荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种利用荧光定量PCR技术检测耳聋基因PDS2168A＞G突变的方法及试剂盒。针对PDS2168A＞G突变位点，设计特异性突变型探针和野生型探针并分别标记不同颜色的荧光，突变位点两侧设计扩增引物。对一个待测样本用含野生型探针、突变型探针及扩增引物的PCR反应体系进行扩增，通过与质控品比较荧光曲线模式判断样本是否存在PDS基因2168A＞G突变。本发明能为耳聋患者尤其是伴大前庭水管综合征的病因诊断提供临床参考，也能筛查新生儿、孕期夫妇是否为携带者，为耳聋的产前诊断、新生儿先天耳聋病因诊断提供帮助。试剂盒具有闭管高通量自动化操作及分析的特点，尤其适合临床实验室使用。
【专利说明】荧光PCR技术检测PDS基因2168 A> G突变的方法及其试 剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测【技术领域】，特别涉及一种探针特异性的实时PCR技术检测耳 聋基因 H)S 2168A > G突变的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 耳聋是造成语言交流障碍最常见的疾病，新生儿耳聋的发病率为0. 1 %?0. 3%。 我国听力语言残疾者甚众，并以每年新生3万聋儿的速度增长，我国累计约有30万对生育 至少一个聋儿的育龄夫妇面临再次生育的选择。耳聋发生的原因、是否具有遗传性、下一 次生育是否安全是耳聋家庭极为关心的问题。大前庭水管综合征（Enlarge vestibular aqueduct syndrome. EVAS)是一种发病率较高的常染色体隐性遗传性听力障碍性疾病。影 像学检查资料表明在儿童感音神经性聋患者中，大前庭水管是最常见的一种内耳畸形，在 遗传性聋人群中发病率约为1%?1.3%，在某些地区甚至可达7%。SLC26A4基因定位于 7q31，其mRNA全长4930bp，共有21个外显子.开放阅读框架2343bp，贯穿于外显子2和外 显子21，编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，属于离 子转运体家族，研究表明其功能主要与碘氯离子转运有关突变的特点。2168A > G突变是 EVAS患者中最常见的SLC26A4基因突变位点之一，对中国人群进行2168A > G突变的普遍 筛查，可降低大前庭水管患儿的出生率。
[0003] 目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为PCR产物直接测序法。PCR 产物直接测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备 和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的 优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性（RFLP) 检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。公开的专 利201010599385. X，采用特异性引物及探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术 进行突变检测，该方法操作上复杂，仪器昂贵，也不易普及推广。
[0004] 本方法采用一种实时荧光聚合酶链反应技术（FQ-PCR)检测PDS基因2168A > G 突变的方法，针对PDS基因2168A > G位点设计特异性野生型探针及突变型探针，野生型及 突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在PDS基因2168位点两侧翼序列区设计特 异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不 同来判断样本是否存在突变。该方法具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单， 检测单个位点突变需要1个PCR反应管实现的优点。适合临床实验室使用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种PDS基因 2168A > G突变的实时荧光PCR检测方法和 试剂盒，可用于临床样本的检测。
[0006] 本发明的具体技术路线为：
[0007] 1)PDS基因外显子19区域（SEQ ID NO :5)的2168A > G位点处设计野生型探针及 突变型探针，其长度均为10_30bp之间的核苷酸序列。两种探针均覆盖PDS基因2168A > G位点，其中野生型探针（SEQ ID NO :3)针对PDS基因2168A > G野生型位点，突变型探针 (SEQ ID NO :4)针对PDS基因2168A > G突变位点。
[0008] 2)探针5'端标记荧光发生基团FAM或HEX等类似发光基团，3'端标记荧光淬灭基 团TAMRA或BHQ1等类似淬灭基团。探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可 以是覆盖PDS基因2168A > G位点的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5'端标 记的荧光发生基团及其相应的3'端荧光淬灭基团可以是目前本领域中任何可用的荧光基 团，如FAM，HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC，JOE，CY5等。可以使用目前常用的 Taqman探针，也可以是在普通Taqman探针基础上经过修饰的LNA-Taqman探针，MGB-Taqman 探针或现有技术能够实现的在Taqman探针基础上改良修饰的相关探针。
