专利名称：一种分程胚胎培养液及其配制方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养领域，具体地说涉及一种提高体外受精卵生长发育效果的分程胚胎培养液及其配制方法。
背景技术：
自从世界上第一个“试管”婴孩于1978年7月25日在英国出生后，到2012年7月I日已有500万个“试管”婴孩诞生。IVF (体外受精)为全球超过占5000万不孕症夫妇带来了福音。然而，三十多年的临床实践并没有显著提高IVF的成功率。2011年，美国妊娠协会统计35岁病人IVF成功率(受孕率)在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而婴儿出生率更低。其中一个重要的原因是IVF胚胎培养液的质量。这是IVF胚胎质量最重要的决定性因素之一。IVF培养通常分为两种流程即两种培养液系列:全程(单培养液系列)和分程(双培养液系列)。利用双培养液系列流程对胚胎早期和后期阶段提供不同的培养液成份，但也丢失了由胚胎分泌入培养液中的重要的有效成份，如胚胎营养因子。全程培养液系列流程保留了这些重要的有效成份，但也保留了培养液中有害的分解产物
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供加入多种胚胎营养因子的分程胚胎培养液，本发明的另一个目的是提供上述分程胚胎培养液的配制方法。技术方案:为实现上述目的，本发明的一种分程胚胎培养液，包括基本培养液和胚胎营养因子，其中，所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和血清白蛋白；所述胚胎营养因子包括PAF、IGF-1和GM-CSF的任意一种或多种。对于本发明涉及的胚胎营养因子,PAF (Platelet-Activating Factor)是植入前期胚胎分泌的磷脂质，在应用中，主要作用在2-细胞期胚胎。PAF可诱导2-细胞胚胎中转录 CREB (cAMP-Response element binding protein, cAMP 反应兀件结合蛋白)的憐酸化，并进一步诱导2-细胞胚胎表达有利于胚胎细胞生存的转录因子和CREB-靶向的转录因子。另一方面，PAF激活MDM2，促使其与细胞核的P53结合成复合物，在细胞浆内将P53降价，从而抑制胚胎细胞的凋零。IGF-1 是 IGF (Insulin-like Growth Factors)膜岛素样生长因子中的一种，又被称作“促生长因子”，是一种植入前期胚胎分泌的活性蛋白多肽物质。GM-CSF(Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor,粒细胞-巨卩遼细胞集落刺激因子)，可由卵巢，输卵管，子宫内膜的上皮细胞产生，人类卵子和植入前期胚胎存在GM-CSF受体。起到抑制胚胎细胞凋零，提高胚胎发育的作用。以上胚胎营养因子在培养液中，可促使受精卵生长发育，生成的囊胚期胚胎具有更高的胚胎干细胞多能性，胚胎干细胞生物学指标UTFl和NANOG的表达量比在无胚胎营养因子的胚胎培养液所生成的囊胚期胚胎明显增高。本发明采用的是分程培养液，即双程培养液，包括卵裂液培养液和囊胚液培养液。所述卵裂液和囊胚液的无机盐缓冲液都包括如下组分:氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠和EDTA 二钠。具体地说，无机盐缓冲液中所述氯化钾与氯化钠的摩尔比为1.8^2.2:100 ；所述磷酸二氢钾与氯化钠的摩尔比为0.3^0.4:100 ;所述氯化钙与氯化钠的摩尔比为
1.6^1.8:100 ;所述硫酸镁与氯化钠的摩尔比为0.18^0.22:100 ;所述碳酸氢钠与氯化钠的摩尔比为20 30:100 ;所述EDTA 二钠与氯化钠的摩尔比为0.01:100。作为本发明的最优方案，无机盐缓冲液中氯化钾与氯化钠摩尔比为2:100;磷酸二氢钾与氯化钠摩尔比为0.35:100，氯化钙与氯化钠摩尔比1.71:100，硫酸镁与氯化钠摩尔比为0.2:100，碳酸氢钠与氯化钠摩尔比为25:100，EDTA 二钠与氯化钠摩尔比为
0.01:100。从而使缓冲液维持在PH7.3^7.5之间，有利于体外胚胎的生长发育。其中，对于卵裂液培养液，所述胚胎营养因子由PAF、IGF-1和GM-CSF组成，用于配制受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液培养液。进一步的，对于卵裂液培养液，所述PAF浓度为20ng/毫升，所述IGF-1浓度为2ng/毫升；所述GM-CSF浓度为2ng/毫升。所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为10.5:100 ;所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.32:100 ;所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为0.5:100。每
毫升基本培养液含有3mg血清白蛋白。对于囊胚液培 养液，所述胚胎营养因子由IGF-1和GM-CSF组成，用于配制体外受精卵从8-细胞期至植入前的囊胚液培养液。具体地说，所述IGF-1浓度为5ng/毫升；所述GM-CSF浓度为4ng/毫升。进一步的，所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为5.87:100 ;所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.1:100 ；所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为3.15:100。每毫升基本培养液含有4mg血清白蛋白。对于本发明分程胚胎培养液的配制方法，先配制基本培养液，将PAF预先存放在有机溶剂中，配制时吸取PAF于清洁的硅化玻璃管中，注入氮气将有机溶剂挥发，加入含有血清白蛋白的基本培养液，涡旋混合，避免气泡产生，于25°C水箱水浴孵化I小时使PAF与血清蛋白充分结合，再加入含有血清白蛋白的基本培养液配制到浓度为20ng/毫升；将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度2ng/毫升和2ng/毫升。获得卵裂液培养液。配制基本培养液，将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度5ng/毫升和4ng/毫升。获得囊胚液培养液。本发明中所述氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸，对于用于人类体外受精的合子而言，所述氨基酸包括所有胚胎所需的必需氨基酸和非必需氨基酸。有益效果:本发明的一种胚胎培养液及其配制方法通过加入多种胚胎营养因子避免了分程培养液流程丢失胚胎自身分泌的胚胎营养因子的缺点，同时，三种胚胎营养因子具有协同增效效果。受精卵在含胚胎营养因子的培养液中所生成的囊胚胚胎具有更高的胚胎干细胞多能性，表现为其中更多的细胞表达胚胎干细胞生物学指标UTFl和NANOG ;并且与体内发育成的囊胚期胚胎无统计学上的差别。本发明的胚胎培养液可显著提高受精卵体外生长发育，改善胚胎的质量，为提高助孕技术的成功率提供了重要的手段。
