专利名称：一种人工dna分子及检测目标基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及遗传工程技术领域，尤其涉及一种人工DNA分子，及利用该人工DNA分子检测目标基因表达的方法。
背景技术：
哺乳动物β -酪蛋白基因在乳腺中高表达，皮肤和有毒T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocytes)中也能表达。酪蛋白是哺乳动物乳中主要的蛋白组份，根据结构划分为4类:a sl、a s2、β和K。乳腺组织中，4种酪蛋白基因mRNA翻译效率不同，a sl和β的mRNA翻译效率是Cis2和K的3至4倍。综上所述，β_酪蛋白基因位点是制备乳腺生物反应器的合适靶点。为证实β -酪蛋白基因启动子驱动的表达框是否有效，Kolb等(1999)采用乳腺上皮细胞。国内乳腺生物反应器研究方面，也采用乳腺上皮细胞验证表达框的有效性。如果能够在成纤维细胞中激活β_酪蛋白基因启动子，检测重组表达框的表达结果，将为乳腺生物反应器的构建提供直接方便的检测技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工DNA分子，还提供一种利用该DNA分子检测目标基因在成纤维细胞中表达的方法。本发明中术语“TALE”是指转录激活样效应子。本发明中术语“TALE-TFs” 是指 TALE 转录因子，即 TALEtranscription factors。为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案:一种DNA分子，所述DNA分子的碱基序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示，其能够编码一种TALE-TFs，所述TALE-TFs能够识别SEQ ID N05中的11-29位；所述DNA分子的碱基序列也可以为SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示，其能够编码一种TALE-TFs，所述TALE-TFs能够识别SEQ ID N05中的23-41位。一种表达载体，所述表达载体包含上述的DNA分子，其能够表达一种TALE-TFs。—种重组细胞,所述重组细胞是用上述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。一种检测目标基因表达的方法，包括以下步骤，步骤A、将目标基因转入哺乳动物β -酪蛋白基因，构建含目标基因的哺乳动物β_酪蛋白基因表达载体；步骤B、根据哺乳动物β -酪蛋白基因启动子靶序列TFml和TFm2分别设计TALE排列，并构建表达TALE-TFs的表达载体；其中所述哺乳动物β -酪蛋白基因启动子靶序列TFml 为 SEQ ID NOl 中的 11-29 位，靶序列 TFm2 为 SEQ ID NOl 中的 23-41 位；步骤C、用所述含目标基因的哺乳动物酪蛋白基因表达载体和所述表达TALE-TFs的表达载体共转染成纤维细胞；
步骤D、在成纤维细胞中检测目标基因的表达。
进一步，上述检测目标基因表达的方法，其中，步骤A所述酪蛋白基因是小鼠β_酿蛋白基因。进一步，上述检测目标基因表达的方法，其中，步骤B所述表达TALE-TFs的表达载体包含上述的DNA分子。进一步，上述检测目标基因表达的方法，其中，步骤C所述的成纤维细胞为小鼠成纤维细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果在于:为证实重组的表达框是否有效，国内外均采用在乳腺上皮细胞中进行检测。而利用TALE-TFs技术使不表达β -酪蛋白基因的哺乳动物成纤维细胞能够表达β -酪蛋白基因，也就能够实现用TALE-TFs在成纤维细胞中激活重组的β -酪蛋白基因一外源整合基因表达框，能够为体外 检测重组的β-酪蛋白启动子驱动的表达框提供一种更加方便的检测途径，无需培养乳腺上皮细胞。
图1为小鼠β -酪蛋白基因第I外显子靶向载体结构示意图；图2为中间载体pEGFP-Nl-BsmBI结构示意图；图3为小鼠成纤维细胞中TALE-TFs激活β -酪蛋白基因启动子质粒表达结果图片。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。实施例1小鼠β -酪蛋白基因-红色荧光蛋白报告基因表达载体构建实施例1中将红色荧光蛋白报告基因作为目的基因，转入小鼠β_酪蛋白基因，并构建成小鼠β-酪蛋白基因-红色荧光蛋白报告基因表达载体。如图1所示，小鼠β_酪蛋白基因-红色荧光蛋白报告基因表达载体包含左右同源臂、mRNA5’非翻译区、信号肽序列、Red基因和poly A，形成一个完整的表达框，并包含启动子调控序列和TATA box。因此，该载体能够用于TALE-TFs激活β-酪蛋白基因启动子的检测。1.1引物设计引物并加入BsmBI酶切位点(小写斜体字母)和其他所需要的酶切位点(下划线部分)，引物由Invitrogen公司合成(见表I)。表I引物名称及序列名称set|uencc(5# )
