专利名称：一种异常威克汉姆酵母菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)菌种HJY-006及其在白酒生产中的应用。
背景技术：
中国白酒香味物质种类繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、缩醛、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、醚类、内酯类等化合物达数百种之多(庄名扬，酿酒，2007.34(2): 109 一113)。中国白酒风味物质的形成，是微生物代谢的产物，同时也是原料中基本组分及非基本组分，在各类生物酶的直接或间接催化下的生物合成、非酶促化学反应和热降解反应等多种因素共同作用结果。白酒的风味与酿造微生物及酿造工艺也有直接关系。酿造基酒质量的闻低对广品的最终质量的好坏起决定性的作用。白酒酿造中的生香酵母又称产酯酵母，主要属于产膜酵母和假丝酵母，大多为异型汉逊酵母及少数小圆型酵母属，是白酒和黄酒发酵产香的重要菌种(熊子书，酿酒科技，2002.5:19 — 21)。浓香型白酒以己酸乙酯为主的复合香，是由梭状芽抱杆菌，俗称己酸菌的作用，产于泥质发酵老窖或人工培养泥窖中，发酵周期长；清香型白酒以醋酸乙酯为主体香，在小曲、鼓曲或液态法白酒中添加生香酵母，在发酵过程中生成醋酸及其乙酯。酒精发酵过程中酯的产生量与特殊的酵母菌种种类有密切关系。白酒发酵要求酿酒菌剂具有产酯率高、产酒精率高并耐高温。重量和质量相同的原料使用不同的酿酒菌剂，形成不同的酒精产量和酯含量。好的酿酒菌剂使同样的原料酒精产量高、富含酯类，并使白酒纯香。但传统大曲虽然产酯率高，产酒率却较低，特别是大曲构成成份复杂，使白酒质量不稳定。我国是白酒生产大国，随着菌种筛选、诱变等技术的成熟，我国各地区先后筛选出了上千种产酯量较高的菌株或菌种。中国专利CN201210039242.2中公开了一株高产酯东方伊萨酵母菌Z19，该菌种液体发酵乙酸乙酯产量达27mg/100mL，酒精度为5.98% (v/v)；中国专利CN201110094875.9中公开了一株高产酯酿酒酵母基因工程菌，该菌种续渣发酵乙酸乙酯产量高达74.8mg/100mL，酒精度为7.1% (v/v);但酿造出的老白干口感不协调、不
理相白酒的风味特点取决于香味成分含量和量比关系，香味成分的来源和含量多少，取决于发酵工艺以及有益微生物参予代谢产物的不同。而老白干酒巧妙的运用了大曲中的霉菌、酵母菌、细菌等有益微生物，这决定了老白干酒的典型特征:不同于清香型白酒，有清香型酒的清、净、爽的特点,但又比清香型酒醇厚,香味更大。由于生香酵母的重要意义，虽然目前已经筛选得到产酯量较高的菌株，人们还是希望通过改进筛选或诱变等方法得到产酯量和产酒精量适宜且配比最佳、香气成分更协调的生香酵母，尤其在老白干生产中具有重要的意义，这也是本领域研究人员的长期追求
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种产酯量、产酒精量配比最佳，香气成分更协调，适合老白干生产的完全代表老白干酒的典型风格的生香酵母。本发明生香酵母菌株是从河北衡水老白干酒业股份有限公司的大曲中分离得到的异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)新菌株,该菌株已经于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101),分类命名为异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus)，保藏编号为 CGMCC N0.6983。本发明异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)HJY_006通过下述方法筛选得到:1、取I 2克酒曲(由河北衡水老白干酒业股份有限公司提供)到装有50ml麦芽汁的三角瓶中，于30°C摇床(200r/min)培养48小时，再取Iml接种到麦芽汁试管中培养，经过3次的转接培养即可。麦芽汁制备:取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水,在55 60°C水浴中保温糖化，不断搅拌，经3 4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至5° Β ,加入一定量乳酸,于115°C灭菌20min备用。固体培养基加2%琼脂。2、取上述方法培养的酵母液，按10倍梯度逐级稀释到10_7，取稀释度为10_4、10_5、10_6、10_7各0.2ml的溶液，分别涂布于5° Be麦芽汁培养基平板，30°C培养48小时。3、挑取平板上长出的典型酵母单菌落进行描述性记录，并同时制片镜检，从中挑出乳白色，表面湿润、有光泽，圆形，边缘整齐，隆起，不透明菌落，然后选择不同类型的酵母菌落分别接于麦芽汁固体斜面培 养基上，于30°C培养48小时。4、取不同类型的酵母菌株，分别于30°C麦芽汁培养基培养7天，测定各发酵液中酯含量、酒精含量，筛选产酯、产酒精含量最高的菌株。5、26SrRNA基因序列测定挑取一环菌体于10 μ L灭菌水中，99°C、IOmin变性，离心取上清液做模板，使用试剂盒 TaKaRa Fungi Identification PCRKit(CodeN0.D317)，进行 PCR 扩增目的片段，反应结束后取5ul进行3%琼脂糖凝胶电泳,使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0 (Code N0.DV805A)切胶回收目的片段，以Seq Forward为引物进行DNA测序。测序结果在GeneBank中利用Blast程序进行比对。