图1表示受精卵在三种体外培养液下84小时后囊胚期胚胎的百分率及每个胚胎的细胞数；图2为受精卵培养后每24小时胚胎与体内同期胚胎所含的细胞总数的比较图；图3表示为本发明的免疫荧光技术分析加入胚胎营养因子的培养液所生长成的囊胚期胚胎含有与体内生长成的囊胚期胚胎相当数量的总细胞数和表达胚胎干细胞生物标记(UTFl)的细胞数；图4所示为本发明的Western blot和免疫荧光技术分析加入胚胎营养因子的培养液所生长成的囊胚期胚胎含有更多数量的总细胞数和表达胚胎干细胞生物标记(NANOG)的细胞数。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作更进一步的说明。实施例1—种分程胚胎培养液，由卵裂液和囊胚液组成，卵裂液用于受精卵生长至8-细胞期的时期内，囊胚液用于受精卵从8-细胞期生长至受精卵植入前时期内。卵裂液和囊胚液都由基本培养液和胚胎营养因子组成，且基本培养液中的无机盐缓冲液组分相同。无机盐缓冲液的配方如表I所示，其pH在7.3 7.5之间:表I卵裂液和囊胚液的配方
权利要求
1.一种分程胚胎培养液,包括基本培养液和胚胎营养因子,其特征在于: 所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和血清白蛋白； 所述胚胎营养因子包括PAF、IGF-1和GM-CSF的任意一种或多种。
2.根据权利要求1中任意一项所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于:所述无机盐缓冲液包括氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠和EDTA 二钠。
3.根据权利要求2所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于: 所述氯化钾与氯化钠的摩尔比为1.8^2.2:100 ； 所述磷酸二氢钾与氯化钠的摩尔比为0.3^0.4:100 ； 所述氯化钙与氯化钠的摩尔比为1.6^1.8:100 ； 所述硫酸镁与氯化钠的摩尔比为0.18^0.22:100 ； 所述碳酸氢钠与氯化钠的摩尔比为2(Γ30:100 ； 所述EDTA 二钠与氯化钠的摩尔比为0.01:100。
4.根据权利要求Γ3中任意一项所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于:所述胚胎营养因子由PAF、IGF-1和GM-CSF组成，用于配制受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液培养液。
5.根据权利要求Γ3中任意一项所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于:所述胚胎营养因子由IGF-1和GM-CSF组成，用于配制体外受精卵从8-细胞期至植入前的囊胚液培养液。
6.根据权利要求4所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于:所述PAF浓度为20ng/毫升，所述IGF-1浓度为2ng/毫升；所述GM-CSF浓度为2ng/毫升。
7.根据权利要求4所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于: 所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为10.5:100 ； 所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.32:100 ； 所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为0.5:100。
8.根据权利要求4所述的一种分程胚胎培养液,其特征在于:每毫升基本培养液含有3mg血清白蛋白。
9.根据权利要求5所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于:所述IGF-1浓度为5ng/毫升；所述GM-CSF浓度为4ng/毫升。
10.根据权利要求5所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于: 所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为5.87:100 ； 所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.1:100； 所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为3.15:100。
11.根据权利要求5所述的一种分程胚胎培养液,其特征在于:每毫升基本培养液含有4mg血清白蛋白。
12.如权利要求4所述的分程胚胎培养液的配制方法，其特征在于:先配制基本培养液，将PAF预先存放在有机溶剂中，配制时吸取PAF于清洁的硅化玻璃管中，注入氮气将有机溶剂挥发，加入含有血清白蛋白的基本培养液，涡旋混合，避免气泡产生，于25°C水箱水浴孵化I小时使PAF与血清蛋白充分结合，再加入含有血清白蛋白的基本培养液配制到浓度为20ng/毫升；将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度2ng/毫升和2ng/毫升。
13.如权利要求5所述的分程胚胎培养液的配制方法，其特征在于:配制基本培养液，将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度5 ng/晕 升和4ng/晕升。
全文摘要
本发明公开了一种分程胚胎培养液及其配制方法属于细胞学、生物技术领域，采用添加三种胚胎营养因子的分程培养液，包括卵裂液和囊胚液两种，在体外受精卵和在8-细胞期前后分别使用。本发明的胚胎培养液加入的胚胎营养因子具有协同增效作用，避免了分程培养液丢失胚胎自身分泌的胚胎营养因子的缺陷，受精卵在本发明的培养液中生长具有更高的胚胎干细胞多能性，其发育情况与体内胚胎生长相当，提高了受精卵体外生长发育，改善了胚胎的质量。
文档编号C12N5/073GK103173403SQ201310041700
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者金星亮, 白丽君 申请人:金星亮