专利名称：一种齐整小核菌固体发酵培养基及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种齐整小核菌固体发酵培养基，具体涉及一种采用农业废弃物与麸皮作为原料的齐整小核菌固体发酵培养基及其应用。
背景技术：
化学除草剂的不断应用暴露出不少弊端，开发利用微生物尤其是植物病原真菌用于杂草防治，是有效、安全环保且可持续发展的杂草管理方法。开展杂草病原菌的调查、分离并将其用于生物防治是世界杂草研究中的一个热点。由于核盘菌属(Sclerotiniaspp.)的核盘菌(S.sclerotiorum)能引起植物快速发病，同时杀死多种阔叶杂草，已被筛选用于开发作为生物除草剂，用于草坪防治西洋蒲公英(Taraxacum officinale)、蓟(Cirsium arvense)等杂草(BourdSt et al., 1995;2006;Brosten and Sands, 1986;Quimbyet al., 2004)o该属的小核盘菌(S.minor),由于其对禾本科植物安全,可以起多种菊科杂草病害，也已被开发作为生·物除草剂(Abu-Dieyeh et al., 2005; 2006; 2007; Schnick etal.，2002)。齐整小核菌属(Sclerotium spp.)在生物学和生态学特性上与核盘菌属极其类似(Pandey et al.，1996),现在已被作为生物除草剂开发利用。核盘菌和齐整小核菌生物除草剂一般直接利用菌丝体作为应用的材料，为固体剂型，即以固体发酵得到的含有菌丝体的固体基质直接撒施于田间。在国外，生产齐整小核菌常用的固体基质包括大麦粒(Abu-Dieyeh et al., 2005; 2006; 2007; Schnick et al.，2002)、小麦粒(Brosten andSands, 1986; Shukla and Pandey, 2008)、奎奴亚藜和向日葵杆(Quimby et al.，2004)、松木屑(Harvey et al.，1994)等。上述固体基质经接菌培养后,在应用前通常需要晾干。但是，这些原料价格均较高，大批量生产成本较大，对于发展中国家来说，比较难以接受。农业废弃物(agricultural waste)通常指农业生产中植物的莖、杆、皮壳等，它们以及制糖、酒的废料如甘蔗渣、酒糟等用于微生物发酵原料生产和提取代谢产物已有广泛研究(de Vrije et al., 2001; Onuoha et al., 2009; Shabana et al., 2010; Souza etal.，2001)。中国每年产生了大量的农业废弃物，包括(X 104t):稻草21129.26、玉米秸杆2020.93、小麦秸杆10718.95及制糖废料甘蔗渣2079.31，其中绝大部分被焚烧或丢弃(毕于运等，2009)。焚烧农业废弃物造成环境污染，排放温室气体CO2和浪费大量有机质(Croan，2000)。因此，如何利用和处理农业废弃物是值得考虑和研究的课题。此前，利用麸皮作为基质虽然能获得较高的发酵效果，但麸皮相对价格较高，因此，需要寻找成本较低的、发酵效果好的替代培养基。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种生产成本低、且能有效利用农业废弃物，减少环境污染的齐整小核菌固体发酵培养基及应用其生产含有菌丝体的固体培养基作为生物除草剂的方法。为了达到上述目的，本发明提供了一种齐整小核菌固体发酵培养基，包括固体基质和水；固体基质包括麸皮和农业废弃物，麸皮占固体基质总重的20%-60%，水和固体基质的重量比为20-45:100 ;农业废弃物选用水稻秸杆、玉米秸杆、油菜秸杆、棉花秸杆、加拿大一枝黄花秸杆、稻壳、假高粱秸杆、有机肥、麦稃基质、醋糟、酒糟、园林枯木或锯木屑。其中，水稻秸杆、玉米秸杆、油菜秸杆、棉花秸杆、加拿大一枝黄花秸杆、假高粱秸杆、园林枯木采用干燥粉碎颗粒。农业废弃物优选干燥粉碎后的玉米秸杆、油菜秸杆、棉花秸杆或加拿大一枝黄花秸杆；麸皮占固体基质总重的30%。农业废弃物还可选用稻壳，麸皮占固体基质总重量的40%_60%，优选50%_60%。其中水与固体基质的重量比为25-40:100，优选30:100。本发明还提供了上述齐整小核菌固体发酵培养基在生产生物除草剂方面的应用，该生物除草剂采用齐整小核菌菌株SC64以液体-固体联合发酵方式进行大批量生产，其中固体发酵采用上述齐整小核菌固体发酵培养基。制备得到的生物除草剂为含有菌丝体的固体培养基，用于田间除草时，菌体基质在土壤含水量25%、pH值为5、25°C条件下具有最大的萌发生长半径，最适宜土内最大菌丝生长半径为土壤含水量20%、pH值为7、30°C条件下。对杂草的处理剂量为60-120g/m2。存储时常温保存，最佳保存的初始湿度为40%。本发明相比现有技术具有以下优点:利用农业废弃物和麸皮复配作为固体基质制备固体发酵培养基，既能有效培养含有齐整小核菌菌丝体生物除草剂，又能废物利用，减少污染，降低成本。采用复配方式得到的农作物下脚料和麸皮的混合物，在进一步降低成本的同时，达到了最佳发酵效果。本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基能产生较大密度的菌丝、草酸含量和较高的离体叶片的致病性。利用本发明固体发酵培养基制备的含菌丝体的生物除草剂能不仅有效用于双子叶杂 草的清除，还对单子叶杂草马唐幼苗具有致病性。本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基成本低、制备工艺简单，且采用该固体发酵培养基制备得到的除草剂可在常温下保存。
