)将转化体系加入冰浴的400uLSOC培养基，转至1.5 mL的离心管中，37°C，200 r/min振荡复苏Ih ；
(4)取IOOuL菌液在含50ug/mL庆大霉素的LB平板筛选；
(5)将平板至于37°C培养，培养16 18h直至单个菌落出现。次日挑取单菌落，接入含50 μ g/mL庆大霉素的5mL LB液体培养基中，37°C，200rpm摇床培养1(T12 h后 进行质粒提取，经EcoRI和SpeI酶切得到阳性转化子PAOl-phz#，酶切结果见图3。实施例3
本实施例说明构建成功的含有重组表达质粒pBBRlMCS-5-phzM的基因工程菌PA01-/7Az#与出发菌株PAOl产绿脓素比较。铜绿假单胞菌PAOl原始菌和基因工程菌PA01-/7Az#在5 mL含有相应抗性的种子液中培养过夜，分别转接至100 1^三角瓶中，当006(|。=3.7时，加入1.34 mM IPTG诱导，10小时后，用HPLC测定绿脓素产量，HPLC图谱见图4。色谱柱:C18 ;流动相为A相(水:三氟乙酸==100:0.04，V/V)和D相(乙腈:三氟乙酸=100:0.04，V/V);洗脱方式为梯度洗脱，条件为 A 相 15min，91% A 相和 9% DlOmin, 73% A 相和 27% D 相 20min,67.6% A 相和 32.4%D相20min ;相流速Iml.mirT1 ;柱温为室温；检测波长为250nm,绿脓素出峰时间为30min左右。基因工程菌PA01-/7Az#和原始菌PAOl的绿脓素产量分别为43.36 μ g/mg湿菌体和15.88 μ g/mg 湿菌体。实施例4
本实施例说明构建成功的含有重组表达质粒pBBRlMCS-5-phzM的基因工程菌PA01-/7Az#与出发菌株PAOl产电能力比较。产电能力比较:转接过夜培养的产电工程菌PAOI和对照菌株PAOl于25mLLB液体培养基中，当0D6(i(i=3.7时，加入1.34 mM IPTG诱导，37° C继续诱导培养IOh时混匀于20 mL 50mM PBS缓冲液和5 mL 10g/L葡萄糖中，取24ml注入单室电池中观察输出电压，基因工程菌PAOl-phzM和原始菌PAOl的最高输出电压分别为340mV和17OmV，PAOl-MFC及PAOl-phzM-MFC启动期电压随时间的变化见图5。实施例5
本实施例说明构建的基因工程菌PAOl-phzM的应用。(I)菌种活化:将产电基因工程菌/ 仍接种到含有50 μ g/ml庆大霉素的LB平板上，培养过夜(24tT48h)，挑取平板上长出的单菌落到5ml LB培养基中，37°C，200rpm培养过夜(24tT48h)，其中LB培养基配方(IL):蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，若是固体培养基则再加2%琼脂粉；2)诱导培养:将活化的菌液按照体积比2%的接种量接入25mlLB培养基中，37°C，200rpm，有氧培养菌体OD600至3.7时加入1.34mM的IPTG诱导IOh ；
3)产电:将诱导培养后的菌液与PBS、葡萄糖混合成阳极液接入电池中，电池置于37°C培养箱中恒温培养，最高输出电压为350mV左右，其中阳极液的配比:菌液25ml，10 g/L葡萄糖 20ml, 50mmol PBS 缓冲液 5ml。实验证明，通过本发明的基因工程菌的构建方法，使其得到的重组铜绿假单胞菌可以产更高的电子传递体即绿脓素和更高的电量。利用铜绿假单胞菌表达甲基转移酶以提高产电子传递体-绿脓素的量，并最终提高其产电量还未见报道，此为微生物燃料电池提供了一种新颖和可行 的方法。
权利要求
1.一株产电基因工程菌菌株，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAOl-phzM,已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号:CCTCC NO:M 2013001。
2.权利要求1所述产电基因工程菌菌株的构建方法，其特征在于:以铜绿假单胞菌PAOl菌株为宿主菌，将甲基转移酶基因phzM插入pBBRlMCS-5载体的EcoRI和SpeI酶切位点之间，再将重组质粒导入表达宿主中，获得产电基因工程菌；具体步骤如下: 1)以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAOl基因组为模板，PCR扩增出phzM基因，连接到测序载体PMD19-T Simple载体，经测序与Genebank上公布的序列比对完全正确后，设计酶切位点EcoRI和SpeI，用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切phzM基因片段和pBBRlMCS-5载体后连接得到重组质粒pBBRlMCS-5-phzM ； 2)将构建好的重组质粒pBBRlMCS-5-phzM转化至DH5α感受态细胞，得到重组大肠杆菌 DH5 α -pBBRlMCS-5-phzM,选取阳性克隆； 3)将鉴定后的阳性克隆的质粒电击转化导入到铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAOl的感受态细胞中，经50 μ g/mL的庆大霉素筛选得到基因工程菌PAOl-phzMo
3.权利要求1所述产电基因工程菌菌株在微生物燃料电池中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括如下步骤: 1)菌种活化:将产电基因工程菌PAOl-phzM接种到含有50μ g/ml庆大霉素的LB平板上，培养过夜，挑取平板上长出的单菌落到5ml LB培养基中，37°C，200rpm培养过夜； 2)诱导培养:将活化的菌液按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，37°C，200rpm，有氧培养菌体OD600至3.7时加入1.34mM的IPTG继续诱导培养10h ； 3)产电:将诱导培养后的菌液与PBS、葡萄糖混合成阳极液接入电池中，其中阳极液的配比:菌液25ml,10 g/L葡萄糖20ml, 50mmol PBS缓冲液5ml。
全文摘要
一株产电基因工程菌菌株，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1-phzM，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NOM2013001。该菌株以铜绿假单胞菌PAO1菌株为宿主菌，将甲基转移酶基因phzM插入pBBR1MCS-5载体的EcoRI和SpeI酶切位点之间，再将重组质粒导入表达宿主Pseudomonas aeruginosa PAO1中获得。本发明采用基因工程手段将绿脓素合成途径中关键基因-甲基转移酶基因phzM在铜绿假单胞菌中进行重组表达，使重组铜绿假单胞菌能够多产绿脓素2.7倍，从而大幅提高产电能力，与原始菌株相比输出电压提高了2倍。
文档编号C12N1/21GK103184185SQ20131003301
公开日2013年7月3日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者陈怡露, 郑涛, 施冬艳, 许琳, 雍晓雨, 沈海波, 曹琳, 徐俊 申请人:南京工业大学