一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，属真菌分子生物检测【技术领域】，其特征在于包括如下步骤：（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条；（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。本发明的检测方法能快速鉴定出烟曲霉菌，具有快速、准确、高效的优点。
【专利说明】
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，属真菌分子生物检测【技术领域】。 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法
【背景技术】：
[0002] 真菌存在于几乎所有的陆地和水生生态系统中，与人类生产活动和生活关系密 切。许多真菌具有重要的经济意义，但也有些种类的真菌会引起植物、动物和人类的病害或 产生毒素，会危害人类的健康。
[0003] 烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus)是自然界中广泛存在的腐生真菌，也是重要 的机会致病菌。随着免疫受损人群的增多，系统性曲霉病的90%是由烟曲霉菌引起的。同 时，烟曲霉菌产生的毒素严重污染粮食与饲料制品，危害人和动物的健康，造成重大的经济 损失，烟曲霉菌已成为临床医学和医学微生物家们关注的热点。
[0004] 烟曲霉菌的检测技术经历了传统培养鉴别、层析法及色谱法等化学方法检测、免 疫学检测、分子生物学检测等。
[0005] 近年来，随着高效基因扩增平台、引物设计方案以及定量扩增技术的发展和应用， 包括真菌在内的微生物快速检测与鉴定对于病害诊断、监测和防治具有重要意义。
【发明内容】
：
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速鉴定烟曲霉菌的检测 方法，具有快速、准确、高效的特点。
[0007] 本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。
[0008] 本发明提供的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，包括如下步骤：
[0009] (1)提取待测烟曲霉囷株的总DNA ; _〇] (2)选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条，分别为：
[0011] 1)引物名称 F2255,引物序列 CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG ;
[0012] 2)引物名称 R3044,引物序列 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT ;
[0013] 3)引物名称 R3438,引物序列 CTGCCGGGTCAGAATCTGT ;
[0014] (3)待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；
[0015] (4)琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
[0016] 本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
[0017] 本发明基于已公布的曲霉属真菌烟曲霉、棒曲霉、费氏曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑 曲霉、米曲霉和土曲霉等的基因组序列，通过基因组同源性分析，选择RPB2基因作为研究 对象，根据RPB2基因存在的12个保守区域的序列比对结果和变异位点，筛选出可用于烟曲 霉快速鉴定的特异性引物。通过设计3条引物，对待测烟曲霉菌株的目的基因片段进行PCR 扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测方法判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
【具体实施方式】：
[0018] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
[0019] 1、待测曲霉菌株的培养
[0020] 待测曲霉菌样品来源于中国科学院微生物研究所、北京大学真菌和真菌病研究中 心、吉林大学真菌研究中心，接种至PDA培养基上，置培养箱28°C培养。
[0021] 2、待测曲霉菌株的DNA提取
[0022] 挑取直径5mm的曲霉菌株菌丝块接种至100ml 液体培养基中，室温下摇床培养 (250rpm) 2-4周，收集菌体并用无菌生理盐水冲洗数次，灭菌滤纸吸干。取0. lg菌体在液 氮中迅速研磨成粉末，用2%(w/v) CTAB缓冲液抽提DNA，0. 8%琼脂糖凝胶检测DNA样品。
[0023] 3、目的片段PCR扩增
[0024] PCR反应在ABI2720PCR仪（美国加州ABI公司）上进行，25 μ 1反应体系包 括：超纯水 17.5yl，10Xbuffer2.5yl，引物（ΙΟμΜ)各 Ιμ?，TaqDNA 聚合酶（1.25U/ μ 1)0. 5μ 1，dNTP(2. 5πιΜ)1μ 1，模板 DNAly 1。
[0025] PCR反应条件为：94° C预变性4min;94° C变性30s，66° C(或64° C)退火 30s，72° C 延伸 45s，30 个循环；72° C 延伸 7min。
[0026] 引物列表： 引物名称引物序列(5' -3'） F2255 CCMCAAGCGTGTTCGTTCAG
[0027] R3044 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT R3438 CTGCCGGGTCAGAATCTGT
[0028] 4、琼脂糖凝胶电泳检测
[0029] 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，引物F2255-R3044和F2255-R3438的扩增产 物分别约800bp和1200bp。
[0030] 5、序列测定验证
[0031] 目的片段PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司，ABI3730XL测序仪双 向测序。
[0032] 弓丨物F2255/R3044扩增烟曲霉得到的序列为790bp :
[0033] CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC
[0034] CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA
[0035] ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA
[0036] TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT
[0037] TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT
[0038] ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT
[0039] TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC
[0040] CCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA
[0041] TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG
【权利要求】
1. 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 提取待测烟曲霉囷株的总DNA ; (2) 选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条； (3) 待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增； (4) 琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
2. 根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于设计特异性 引物3条，分别为： 1) 引物名称 F2255,引物序列 CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG ; 2) 引物名称 R3044,引物序列 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT ; 3) 引物名称 R3438,引物序列 CTGCCGGGTCAGAATCTGT。
【文档编号】C12Q1/04GK104046681SQ201310078921
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】余知和, 曾昭清, 周建芬, 程云方 申请人:长江大学