一种发酵法制取赤藓糖醇的方法
【专利摘要】一种发酵法制取赤藓糖醇的方法。赤藓糖醇(Erythrito)是迄今发现的自然界中相对分子质量最小的糖醇，具有结晶性好、入口清凉等特点，为国际上较流行的新型功能性甜味剂。由于赤藓糖醇具有良好的食品加工适应性和保健功能，目前广泛用于食品、医药、化妆品及化工等领域。本发明以蔗糖为原料，以NTG诱变获得的高产埃西托丛梗孢酵母为发酵菌株，通过对发酵培养基及发酵工艺的优化，赤藓糖醇的最终浓度可达220g/L，发酵浓度高，适合产业化生产。
【专利说明】一种发酵法制取赤藓糖醇的方法 一、
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及微生物发酵法制取赤藓糖醇的技术。 二、
【背景技术】
[0002] 赤藓糖醇（Erythrito)是迄今发现的自然界中相对分子质量最小的糖醇，具有结 晶性好、入口清凉等特点，为国际上较流行的新型功能性甜味剂。除与其他多元糖醇同样具 有防龋齿以及适于糖尿病患者食用等保健功能外，赤藓糖醇还有两个重要特性，即低热量 (< 1.66kJ/g)和高耐受量（无副作用）。由于赤藓糖醇具有良好的食品加工适应性和保 健功能，目前广泛用于食品、医药、化妆品及化工等领域。
[0003] 自赤藓糖醇被发现以来，已经对其物理化学性质、生理功能及其作用机理、代谢途 径和在食品中的应用等方面进行了较为深入的研究。近年来，对其分子生物学方面的研究 也引起了科技界的广泛关注。赤藓糖醇生产方法包括生物抽提法、化学合成法以及发酵法。 生物抽提法是指赤藓糖醇可以从海藻、苔鲜及某些草类中提取。用化学法，氢化还原合成， 可由丁烯二醇与过氧化氢反应，其中丁烯二醇是由乙炔和甲醛先制成2-丁炔-1，4-二醇， 然后将其水溶液与雷氏镍混合并加入阻化剂氨水，在〇. 5MPa左右通氢，氢化后得赤藓糖醇 产品。
[0004] 发酵法为用一定基质培养微生物，通过微生物发酵生产赤藓糖醇。如将淀粉乳酶 解成葡萄糖后，由微生物在高浓度条件下发酵后提纯精制、浓缩、结晶、分离、干燥而得。上 述三种方法，其中，生物抽提法成本相当高，得率极低；化学合成法污染严重、质量不稳定， 食用安全系数较低。因此，发酵法是最为理想的生产方法。
[0005] 1956年，加拿大spencerj. F. T等在研究高渗酵母产生甘油时，发现因菌种生长 速度、培养条件不同，可产生赤藓糖醇。80年代，日本农水省食品综合研究所与日研化学 (株）共同研究开发成功赤藓糖醇生产技术，并有产品上市。从90年代起，日本在克服以往 赤藓糖醇发酵研究中存在的菌种耐糖性差、发泡性强、发酵产率低以及副产品多等问题的 情况下，率先实现了赤藓糖醇的工业化生产。其他一些工业发达国家如法国Ceerstar公司 也有赤藓糖醇产品。国内目前有山东保龄宝、淄博中食歌瑞等公司采用发酵法生产赤藓糖 醇，但因规模和技术等因素尚不能满足市场的需求。近几年，国内外为获得赤辞糖醇的生产 而进行了利用高渗酵母生产赤藓糖醇研究，但多数还停留在生产菌株的分离筛选、培养条 件优化以及赤藓糖醇的分离纯化技术等实验室研究阶段，菌种的生产性能较低，产量一般 在24. 8-54. 6mg/mL之间，难以进行大规模生产。 三、
【发明内容】
[0006] 本发明通过利用化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基胍（NTG)诱变亲代菌株，选择相对 于亲代菌株有增高的赤藓糖醇转化率的菌株而获得突变体。发酵中以蔗糖为原料，将高产 埃西托丛梗孢酵母YZ0806通过一级种子培养、二级种子培养和发酵罐培养，生产赤藓糖醇 (注：埃西托丛梗孢酵母（Moniliella acetoabutans)保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2012年8月7 日，保藏编号：CGMCC No. 6415)。
[0007] 本发明的技术特点包括：
[0008] 1.诱变后得到赤藓糖醇的高产菌株
[0009] 利用化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基胍（NTG)诱变Moniliella菌株得到高产赤藓 糖醇的埃西托丛梗孢酵母YZ0806,克服了野生菌株产率低纯度低的缺点，通过发酵工艺优 化调控目标产物的代谢流，可实现赤藓糖醇的高得率。
[0010] 2.无其他杂糖醇类物质
[0011] 根据本方法生产的赤藓糖醇纯度高，不含其他杂糖醇类物质。
[0012] 3.原料环保，避免石油污染
[0013] 采用蔗糖为原料，产生的赤藓糖醇转化率高且不累积甘油、戊五醇和乙醇等副产 物，同时可以避免从石油带来的不可食的污染成分。
