专利名称：一株解淀粉芽孢杆菌fqs38及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株生防菌及其应用，即解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38及其对番爺的促生作用和番爺两种重要细菌土传病害(青枯病和髓部坏死病)的防控作用。
背景技术：
设施番茄种植在我国农业及农村经济发展中的地位和作用越来越重要，已成为现代农业生产中的支柱产业和农民增收的重要途径。近年来，由单一品种重茬连作的种植模式引起的土传病害(枯萎病、青枯病、细菌性髓部坏死和根腐病等)连作障碍频繁暴发，严重威胁设施蔬菜生产的可持续发展。土传病害发生的主要原因是设施蔬菜连作导致病原菌菌量增加，根际土壤微生物种群结构被破坏、有益菌大幅度减少，导致土壤养分比例和数量严重失调。目前，生产上防治设施蔬菜土传病害主要依靠化学农药和传统农业方法(如水旱轮作，高温闷棚等)，然而，化学防治易增加蔬菜农产品有毒化学物质的残留，造成设施生态环境污染，对人类健康带来严重危害；传统农业方法虽有一定效果，但受到地利和种植模式的限制。为了平横蔬菜品质和产量之间的关系，达到有效控制土传病害的发生和传播、生态修复连作障碍、提高产量，保证果蔬品质的目的，绿色，环境兼容性好的生物防控技术越来越受到国内外科研人员的关注。Silveria等学者研究发现:生防细菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)和凝结芽抱杆菌(Bacilluscoagulans)等3种芽孢杆菌对番茄青枯病有很好的防效，同时还可以提高番茄种子的发芽率。马利平等经过8年系统试验研究从330个细菌菌株中筛选出I株蜡质芽孢杆菌98-1，可以有效防治番茄土传病害-枯萎病菌的发生及传播。国内外关于生物防治的研究，微生物防治植物病害的主要机理有:1)产生拮抗物质，直接抑制植物病原菌；2)与病原菌形成空间位点或营养竞争的微生态关系；3)诱导植株产生抗病性或抗虫性。生物防治可能是以上介绍的一种或几种机制 共同作用的结果，不同的生防菌株作用机制也不尽相同。近年来大量研究表明，土传病害的发生和植物根际微生物种群结构、密度密切相关。Peng等研究发现:根围细菌密度的增加可以抑制土壤中香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense的繁殖。吴凤芝等研究发现，提高土壤微生物群落的多样性可降低黄瓜角斑病、白粉病、霜霉病和枯萎病的病情指数和尖孢镰刀菌的数量，提高黄瓜产量。通过引入有益生防微生物，改善作物根际土壤微生物种群结构和数量已经成为防治土传病害的主要途径之
o番爺青枯病(病原菌为爺青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum)和髓部坏死病(病原菌为皱缩假单胞菌Pseudomonas corrugata)是设施番爺生产中的两种主要细菌土传病害。这两种细菌性病害多发于番茄第一序花开花期及坐果阶段，随着坐果及果实膨大，病情逐渐加重。青枯病病原菌侵染维管束，阻塞其输送营养物质，病茎纵切面维管束变褐；而髓部坏死病菌主要侵染番茄茎髓部，变褐色并分解，阻碍水分及营养的输送。细菌性病害引起相似的青枯病症给两种病害的诊断和防治带来了很大难题。已报道的青枯病生防菌剂主要有无致病力青枯菌和芽孢杆菌等，而髓部坏死病害相关生防菌剂报道甚少，且目前所报道的生防菌剂都是以单一病害为作用靶标，对两种病害不能兼顾，生产上经常发生用药不当，从而导致防效不佳。解决这个问题的途径之一就是:以番茄青枯病菌和髓部坏死病菌为靶标菌，筛选、鉴定对番茄有促生作用，且对两种病原菌皆具拮抗作用的生防菌剂，并进行田间应用。江苏省农科院植物保护研究所生物防治研究室从江苏省的连云港、徐州的仰徐村、丰县、南京六合及其郊区后村等地的番茄、辣椒和梨树等作物根际采集土壤40份，分离纯化获得302个不同菌落形态细菌分离物。筛选获得对番茄青枯病和髓部坏死病害有良好防效且促进番爺生长的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FQS38
发明内容
