专利名称：一种云南臭蛙皮肤抗氧化肽及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学技术领域，具体地说是提供一种云南臭蛙andersonii )皮肤来源的抗氧化肽及其基因。
背景技术：
氧，对于地球上绝大多数生命体的生存是至关重要的，但是，通过产生各种活性氧分子，氧也是一个能损伤各种生命体的活性分子。这些活性氧分子(R0S，包括02_、H202及HO2'-OH等)能引起DNA损伤、脂类过氧化、蛋白氧化，进而损伤细胞。有大量的研究报道揭示，ROS和多种人类疾病的产生有着极为密切的联系，包括多种癌症衰老、呼吸系统疾病和免疫系统疾病等。抗氧化剂，顾名思义，是指能抑制其它分子被氧化的分子。自然界中已经发现了 2大类抗氧化剂，第一类是大分子量的由基因编码的蛋白质酶类，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等 ；第二类主要由小分子物质组成，如Vc、Ve等。到目前为止，已经有大量的抗氧化剂从不同的生物体中得以识别，这些抗氧化剂被广泛应用于癌症和心脏疾病的预防、食物储存以及化妆品领域中。但是，这些抗氧化剂都基本上属于上述2种类型，由于抗氧化剂具有重要的生物学功能和日常应用前景，在国外，许多科学家正在积极的寻找不同来源和不同类型的抗氧化剂。在中国传统中药和民族药中，许多两栖类动物被作为药材而被广泛应用。目前，大量的研究报道已经揭示了许多两栖类皮肤中的药理学活性分子，例如抗菌肽、免疫调节肽、抗肿瘤肽、镇痛肽等。最新的研究报道揭示两栖类动物皮肤中存在一类新颖的抗氧化剂与传统抗氧化剂不同，其化学本质是由基因编码的多肽，分子量小，由两栖类动物皮肤分泌。目前，还只有滇蛙、大绿臭蛙皮肤中的抗氧化肽得以报道。抗氧化肽具有强大、快速的活性氧清除能力，其能最大限度的保护皮肤，使两栖类动物尽可能少的地受到日照、紫外线等诱导的自由基损伤。该成果是皮肤抗氧化领域的重大发现，对生物医学、抗氧化保护及化妆品研发等相关领域具有重要意义。目前，已经从云南臭蛙皮肤分泌物中识别了大量的抗菌肽分子，但是，对其抗氧化肽的报道几乎没有。发明人将本发明的抗氧化肽的氨基酸全序列在蛋白质数据库中搜索，未能发现任何相同的多肽；发明人将本发明的抗氧化肽的核酸全序列在核酸数据库中搜索，未能发现任何相同基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的具有强烈抗氧化活性的云南臭蛙皮肤抗氧化肽及其基因。本发明的云南臭蛙皮肤抗氧化肽是中国两栖类云南臭蛙皮肤编码的一种单链条多肽，分子量为765.92 Daltons,从N端到C端的全序列为:FLCVRE。云南臭蛙皮肤抗氧化肽的基因克隆包括:
云南臭蛙皮肤抽提总RNA，cDNA文库的构建，设计特异性引物，利用PCR方法筛选编码抗氧化肽的cDNA。其中:
正向引物为:5 ’ - ATGTTCACCTTGAAGAAAACCCTT-3 ’，
反向引物为:5 ’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3，。所获的阳性克隆经过基因核苷酸序列测定表明:云南臭蛙皮肤抗氧化肽由284个核苷酸编码，自5’端到3’端的全序列为(序列表I):
atgttcacct tgaagaaaac ccttttactt cttttcttcc ttgggattat caactcatctctctgtgaag aagaggagcg taatgctgaa gaagaggagc gtcgtgatga tcctgatgtt cgtgatgttgaagttgaaaa gcgtttcctt tgcgttagag aatgataatt ggattggaaa tcatttgatg tggaacatcatttagctaaa tgcacatcag atgtcttata aaaaaaataa acatgttgca tacacttaaa gaaaaaaaaaa
序列表I中第147至162位核苷酸编码云南臭蛙皮肤抗氧化肽成熟肽，从N端到C端的氨基酸全序列为:Phe Leu Cys Val Arg Glu (FLCVRE,序列表2)。云南臭蛙皮肤抗氧化肽的制备方法:
根据编码云南臭蛙皮肤抗氧化肽的CDNA推断其成熟肽序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18层析柱脱盐和纯化，同时测定其纯度，用Edman降解法最终确定其氨基酸序列。本发明的有益效果在于:由编码云南臭蛙抗氧化肽的cDNA推导其成熟肽序列，合成的云南臭蛙抗氧化肽具有强烈和快速的自由基清除作用。该云南臭蛙皮肤抗氧化肽具有结构简单、人工合成方便、抗氧化活性强的特点，能制备成为相关的抗氧化产品。
具体实施例方式实施例:
云南臭蛙抗氧化肽基因克隆:
1.云南臭蛙皮肤总RNA的提取
1.)活体云南臭蛙采集于云南保山，用去离子水冲洗其皮肤，快速取其皮肤，放入液氮速冻保存，取约200 mg皮肤组织，在液氮中研磨成粉末，然后加入5 ml总RNA提取液(Trizol，大连宝生物产品)，之后，用10 ml玻璃匀浆器匀浆30 min ；
2.)室温放置5min,然后12000 rpm、4°C,离心5 min,留上清；
3.)加入等体积三氯甲烷溶液，震荡混匀，室温放置10min,然后12000g，4°C，离心15min,取上清；
4.)加入等体积的异丙醇，室温放置10min,然后12000 rpm,4°C,离心10 min,去上