[0009] 3)PDS基因2168位点上游设计正向扩增引物，在下游设计反向扩增引物，其长度 均为10-30bp之间的核苷酸序列，能够扩增出含有PDS基因2168位点的长度为50-700bp 的核苷酸片段，优选地，正向引物（SEQ ID NO :1)及反向引物（SEQ ID NO :2)为能扩增出含 有PDS基因2168位点的60-150bp片段的特异性核苷酸序列。
[0010] 4)配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括：耐热DNA聚合酶、 dNTP、UNG酶、含有Mg离子的缓冲液，正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)， 野生型探针（SEQ ID NO :3)，突变型探针（SEQ ID NO :4)。
[0011] 5)从待测样本中提取DNA，加入反应体系，进行荧光定量PCR反应。
[0012] 6)依据野生型、突变型探针标记的不同颜色显示确定样本的基因型。只有野生型 探针的颜色显示时，样本为野生型，反之为突变型，如果两种颜色都存在，则样本为杂合型。
[0013] 本发明提供的PDS基因2168A > G突变检测试剂盒主要包括以下组分：PCR反应 液，阴性质控品，阳性质控品，DNA裂解液，红细胞裂解液和分隔并集中包装这些试剂瓶或管 的包装盒。
[0014] 本发明依据下述原理来实现，为了检测roS(SEQ ID NO :5)基因2168A > G位点， 设计覆盖2168A > G位点的突变型探针与野生型探针，野生型探针只能与野生型样本模板 完全匹配，突变型探针只能与突变型样本模板完全匹配，由于突变型探针与野生型探针5' 端标记的荧光报告基团不同，即二者发射波长不同的荧光，在荧光PCR仪上被分别记录并 在分析软件中以不同颜色或不同的标记反映出来。
[0015] 根据本发明的一个优选的实施方案，试剂盒中PCR反应液含有1XPCR Buffer、 dNTPs、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)，野生型 探针（SEQ ID NO :3)，突变型探针（SEQ ID NO :4)。
[0016] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' -CTTTGACGACAACATTAGAAAGG-3'
[0017] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -TTGACCCTCTTGAGATTTCACT-3'
[0018] 野生型荧光探针（SEQ ID NO :3) :5' FAM-TTTGACGGTCCATGATGCTATA-BHQ13'
[0019] 突变型荧光探针（SEQ ID NO :4) :5' FAM-TTTGACGGTCCGTGATGCTATA-BHQ13'
[0020] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中也可以仅加入突变型探针，当模板是 突变型时，则最终可检测到突变型探针发射出的荧光，因而确定样本含有突变位点，当模板 是野生型时，则最终不能检测到突变型探针发射出的荧光，因而确定样本不含有突变位点。 理论上，一个体系中可以仅加入突变型探针，但是当同时加入野生型探针时，可以起到反向 校正的双保险作用，使结果更加准确可靠。仅加入突变型探针的试剂盒中PCR反应液含有 1XPCR Buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向引物（SEQIDN0:l)，反向引物（SEQID NO :2)，突变型探针（SEQ ID NO :4)。
[0021] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' CTTTGACGACAACATTAGAAAGG-3'
[0022] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -TTGACCCTCTTGAGATTTCACT-3'
[0023] 野生型荧光探针（SEQ ID NO :3) :5' FAM-TTTGACGGTCCATGATGCTATA-BHQ13'
[0024] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的阳性质控品为经过测序检验结果为 PDS基因2168A > G纯合突变型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的PCR产物或质 粒载体；阴性质控品为蒸馏水、纯水、生理盐水或鲑鱼精子DNA，也可以为经过测序检验结 果为PDS基因2168A > G野生型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的PCR产物或相 应的质粒载体；
[0025] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中待检测靶核酸样品来自从各种途径获 取的被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织等等。
[0026] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的DNA提取液主要包含Chelex-100。 也可以使用其它试剂盒或方法提取的DNA作为进行荧光PCR的模板。