图1为生物除草剂的生产流程图；图2为不同土壤环境对生物除草剂菌丝体萌发影响；图3为储藏温度对生物除草剂的活力和致病力的影响；图4为储藏初始湿度对生物除草剂的活力和致病力的影响；图2至图4中的误差线为标准误。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。固体基质准备:取农田或荒地收货的玉米秸杆、水稻秸杆、油菜秸杆、棉花秸杆、大豆秸杆、加拿大一枝黄花秸杆、假高粱秸杆，于田埂经自然晒干后，经秸杆粉碎机进行粉碎后备用。园林枯枝粉碎后备用。麸皮、棉籽壳、稻壳、有机肥、麦稃基质、醋糟、酒糟、锯木屑晾晒后直接使用。对比实施例1 (单体基质实施例)
固体发酵培养基制备:分别取上述各固体基质，用纱布包好浸溃于去离子水中24h，试验时取出滤去多余水分，每300g培养基装入塑料袋系好，常规高压灭菌60min后冷却即得所需固体发酵培养基。生物除草剂制备:如图1所示，采用液体-固体联合发酵的大批量生产方式，即先以液体发酵培养菌丝体，后在固体基质或培养基上固定发酵培养，生产含菌丝体固体基质，基质在晾干过程中可能会产生菌核。其中，液体培养基为马铃薯液体培养基(200g新鲜去皮土豆丁煮汁，蔗糖20g,加蒸馏水至1L)，配置好后将其pH值调至5.0，每IL三角瓶装600ml培养基，常规高压蒸汽灭菌25min，接种活化的齐整小核菌菌株SC64菌饼10枚，30°C下，IIOrpm培养5d，接种前充分混匀。固体培养基分别采用上述制备的固体发酵培养基，每袋培养基接入新鲜培养的液体菌种30mL，充分混匀，置于培养架上25 30°C培养待菌丝体长满基质，即得到含菌丝体的生物除草剂。对比发酵效果实施例1 (单体基质实施例)
将对比实施例1中制备得到的含菌丝体的不同固体培养基进行检测。其中草酸含量检测参照(n O MHHO K，1981)的方法进行，致病力检测以30°C条件下，直径为5mm的除草剂颗粒在熟龄紫茎泽兰叶片(从顶部往下5 6片真叶)中央培养72小时后所引起的坏死病斑面积为指标。即将新鲜培养的含菌丝体固体基质置于预先铺有湿润双层滤纸的9cm培养皿中的紫莖泽兰叶片中央,每平皿2片叶子，ParafiIm(American NationalCan, Greenwich, CT, USA)进行密封，将培养皿置于30°C，12h L/D的光照培养箱。每试验处理均4次重复，设置灭菌的固体基质为空白对照。结果如表I所示。表I含有菌丝体的不同固体基质对齐整小核菌菌株SC64发酵草酸产量及致病力的影响
权利要求
1.一种齐整小核菌固体发酵培养基，其特征在于:所述固体发酵培养基包括固体基质和水；所述固体基质包括麸皮和农业废弃物，所述麸皮占固体基质总重的20%-60%，所述水和固体基质的重量比为20-45:100 ;所述农业废弃物选用水稻秸杆、玉米秸杆、油菜秸杆、棉花秸杆、加拿大一枝黄花秸杆、稻壳、假高粱秸杆、有机肥、麦稃基质、醋糟、酒糟、园林枯枝或锯木屑。
2.根据权利要求1所述的齐整小核菌固体发酵培养基，其特征在于:所述水稻秸杆、玉米秸杆、油菜秸杆、棉花秸杆、加拿大一枝黄花秸杆、假高粱秸杆、园林枯枝采用干燥粉碎颗粒。
3.根据权利要求1所述的齐整小核菌固体发酵培养基，其特征在于:所述农业废弃物选用干燥粉碎后的玉米秸杆、油菜秸杆、棉花秸杆或加拿大一枝黄花秸杆；所述麸皮与农业废弃物的重量比为30:70。
4.根据权利要求1所述的齐整小核菌固体发酵培养基，其特征在于:所述农业废弃物为稻壳；所述麸皮占固体基质总重量的40%-60%。
5.根据权利要求4所述的齐整小核菌固体发酵培养基，其特征在于:所述麸皮占固体基质总重量的50%-60% ;所述水与固体基质的重量比为25-40:100。
6.权利要求1至5任一所述的齐整小核菌固体发酵培养基在生产生物除草剂方面的应用，其特征在于:所述生物除草剂采用齐整小核菌菌株SC64以液体-固体联合发酵方式进行大批量生产；所述固体发酵采用所述齐整小核菌固体发酵培养基。
全文摘要
本发明公开了一种齐整小核菌固体发酵培养基及其应用，该固体发酵培养基包括包括固体基质和水；固体基质包括麸皮和农业废弃物，麸皮占固体基质总重的20%-60%，水和固体基质的重量比为20-45:100；农业废弃物选用、稻壳、假高粱秸秆、有机肥、麦稃基质、醋糟、酒糟、园林枯枝或锯木屑。本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基成本低、制备工艺简单，且采用该固体发酵培养基制备得到的除草剂可在常温下保存。
文档编号C12R1/645GK103146588SQ20131009579
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者强胜, 唐伟, 庄超 申请人:南京农业大学