采用特异性引物扩增后，获得的26SrDNA序列在GeneBank的比对结果显示，HJY-OO6 与异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus) (GU138438..1)的 26SrRNA 基因的相似性达到99%。结合菌体形态特征的鉴定结果，将菌株HJY-006确定为异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)。本发明还提供了含有上述异常威克汉姆酵母(HJY-006)的酒曲。 本发明还提供了上述异常威克汉姆酵母(HJY-006 )新菌株和含有上述异常威克汉姆酵母(HJY-006)的酒曲在白酒生产中的应用。异常威克汉姆酵母(HJY-006)的优良特性:异常威克汉姆酵母(HJY-006)的最佳发酵培养基是高粱汁培养基，该菌株酒化力的最佳发酵工艺参数为:温度29°C，培养时间59h，接种量5%和pH6.5，发酵液的酒精度为2.8%(v/v)。其产乙酸乙酯的最佳工艺参数为:温度28°C，培养时间65h，接种量5%和PH4.5，其乙酸乙酯含量达到50.2mg/100mL。有益效果异常威克汉姆酵母(HJY-006)既产酒精又产酯，既能有一定的酒精产量，又能很好地满足白酒对酯香的要求，兼具了酒精酵母和产酯酵母的双重特性，成为老白干酿造过程不可缺少的特征性功能菌。其代谢特性对于老白干酒的典型风格特点的形成具有重要意义。
:图1是HJY-006在显微镜下的菌体细胞形态图2是HJY-006在培养皿内的菌落形态图3是HJY-006发酵液中温度与酒精含量的关系图4是HJY-006发酵液中培养基与酒精含量的关系图5是HJY-006发酵液中接种量与酒精含量的关系图6是HJY-006发酵液中培养时间与酒精含量的关系
具体实施方式
:下面通过具体的实施方案叙述本发明的一种异常威克`汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)菌种HJY-006。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。实施例1本发明生香酵母菌株是从河北衡水老白干酒业股份有限公司的大曲中分离得到的异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)新菌株，该菌株已经于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101),分类命名为异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus) HJY-006，保藏编号为 CGMCC No6983。本发明异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)HJY_006通过下述方法筛选得到:1、取I 2克酒曲(由河北衡水老白干酒业股份有限公司提供)到50ml麦芽汁三角瓶中，于30°C摇床(200r/min)培养48小时，再取Iml接种到麦芽汁试管中培养，经过3次的转接培养即可。麦芽汁制备:取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水,在55 60°C水浴中保温糖化，不断搅拌，经3 4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至5° Β ,加入一定量乳酸,于115°C灭菌20min备用。固体培养基加2%琼脂。2、取上述方法培养的酵母液，按10倍梯度稀释到10'取稀释度为lO'lO'lO—6、10_7各0.2ml的溶液，分别涂布于5° Be麦芽汁培养基平板，30°C培养48小时。3、挑取平板上长出的典型酵母单菌落进行描述性记录，并同时制片镜检，从中挑出乳白色，表面湿润、有光泽，圆形，边缘整齐，隆起，不透明菌落，然后选择不同类型的酵母菌落分别接于麦芽汁固体斜面培养基上，于30°C培养48小时。4、取不同类型的酵母菌株，分别于30°C麦芽汁培养基培养7天，测定各发酵液中酯含量、酒精含量，筛选产酯、产酒精含量最高的菌株。5、26SrRNA基因序列测定挑取一环菌体于10 μ L灭菌水中，99°C、IOmin变性，离心取上清液做模板，使用试剂盒 TaKaRa Fungi Identification PCR Kit (Code N0.D317)，进行 PCR 扩增目的片段，取5ul进行3%琼脂糖凝胶电泳,使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0 (Code N0.DV805A)切胶回收目白勺片段，以SeqForward为引物进行DNA测序。测序结果在GeneBank中利用Blast程序进行比对。采用特异性引物扩增后，获得的26SrDNA序列在GeneBank的比对结果显示，HJY-OO6 与异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus) (GU138438..1)的 26SrRNA 基因的相似性达到99%。结合菌体形态特征的鉴定结果，将菌株HJY-006确定为异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)。本发明还提供了含有上述异常威克汉姆酵母(HJY-006)的酒曲。本发明还提供了上述异常威克汉姆酵母(HJY-006 )新菌株和含有上述异常威克汉姆酵母(HJY-006)的酒曲在老白干酒发酵生香中的应用。实施例2:异常威克汉姆酵母HJY-006在液态条件下产酒精产酯实验:
1、培养基制备:⑴麦芽粉培养基麦芽粉20g,蛋白胨Ig,萄萄糖20g,蒸懼水IOOOmL,pH调至6.0,121°C灭菌20min。固体培养基加2%琼脂.