[0027] 根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中用于判定检测方法有效性的标准是： 每次检测都使用PCR反应液分别检测阳性质控品和阴性质控品，对于阳性质控品，依据突 变型探针产生的颜色荧光曲线作为阳性质量控制标准，阳性质控品的Ct值应小于30。对 于以经过测序检验结果为PDS基因2168A > G位点野生纯合型的组织、血液、或细胞系提取 的DNA或相应的PCR产物或相应的质粒载体阴性质控品，依据野生型探针产生的颜色荧光 曲线作为阴性质量控制标准，阴性质控品的Ct值应小于30 ;对于以蒸馏水、纯水、生理盐水 或鲑鱼精子DNA的阴性质控品，野生型和突变型探针产生的颜色荧光曲线的Ct值均应大于 35。
[0028] 根据本发明的一个优选实施方案，可以根据所扩增序列的特殊情况，在试剂盒的 PCR缓冲液中加入甲酰胺或二甲基亚砜等PCR反应添加剂减少高GC含量或二级结构对PCR 反应的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光 强度，'S'型曲线是突变型探针颜色荧光曲线，野生型探针颜色荧光曲线无扩增。
[0030] 图2显示阴性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光强度， 'S'型曲线是野生型探针颜色荧光曲线，突变型探针颜色荧光曲线无扩增。该阴性质控品为 经过测序检验结果为PDS基因2168位点突变纯合型的质粒载体。
[0031] 图3显示阴性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光强度， 野生型与突变型探针颜色荧光曲线Ct值均无扩增。该阴性质控品为鲑鱼精子DNA。
[0032] 图4显示试剂盒检测PDS基因2168A > G纯合突变型人外周血组织标本的扩增曲 线。结果同图1。
[0033] 图5显示试剂盒检测PDS基因2168A > G野生型人外周血组织标本的扩增曲线。 结果同图2。
[0034] 图6显示试剂盒检测PDS基因2168A > G杂合型人外周血组织标本的扩增曲线。 横轴表示循环数（Ct值），纵轴表示荧光强度，两条'S'型曲线分别表示野生型与突变型探 针颜色荧光曲线，可见2条曲线的Ct值接近。
[0035] 图7显示DNA提取失败的人外周血组织的扩增曲线，结果同图3。野生型及突变型 探针颜色荧光曲线均无扩增，说明DNA提取失败。
【具体实施方式】
[0036] 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
[0037] 实施例1 :PDS基因2168A/G突变检测试剂盒及其使用
[0038] 试剂盒的组成
[0039] PCR反应液1管（500ul)、阳性质控品1管（20ul)，阴性质控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，红细胞裂解液1瓶（15ml)。
[0040] PCR反应液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID N0:1)、0. 2uM 反向引物（SEQ ID N0:2)、0. 2uM 野生型荧光探针（SEQ ID N0:3)，0. 2uM 突变型荧光探针（SEQ ID NO :4)。
[0041] 操作步骤：
[0042] 1)基因提取：取lOOul EDTA抗凝外周血，加入600ul红细胞裂解液，室温放置 5-10分钟，期间混匀数次，5000rpm离心5分钟，弃上清，然后加入DNA裂解液100ul，混匀， 99度10分钟，离心，取上清作为DNA摸板进行后续工作。也可以使用商业化的DNA提取试 剂盒进行基因提取，提取过程按照相应的试剂盒说明进行。
[0043] 2)PCR检测：取PCR反应液23ul置入PCR管中，加入2ul样品DNA，混匀后置于荧 光定量PCR仪中。
[0044] 阳性质控：分别取阳性质控品2ul加入PCR反应液中，余同样品操作。
[0045] 阴性质控：分别取阴性质控品2ul加入PCR反应液中，余同样品操作。
[0046] PCR 扩增参数：50°C 2min，95°C 2min，然后进行 40 个循环：95°C 30sec -61°C 20sec，反应结束后将结果保存待进一步分析。
[0047] 3)结果分析：依据阳性质控品、阴性质控品荧光颜色曲线对样本进行分析。如果 存在2条不同颜色的荧光曲线，则样本为杂合型。
[0048] 实施例2 :PDS基因2168A/G突变检测试剂盒及其使用
[0049] 试剂盒的组成
[0050] PCR反应液1管（500ul)、阳性质控品1管（20ul)，阴性质控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，红细胞裂解液1瓶（15ml)。
[0051] PCR反应液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID NO :1)、0· 2uM 反向引物（SEQ ID NO :2)、0· 2uM 突变型荧光探针（SEQ ID NO :4)。
[0052] 操作步骤同实施例1。
[0053] 结果分析：依据阳性质控品荧光颜色曲线对样本进行分析。如果存在与阳性质控 品荧光颜色相同的曲线，则样本存在PDS基因2168A/G突变，不能区分杂合还是纯合突变。 如果不存在荧光曲线，则样本判定为野生型。