[0014] 4.适合产业化生产
[0015] 生物发酵法生产赤藓糖醇，赤藓糖醇的最终浓度可达220g/L，发酵浓度高，适合产 业化生产。 四、【具体实施方式】
[0016] 实施例1
[0017] 发酵菌株：埃西托丛梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806
[0018] 斜面培养基：葡萄糖200g，酵母膏10g，尿索lg，琼脂20g，蒸馏水1000mL，ρΗ6· 0 ;
[0019] 种子培养基：鹿糖25g，牛肉膏5g，酵母膏7g，蛋白胨35g，蒸馈水1100mL ;
[0020] 埃西托丛梗孢酵母YZ0806接种于斜面培养基上，30°C培养72h进行活化，活化2 次；将3块0. 5cm2活化后的菌株接入灭菌冷却后的种子培养基内，32°C，160rpm培养48h ; 培养获得的种子培养基以10%的接种量转入灭菌冷却后的发酵培养基内，32°C，通气量 0. 5vvm，菌体生长期控制溶氧为30%，50h后调整溶氧为15%，pH范围在6. 0，180rpm培养 144h ;菌株发酵液在4000r/min的条件下离心20-30min，上清液即为赤藓糖醇的粗提液，赤 藓糖醇含量为221g/L。
[0021] 实施例2
[0022] 发酵菌株：埃西托丛梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806
[0023] 斜面培养基：葡萄糖200g，酵母膏10g，尿索lg，琼脂20g，蒸馏水1000mL，ρΗ6· 0 ;
[0024] 种子培养基：鹿糖20g，牛肉膏3g，酵母膏5g，蛋白胨30g，蒸馈水1000mL ;
[0025] 埃西托丛梗孢酵母YZ0806接种于斜面培养基上，30°C培养72h进行活化，活化2 次；将3块0. 5cm2活化后的菌株接入灭菌冷却后的种子培养基内，32°C，160rpm培养48h ; 培养获得的种子培养基以10%的接种量转入灭菌冷却后的发酵培养基内，32°C .通气量 0. 5vvm，菌体生长期控制溶氧为30%，50h后调整溶氧为15%，pH范围在5. 0，180rpm培养 144h ;菌株发酵液在4000r/min的条件下离心20-30min，上清液即为赤藓糖醇的粗提液，赤 藓糖醇含量为225g/L。
[0026] 实施例3
[0027] 发酵菌株：埃西托丛梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806
【权利要求】
1. 一种发酵法制取赤藓糖醇的方法，其特征在于：利用化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基 胍（NTG)诱变亲代菌株获得高产菌株，通过一级种子培养、二级种子培养和发酵罐培养，采 用阴、阳离子交换树脂对产品进行精制，浓缩结晶后获得赤藓糖醇晶体。
2. 如权利要求1所述的一种发酵法制取赤藓糖醇的方法，其特征在于：NTG诱变处理为 取0. 1 % -0. 5%的亚硝基胍（NTG)处理液8-10mL，加入8-10mL孢子悬浮液，34?35°C保温 振荡处理50-60min，先稀释800-1000倍终止反应，适当稀释后涂布于平板培养基上，34? 35°C保温培养1?2d，挑取生长较好透明水解圈较大的单菌落接于斜面上，摇瓶初筛获得 正突变株。
3. 如权利要求1所述的一种发酵法制取赤藓糖醇的方法，其特征在于：高产菌株为埃 西托丛梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806,其菌种保藏编号为CGMCC Νο·6415。
4. 如权利要求1所述的一种发酵法制取赤藓糖醇的方法，其特征在于：种子培养和发 酵培养的培养基分别为，种子培养基：蔗糖20g-25g，牛肉膏3g-5g，酵母膏5g-7g，蛋白胨 30g-35g，蒸馈水 lOOOmL-llOOmL ;发酵培养基：鹿糖 100g-120g，酵母膏 5g-7g，脲 lg-2g， MgS04 · 7H20 0· 5g-0. 8g，蒸馏水 lOOOmL-llOOmL 上述培养基在 0· IMPa，121°C条件下灭菌 20min_25min〇
5. 如权利要求1所述的一种发酵法制取赤藓糖醇的方法，其特征在于：赤藓糖醇的发 酵浓度可达220g/L以上。
【文档编号】C12R1/645GK104120154SQ201310143795
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2013年4月24日
【发明者】王福清, 王福华, 殷红 申请人:中科医药行业生产力促进中心有限公司