: 本发明的目的在于:针对设施番茄重茬连作引起的重要土传病害，尤其是细菌性土传病害(番茄青枯病和髓部坏死病)发生面积不断扩大，化学防治易造成环境污染，降低果品品质等情况，提出一种解淀粉芽孢杆菌菌株FQS38及其在对番茄的促生作用和两种细菌性土传病害防治上的应用。本发明的目的是这样实现的:一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株FQS38,其特征在于:FQS38菌株营养体为杆状,两端椭圆，周生鞭毛，无荚膜。芽孢中生。该菌在YPGA平板上培养时，菌落边缘波浪形，米白色，表面有皱褶。质地为不透明状，不产生色素。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) FQS38革兰氏反应阳性。H2O2酶反应阳性，V.P.反应阳性。D-葡萄糖利用为阳性。淀粉水解、明胶液化、柠檬酸钠利用、反应也均为阳性。最佳生长温度30-37°C，55°C以上不生长。该菌株16SrDNA序列比对与解淀粉芽孢杆菌同源性达99%，序列登陆NCBI网站，登陆号为:KC439673。所述YPGA培养基配方为:酵母膏5.0g,胰蛋白胨5.0g,葡萄糖5.0g,琼脂17.0g,水 1000ml, pH6.8-7.2。本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38组成,该菌株具有在番爺根部定殖扩展的能力和促进番爺生长的作用。本发明所述的生防菌剂，其次生代谢产物中包括蛋白水解酶、纤维素酶和嗜铁素等抗菌相关物质，同时也包括植物生长素(IAA)，赤霉素(GA3)等促进植物生长的激素。本发明所述生防菌剂是水剂，其配比成分主要是:解淀粉芽孢杆菌FQS38发酵液(菌含量为 I X 1010-2X 1010cfu/mL)，防腐剂 0.1% -0.5%, pH5.0-6.0。本发明所述的生防菌剂的用途是:防治设施番茄细菌性土传病害，将所述的生防菌剂稀释10倍后在番茄定植时灌入根部，随后按照水肥规律进行后续灌根用于防治番茄青枯病和髓部坏死病。本发明的优点在于:本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌FQS38对番茄细菌性土传病害具有良好防治效果，同时能够促进番茄的生长，无毒无致病性，对人畜安全、不污染环境，具有在田间番茄生产潜在的应用可能性。生防菌剂在番茄根围的使用能够影响周围环境微生物群落结构及种类，恶化病原菌生存环境，形成一个生物多样化的番茄生态系统，从而有效，持续地控制番茄细菌性土传病害的流行和传播。
:图1解淀粉芽孢杆菌FQS38产生相关抗菌物质(a，蛋白酶；b，纤维素酶；C，嗜铁素)图2解淀粉芽孢杆菌FQS38在番茄根部定殖作用(番茄根周围为FQS38定殖区)
具体实施方式
:实施例1解淀粉芽孢杆菌FQS38的分离、鉴定2011年9月，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株是在江苏省农业科学院六合基地设施番茄根围土壤中，通过梯度稀释法分离获得。具体方法是:采集好的根围土壤IOg,加入90mL 灭菌水三角瓶中，震荡培养30min(150rpm/min),制成1: 10 ( 土壤:水)悬浮液，然后去悬浮液lmL，置于9mL无菌水三角瓶中，以此类推，制成10_5，10_6稀释液；在其中各取330ul，涂布YPGA平板，每个处理重复3次。将上述平板置于28°C恒温培养2d，挑取单菌落转至YPGA平板划线纯化，纯化菌株于_70°C甘油保存。分离菌株在YPGA平板上培养时，菌落边缘波浪形，米白色，表面有皱褶，质地为不透明状，不产生色素。菌株营养体为杆状，两端椭圆，周生鞭毛，无荚膜。芽孢中生。革兰氏染色反应阳性，需氧生长，H202酶反应阳性，V.P.反应阳性，D-葡萄糖利用为阳性，淀粉水解、明胶液化、柠檬酸盐利用也均为阳性。最佳生长温度30-37°C，55°C以上不生长。该菌株16S rDNA序列比对与解淀粉芽孢杆菌同源性达99%，序列登陆NCBI网站，登陆号为:KC439673。该菌株我们命名为FQS38，分类地位为:解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。实施例2解淀粉芽孢杆菌FQS38对番茄青枯病菌和髓部坏死病菌的抑制作用。供试病原菌菌株:番爺青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番爺髓部坏死病菌(Pseudomonascorrugata)均由江苏省农科院植保所生防室分离保存。番茄青枯病菌用NA培养基(牛肉浸膏3.0g,酵母膏Ig,蛋白胨5g,葡萄糖IOg,琼脂20g,蒸懼水IOOOmL) 28。。振荡(150rpm/min)培养2d，备用。番茄髓部坏死病菌用KB培养基(蛋白胨20g，甘油10mL，磷酸氢二钾
