专利名称：一种三液相脂肪酶催化体系水解脂类生产脂肪酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程与食品技术领域，涉及到酶的分离与应用技术，特别涉及到从粗酶液中分离脂肪酶以及脂肪酶水解脂类生产脂肪酸的方法。
背景技术：
作为油脂化工领域最重要的基础原料，脂肪酸广泛应用于肥皂、表面活性剂、食品和医药等领域。目前，脂肪酸的年产量超过350万吨，其主要的工业生产途径是通过油脂水解产生的。前者需要高温高压，能耗大，副产物多，而且不适用于含有羟基脂肪酸、多不饱和脂肪酸酸、热敏性脂肪酸等油脂的水解；而碱水解不但能耗大，而且需要消耗大量的酸、碱及水资源。另外，前两种方法均会副产大量低浓度甘油20%)，需要大量的能耗和额外的设备投资加以回收。酶水解不但具有条件温和、能耗低、副产物少等优点，而且能够选择性水解不同结构和位置的脂肪酸，因而受到了广泛的重视。最近几十年，科学家在脂肪酶水解油酯产脂肪酸作了一系列的尝试，例如，Rafael等用固定化脂肪酶的方法从大豆油中水解生产脂肪酸，但是，该工艺需要两种固定化酶的协同才能有效，并且酶用量 大，需利用正己烷洗涤的方式才能恢复酶的水解效果，导致了其成本巨大，工业应用困难等难题(Process Biochemistry, 2011,46:682 - 688XRathod等研究了不同添加剂对脂肪酶水解植物油的影响，结果发现没有合适的添加剂能够促进脂肪酶的水解反应，并且经过四次反应后，酶活降低了 80%。(Biochemical Engineering Journal,2009,47:93 - 99)。总体而言，脂肪酶过高的价格，连续化生产困难，产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等问题制约了该方法的大规模应用。
发明内容
本发明的目的是针对目前酶法水解脂类生产脂肪酸过程中，存在的脂肪酶分离成本高，连续化生产困难，产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等问题，提供了一种从粗酶液中分离脂肪酶以及脂肪酶水解脂类生产脂肪酸的方法。本发明的目的通过以下技术方案实现:一种三液相脂肪酶催化体系水解脂类生产脂肪酸的方法，包含以下步骤:(I)配置脂肪酶浓度为5_20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性无机盐、醇类或酮类亲水性有机物和脂类，配成三液相体系；所述无机盐、亲水性有机物和脂类与酶液的质量比分别为 0.1-1,0.08-1 和 0.05-5 ；(2)将配置好的三液相体系置于搅拌釜中反应，反应结束后，静置或离心至分为上中下三层，收集上层产物即为脂肪酸相，中层为富酶相，下层为富甘油相。上层的脂肪酸相，经过加热或吸附除水后，即可作为产品采出；中层的富酶相，可直接作为下次反应应用，也可经超滤或吸附的方法得到纯酶产品；下层的富甘油相，经溶剂析出或降温结晶等方式除盐后，可得甘油水溶液。优选地，步骤(2)所述反应搅拌转速30_500rpm，所述反应温度为5_80°C，所述反应时间为0.5-120h。优选地，步骤(2)所述反应搅拌转速50-300rpm，所述反应温度为20_80°C，所述反应时间为l_48h。优选地，所述可溶性无机盐是氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。优选地，所述亲水性有机物为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇或丙酮。为了使脂类水解效果尽可能达到最佳，脂肪酸尽可能分配至上相，脂肪酶尽可能保留至中间相，甘油尽可能保留在下相，可以调节体系的PH值。优选地，所述三液相溶液的PH值为3-13。更优选地，所述三液相溶液的pH值为6-8。优选地，所述步骤(I)和(2)的操作在低于亲水性有机物易挥发的温度下进行。优选地，所述脂肪酶浓度为50-2000U/mL。优选地，所述无机盐、亲水性有机物和脂类与酶液质量比分别为0.2-0.8,0.2-0.8和 0.2_4。上述脂肪酶催化反应中，脂肪酶可以来自天然，也可以通过人工发酵产生；可以是发酵液，可以是经简单纯化后的粗酶，也可是经纯化后纯酶。本发明相对于现有技术具有如下有益效果:(I)本发明利用三液相体系萃取粗酶液中的脂肪酶直接水解生产脂肪酸，既可大幅降低酶的生产成本； 又可解决甘油和酶分离能耗大、成本高、污染大等问题。(2)本发明工艺得以简化，分离时间短，成本降低，经济可行。具体表现在:利用三液相体系可将脂肪酸分配在上相，脂肪酶分配在中相，甘油富集在下相的特性，既有利于酶的纯化与回收，也有利于解除产物的抑制，提高催化效率，从而大幅降低酶的损耗与纯化成本。该方法具有能耗小、原料利用率高、反应条件温和等优点，解决了现有酶水解法生产脂肪酸难于工业化的技术难题。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本实施例中本实施例中所用脂肪酶中，TL-100L、PL20000L购于Novozyme公司，AY-30购于Amano公司，Tl脂肪酶系通过实验室克隆来源于Malassezia globosa中的一段基因序列(GenBank accession number AY260764),并在毕赤酵母X33中的表达,经摇瓶发酵、离心、超滤等步骤得到。实施例1取适量脂肪酶AY30置于锥形瓶中，加入10倍体积的水，混匀后，取1.2g粗酶液(410U/ml)，加入0.4g的硫酸铵，混匀后加入0.4g聚乙二醇400和0.4g橄榄油，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在37°C下反应24h。另取1.2g粗酶液，加入0.4g橄榄油，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，静置0.5h，实验组分为三相，对照组分为两相，分别取上相测其脂肪酸含量，取三液相中相测量其酶活，取中，下相测量其甘油分配情况，可得橄榄油水解率可达96.6%，比对照组提高了 129%，脂肪酶主要分配于中相，分配系数可达4.72，甘油主要分配于下相，脂肪酶与甘油的选择性系数可达7.58。