⑵大米麦芽培养基取粉碎后的麦芽和大米按质量比1:4混合后，加入5倍水，加耐高温α —淀粉酶(酶活力:30000U/ml) 95°C液化60min，再加糖化酶(酶活力:50000U/ml) 64°C糖化3小时，过滤备用，糖度控制在12Brix，121°C灭菌30min。⑶纯麦芽培养基取粉碎后的麦芽加4倍水，加耐高温α —淀粉酶(酶活力:30000U/ml)95°C液化30min后，再加糖化酶(酶活力:50000U/ml)64°C糖化2.5小时，过滤备用，糖度控制在12Brix, 121。。灭菌 30min。⑷高粱汁培养基，取粉碎后的高粱加4倍水，加耐高温α—淀粉酶(酶活力:30000U/ml)95°C液化50min，再加糖化酶(酶活力:50000U/ml)64°C糖化2.5小时，过滤备用，糖度控制在12Brix，121°C 灭菌 30min。(5)玉米汁培养基按GB/T20886-2007 的制备方法进行[1°1]。2、仪器设备
电子天平、生化培养箱、显微镜、高压蒸汽灭菌器、蒸馏装置和岛津气相色谱仪。3、酒精度的测定方法取成熟发酵液200mL加入到蒸馏瓶中，加入IOOmL蒸馏水，调pH在6.5左右，混匀后蒸馏，准确取出IOOmL蒸馏液，用酒精计测定酒精含量，同时测定温度，转换成20°C时的酒精度。4、香气成分分析采用岛津GC-14C气相色谱仪对蒸馏后的溜出液进行测定，测定条件:大口径毛细管柱，柱温70°C，进样器温度250°C，检测器温度230°C。5、异常威克汉姆酵母HJY-006发酵单因素实验通过对异常威克汉姆酵母HJY-006在不同温度、不同培养基、不同接种量和不同发酵时间条件下，发酵产物的酒精度测定，确定其各自最佳温度、培养基、接种量和发酵时间。(I)温度对发酵力的影响由图3可知，在23°C 28°C的范围内，随着温度的升高，异常威克汉姆酵母HJY-006发酵液的酒精含量逐渐增大，在23°C时，发酵液的酒精含量最低，仅为1.29%vol，而在28°C时，发酵液的酒精含量最高，达到2.0%vol，相当于23°C时的
1.54倍。因此，该菌株的最佳发酵温度为28°C。(2)培养基对发酵力的影响由图4可以看出，在四种培养基中，酵母菌的生长存在一定的差异。玉米培养基中菌株HJY-006发酵液的酒精产量最低，仅为1.00%vol，高粱培养基中含量最高，达到2.10%vol，是玉米培养基的2.1倍`。因此，该菌株的最佳发酵培养基是高粱汁培养基。(3)接种量对发酵力的影响由图5数据显示，接种量在2%_5%的范围内，随着接种量的提高，发酵液的酒精含量逐渐增大，5%的接种量，发酵液酒精含量最高，达到1.9%vol。接种量继续增大，酒精含量反而逐渐下降，在7%的接种量,酒精含量最低，仅为1.5%vol,相当于5%时酒精含量的77.4%。由此，5%是该菌株的最适宜的接种量。(4)培养时间对发酵力的影响由图6可知，异常威克汉姆酵母HJY-006在36h_60h的范围内，随着发酵时间的延长，发酵液的酒精含量逐渐增大。在36h时，发酵液的酒精含量最低，仅为1.5%vol,当培养时间为60h时，发酵液的酒精含量最高，达到1.9%vol，是36h含量的1.3倍。因此，该菌株的最佳发酵时间是60h。6、异常威克汉姆酵母HJY-006发酵正交实验表I异常威克汉姆酵母HJY-006L9 (34)正交实验因素及水平
权利要求
1.一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus) HJY-006，保藏编号为CGMCCN0.6983。
2.如权利要求1所述的一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus)HJY-006，其特征在于，所述HJY-006的发酵培养基是高粱汁培养基，发酵工艺参数为:温度29° C，培养时间59h，接种量5%和pH6.5。
3.如权利要求1所述的一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus)HJY-006，其特征在于，所述HJY-006产乙酸乙酯的工艺参数为:温度28° C，培养时间65h，接种量5%和ρΗ4.5。
4.含有权利要求1所述菌株的酒曲。
5.权利要求1-3任一所述的异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus)HJY_006在白酒生产中的应用。
6.权利要求4所述的酒曲在白`酒生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种异常威克汉姆酵母HJY-006，已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo6983。该菌株酒化力的最佳发酵工艺参数为温度29°C，培养时间59h，接种量5%和pH6.5，发酵液的酒精度为2.8%(v/v)。产乙酸乙酯的最佳工艺参数为温度28°C，培养时间65h，接种量5%和pH4.5，乙酸乙酯含量达到50.2mg/100mL。该菌株既能有一定的酒精产量，又能很好地满足白酒对酯香的要求，兼具了酒精酵母和产酯酵母的双重特性，成为老白干酿造过程不可缺少的特征性功能菌。其代谢特性对于老白干酒的典型风格特点的形成具有重要意义。
文档编号C12N1/16GK103184167SQ20131010239
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月27日 优先权日2013年3月27日
发明者张煜行, 张永增, 佟兰欣, 刘彦龙, 程宗志 申请人:河北衡水老白干酒业股份有限公司