1.5g，七水硫酸镁1.5g，水IOOOmL,固体培养基需加琼脂15g)培养2d，备用。将江苏省农业科学院筛选获得的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) FQS38在YPGA培养基上进行活化，然后移入50mL YPGA液体培养液中，在28°C下振荡(150rpm/min)培养2d，备用。吸取已制备好的青枯菌液和髓部坏死病菌涂布NA平板(0.1mL菌液/平板)，制成病菌平板，随后在平板中成十字架形放置4张灭菌滤纸片，滤纸片上加入不同量的解淀粉芽孢杆菌FQS38菌液；设清水对照。每处理重复3皿。28°C恒温培养2d，测量抑菌圈直径。试验结果见表I。表I解淀粉芽孢杆菌FQS38对番茄青枯病菌和髓部坏死病菌的抑制作用
权利要求
1.一种生防菌剂，其中有效活性成分由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38 组成。
2.根据权利要求1所述的生防菌剂，其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38可以分泌蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素、植物生长素IAA和赤霉素GA3等抗菌、促生相关物质。
3.根据权利要求1所述的生防菌剂，其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38可以有效在番爺根部定殖。
4.根据权利要求1-3所述的生防菌剂，其特征在于，它是水剂。
5.根据权利要求4所述的生防菌剂，其中水剂各组分的重量百分比为: 解淀粉芽孢杆菌FQS38发酵液中菌含量 IX IO10-2X1010 cfu/mL 防腐剂0.1%—0.5%水余量 pH5.0-6.0
6.一种权利要求1-5所述的生防菌剂的用途，其特征在于:将所述的生防菌剂稀释后灌入番茄根部用于防治土传病害。
7.根据权利要求6所述的生防菌剂的应用，其特征在于:所述的生防菌剂可以同时防治茄果类蔬菜两种重要土传病害(枯萎病和青枯病)。
8.根据权利要求6或7所述的生防菌剂的应用，其特征在于:生防菌剂使用时的有效菌含量为 106-108cfu/mL。
全文摘要
本发明涉及一种生防菌剂，其中有效活性成分由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FQS38组成。其特征在于该菌株具有在番茄根部定殖、促进番茄生长和防治土传病害的作用；同时，该生防菌剂能够分泌蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素、植物生长素和赤霉素等抗菌、促生物质。本发明所述生防菌剂是水剂，其配比成分主要是解淀粉芽孢杆菌FQS38发酵液(菌含量为1×1010-2×1010cfu/mL)，防腐剂0.1％-0.5％，pH5.0-6.0。将生防菌剂稀释后在番茄定植时灌入根部，用于防治番茄青枯病和髓部坏死病，随后按照水肥规律进行后续灌根。成品药剂稀释后的有效菌含量为106-108cfu/mL。其优点是FQS38对番茄细菌性土传病害具有良好防治效果，能够促进番茄的生长，无毒无致病性，对人畜安全、环境友好，具有在田间生产应用的可能性。
文档编号C12N1/20GK103087960SQ201310033269
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者乔俊卿, 刘邮洲, 梁雪杰, 聂亚锋, 陈志谊, 刘永锋 申请人:江苏省农业科学院