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BI RlGCTGACegfctcCGAGTGCACTATGGAOCCTCACITCT菌株与载体:大肠杆菌(Escherichiacoli) DH5a、pDsRed2_l 载体、pEGFP-Nl 载体。酶类及主要生化试剂:BglI1、EcoR1、HindII1、NcoI购自宝生物工程(大连)有限公司；Taq DNA聚合酶、pfu DNA 聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司；Esp3I (BsmBI )、Rapid DNA Ligation Kit 购自 Fermentas ；T4DNA Ligase (HC)购自 Promega 公司；基因组抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯。1.2小鼠基因组抽提采用颈椎脱臼处死实验小鼠，采取肌肉组织大约25mg左右，使用基因组抽提试剂盒抽提小鼠基因组，检测备用。1.3小鼠β -酪蛋白基因第一外显子两端同源臂序列扩增针对小鼠β_酪蛋白基因第一外显子基因组序列(Χ13484.1)，设计同源臂特异性扩增引物。第一外显子:上游引物E1F，下游引物E1R，扩增第一外显子同源臂Ε1Β，目的片段长度3370bp。采用25 μ L反应体系(表2):表2同源臂序列扩增体系
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dNTP, IOmM权利要求
1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的碱基序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示，其能够编码一种TALE-TFs，所述TALE-TFs能够识别SEQ ID N05中的11-29位； 所述DNA分子的碱基序列也可以为SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示，其能够编码一种 TALE-TFs，所述 TALE-TFs 能够识别 SEQ ID N05 中的 23-41 位。
2.—种表达载体,其特征在于,所述表达载体包含权利要求1所述的DNA分子,其能够表达一种 TALE-TFs。
3.—种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是用权利要求2所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
4.一种检测目标基因表达的方法，其特征在于， 步骤A、将目标基因转入哺乳动物β-酪蛋白基因，构建含目标基因的哺乳动物β-酪蛋白基因表达载体； 步骤B、根据哺乳动物β -酪蛋白基因启动子靶序列TFml和TFm2分别设计TALE排列，并构建表达TALE-TFs的表达载体；其中所述哺乳动物β -酪蛋白基因启动子靶序列TFml为SEQ ID NOl中的11-29位，靶序列TFm2为SEQ ID NOl中的23-41位； 步骤C、用所述含目标基因的哺乳动物β -酪蛋白基因表达载体和所述表达TALE-TFs的表达载体共转染成纤维细胞； 步骤D、在成纤维细胞中检测目标基因的表达。
5.根据权利要求4所述的检测目标基因表达的方法，其特征在于，步骤A所述β-酪蛋白基因是小鼠β_酪蛋白基因。
6.根据权利要求4或5所述的检测目标基因表达的方法，其特征在于，步骤B所述表达TALE-TFs的表达载体包含权利要求1所述的DNA分子。
7.根据权利要求6所述的检测目标基因表达的方法，其特征在于，步骤C所述的成纤维细胞为小鼠成纤维 细胞。
全文摘要
本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子的碱基序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，其能够编码一种TALE-TFs，所述TALE-TFs能够识别SEQ ID NO5中相应位点。本发明利用TALE-TFs技术使不表达β-酪蛋白基因的哺乳动物成纤维细胞能够表达β-酪蛋白基因，也就实现了用TALE-TFs在成纤维细胞中激活重组的β-酪蛋白基因——外源整合基因表达框，为体外检测重组的β-酪蛋白启动子驱动的表达框提供一种更加方便的检测途径，无需培养乳腺上皮细胞。
文档编号C12N15/63GK103233004SQ20131015644
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者皮文辉, 周平, 唐红, 张宾, 马小宁, 张译元, 刘文娟, 杨华, 杨永林, 王新华, 刘守仁 申请人:新疆农垦科学院