[0001] 序列表 <110〉王宝恒 <120〉荧光PCR技术检测PDS基因 2168A〉G突变的方法及其试剂盒 <130> 0 <160> 5 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221> primer-bind <222> (1)..(23) <223〉根据特定核苷酸序列设计，用以作PCR扩增的引物 <400> 1 ctttgacgac aacattagaa agg 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> primer-bind <222> (1),. (22) <223〉根据特定核苷酸序列设计，用以作PCR扩增的引物 <400> 2 ttgaccctct tgagatttca ct 22 <210> 3 <211〉 22 <212> DNA
[0002] <213〉人工序列 <220> <221> probe-bind <222> (1)_. (22) <223〉根据特定核苷酸序列设计，用以作PCR扩增的探针 <400> 3 tttgacggtc catgatgcta ta 22 <210> 4 <211〉 22 <212〉 DNA <213>人丄序列 <220〉 <221> probe-bind <222〉 (1).. (22) <223〉根据特定核苷酸序列设计，用以作PCR扩增的探针 <400> 4 tttgacggtc cgtgatgcta ta 22 <210> 5 <211> 128 <212> DNA <213〉智人(Homo Sapiens) <220〉 <221> gene <222〉 (1).. (128) <223〉人PDS基因外显子7至8之间的核酸序列 <400> 5 attatgtgat agaaaagctg gagcaatgcg ggttctttga cgacaacatt agaaaggaca 60 cattcttttt gacggtccat gatgctatac tctatctaca gaaccaagtg aaatctcaag 120 agggtcaa
【权利要求】
1. 一种采用实时荧光聚合酶链反应技术（FQ-PCR)检测PDS基因2168A > G突变的方 法，其特征在于以PDS基因第19外显子位点（2168A>G)设计特异性野生型探针及突变型 探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在PDS基因2168A > G碱基 两侧设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR扩增中产生的 荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。
2. -种用实时荧光PCR方法检测PDS基因2168A > G突变的试剂盒，其特征在于试剂 盒主要包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品。
3. 根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PDS基因2168A > G碱基上 游设计正向扩增引物，在下游设计反向扩增引物，其长度均为10_30bp之间的核苷酸序列， 能够扩增出含有PDS基因2168A > G区域的长度为50-700bp的核苷酸片段，优选地，正向 引物（SEQ ID N0:1)及反向引物（SEQ ID N0:2)为能扩增出含有PDS基因第19外显子位 点（2168A > G)区域60-150bp片段的特异性核苷酸序列。
4. 根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PDS基因2168A > G区域设 计野生型探针及突变型探针，其长度均为10_30bp之间的核苷酸序列。两种探针均覆盖ros 基因2168区域，其中野生型探针（SEQ ID NO :3)针对PDS基因2168A > G野生型位点，突 变型探针（SEQ ID NO :4)针对PDS基因2168A > G突变位点。
5. 根据权利要求1、2、3、4所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PCR反应液中包含荧光 检测物质。荧光检测物质为荧光探针，其中探针5'端标记荧光发生基团，3'端标记荧光淬 灭基团。
6. 根据权利要求1、2、3、4、5所述的方法和试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括下列内 容：PCR反应液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向型引物、反向型引物、 野生型荧光探针、突变型荧光探针。
7. 根据权利要求1、2所述的方法及权利6所述的试剂盒，其特征在于待检测靶核酸样 品来自被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织；阳性质控品为经过测序检验结果 为PDS基因2168A > G纯合突变型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或含有相应序列的 PCR产物或质粒载体；阴性质控品为蒸馏水、纯水、生理盐水、鲑鱼精子DNA ;阴性质控品也 可以为经过测序检验结果为PDS基因2168A > G野生型的组织、血液、或细胞系提取的DNA 或含有相应序列的PCR产物或质粒载体。
【文档编号】C12Q1/68GK104120166SQ201310142789
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2013年4月24日
【发明者】王宝恒, 史桂芝 申请人:王宝恒