实施例2取适量脂肪酶TL100L置于锥形瓶中，加入10倍体积的水，混匀后，取1.2g粗酶液(1300U/ml)，加入0.4g的硫酸铵，混匀后加入0.4g聚乙二醇600和0.4g橄榄油，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在37°C下反应36h。另取1.2g粗酶液和0.4g橄榄油，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，静置0.5h，实验组分为三相，对照组分为两相，分别取上相测其脂肪酸含量，取三液相中相测量其酶活，取中，下相测量其甘油分配情况，可得橄榄油水解率可达86.6%，比对照组提高了 76.4%，脂肪酶主要分配于中相，分配系数可达7.89，甘油主要分配于下相，脂肪酶与甘油的选择性系数可达12.08。实施例3取适量脂肪酶PL20000L置于锥形瓶中，加入10倍体积的水，混匀后，取1.2g粗酶液(920U/ml)，加入0.4g的硫酸铵，混匀后加入0.4g聚乙二醇2000和0.4g橄榄油，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在37°C下反应36h。另取
1.2g粗酶液和0.4g橄榄油，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，静置0.5h，实验组分为三相，对照组分为两相，分别取上相测其脂肪酸含量，取三液相中相测量其酶活，取中，下相测量其甘油分配情况，可得橄榄油水解率可达89.6%，比对照组提高了 89%，脂肪酶主要分配于中相，分配系数可达7.39，甘油主要分配于下相，脂肪酶与甘油的选择性系数可达11.87。实施例4取适量脂肪酶Tl 置于锥形瓶中，加入10倍体积的水，混匀后，取1.3g粗酶液(180U/ml)，加入0.3g的硫酸钠，混匀后加入0.4g聚乙二醇400和0.4g橄榄油，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在37°C下反应36h。另取1.3g粗酶液和0.4g橄榄油，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，静置0.5h，实验组分为三相，对照组分为两相，分别取上相测其脂肪酸含量，取三液相中相测量其酶活，取中，下相测量其甘油分配情况，可得橄榄油水解率可达26.0%，比对照组提高了 130%，脂肪酶主要分配于中相，分配系数可达3.48，甘油主要分配于下相，脂肪酶与甘油的选择性系数可达4.51。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种三液相脂肪酶催化体系水解脂类生产脂肪酸的方法，其特征在于，包含以下步骤: (1)配置脂肪酶浓度为5-20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性无机盐、醇类或酮类亲水性有机物和脂类，配成三液相体系；所述无机盐、亲水性有机物和脂类与酶液的质量比分别为 0.1-1,0.08-1 和 0.05-5 ； (2)将配置好的三液相体系置于搅拌釜中反应，反应结束后，静置或离心至分为上中下三层，收集上层产物即为脂肪酸相。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述反应搅拌转速30-500rpm，所述反应温度为5-80°C，所述反应时间为0.5-120h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述反应搅拌转速50-300rpm，所述反应温度为20-80°C，所述反应时间为l_48h。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述可溶性无机盐是氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述亲水性有机物为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇或丙酮。
6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶来自天然或者通过人工发酵产生；或是发酵液，或是经简单纯化后的粗酶，或是经纯化后纯酶。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述三液相溶液的pH值为3-13。
8.根据权利要 求7所述的方法，其特征在于，所述三液相溶液的pH值为6-8。
9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述脂肪酶浓度为50-2000U/mL。
10.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述无机盐、亲水性有机物和脂类与酶液质量比分别为0.2-0.8,0.2-0.8和0.2-4。
全文摘要
本发明公开了一种三液相脂肪酶催化体系水解脂类生产脂肪酸的方法，包含以下步骤(1)配置脂肪酶浓度为5-20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性无机盐、醇类或酮类亲水性有机物和脂类，配成三液相体系；(2)将配置好的三液相体系置于搅拌釜中反应，反应结束后，静置或离心至分为上中下三层，收集上层产物即为脂肪酸相。本发明利用三液相体系萃取粗酶液中的脂肪酶直接水解生产脂肪酸，既可大幅降低酶的生产成本；又可解决甘油和酶分离能耗大、成本高、污染大等问题。
文档编号C12P7/64GK103184245SQ20131006727
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者王永华, 李志刚, 杨博, 王卫飞 申请人:华南理工大学