清；
5.)沉淀用75%乙醇洗涤一次，晾干，管底干燥物即为云南臭蛙皮肤总RNA。2.云南臭蛙皮肤第二链cDNA的合成:采用CL0NTECH公司提供的Creator SMART cDNA Library Construction Kit 来合成第二链 cDNA。A.第一链cDNA的合成1.)在0.5ml无菌PCR管中加入Iμ I云南臭蛙皮肤总RNA、I μ I SMART IV寡聚核苷酸，I μ I CDS 111/3’ PCR引物，然后继续加入2 μ I DEPC水，使总体积达到5 μ ，混匀，72°C保温2 min，然后快速在冰上冷却2 min ；
2.)继续加入2μI第一链缓冲液，I μ I 20 mM DTT, I μ I 10 mM dNTP混合物、Iμ I MMLV反转录酶,混匀，离心,然后再42°C保温一小时,之后,将离心管置于冰上,终止合成；
B.第二链cDNA的合成。1.)将 2 μ I 第一链 cDNA、80 μ I 灭菌水、10 μ I Advantage PCR 缓冲液、2 μ IdNTP混合物、2 μ I 5’PCR引物、2 μ I CDS 111/3’PCR引物、2 μ I大肠杆菌聚合酶按次序加入0.5 ml PCR管中；
2.)在PCR仪中按照以下程序进行扩增:
a.95 °C 20 秒
b.25个循环:
95 0C 5 秒 68 0C 6分钟
3.) PCR结束后，即得到云南臭蛙皮肤第二链cDNA ； 3.云南臭蛙抗氧化肽基因克隆筛选:
1.)以云南臭蛙皮肤第二链cDNA作为模板，用2个引物进行PCR扩增，其中，
正向引物为:5 ’ - ATGTTCACCTTGAAGAAAACCCTT-3 ’，
反向引物为:5 ’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCG GCCGACATG-3，，
PCR在如下条件中进行:95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 60秒，30个循环，之后，用胶回收试剂盒回收PCR产物；
2.)在0.5 ml PCR管中加入2 μ I PCR产物、3 μ I灭菌水、5 μ I Solution I (由大连宝生物提供)，16°C过夜反应，将PCR产物连接进入PMD19T载体；
3.)将上述10μ I载体连接产物加入到100 μ I DH5 α感受态大肠杆菌中，冰上放置30分钟；
4.) 42°C热激90秒，然后快速放置到冰上I分钟；
5.)加入37°C温浴过的LB培养基Iml，37°C震荡培养60分钟；
6.)在含有X_gal、IPTG和Amp的琼脂培养基上进行培养，形成单菌落，挑取白色菌落，进行核苷酸测序；
4.云南臭蛙皮肤抗氧化肽cDNA序列测定和结果。挑取的菌落用双脱氧法进行核苷酸序列的测定，使用的仪器为ABI公司的3730XL全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为PMD19T载体上的测序引物:RV-M和M13-47。编码云南臭蛙皮肤抗氧化肽cDNA自5’端到3’端序列为:
atgttcacct tgaagaaaac ccttttactt cttttcttcc ttgggattat caactcatctctctgtgaag aagaggagcg taatgctgaa gaagaggagc gtcgtgatga tcctgatgtt cgtgatgttgaagttgaaaa gcgtttcctt tgcgttagag aatgataatt ggattggaaa tcatttgatg tggaacatcatttagctaaa tgcacatcag atgtcttata aaaaaaataa acatgttgca tacacttaaa gaaaaaaaaaa第147至162位核苷酸编码云南臭蛙皮肤抗氧化肽成熟肽，其氨基酸序列为:Phe LeuCys Val Arg Glu (FLCVRE)。5.云南臭蛙皮肤抗氧化肽的制备:
O根据云南臭蛙皮肤抗氧化肽的cDNA序列推断云南臭蛙皮肤抗氧化肽的成熟肽序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，然后通过HPLC反相C18层析柱进行脱盐、纯化和纯度测定；
2)用Edman降解法测定其氨基酸序列；
云南臭蛙皮肤抗氧化肽是中国两栖类动物云南臭蛙皮肤基因编码的一种单链多肽，分子量为765.92 Daltons,从N端到C端的全序列为:FLCVRE。6.云南臭蛙皮肤抗氧化肽的抗氧化活性检测:
ABTS+清除法检测云南臭蛙皮肤抗氧化肽的抗氧化作用:
首先配置ABTS储存液:在水溶液溶解2.8 mM过硫酸钾和7 mM ABTS，避光反应至少6小时，之后，立即用水稀释125倍，50微升溶于水的样品加入50微升ABTS稀释液，避光反应至少10分钟，之后，在415 nm波长下读其吸光度，样品抗氧化活性用如下公式进行计算:(A blank-A sample) X 100/ A blank，采用超纯水做对照，每组设3个平行，结果显示，I μ g/ml的云南臭蛙皮肤抗氧化肽能在3秒内清除99.1±0.5%的ABTS+自由基。这表明，云南臭蛙皮肤抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，同时还具有序列简单、合成方便等优点，能制备成为相关的抗氧化产 品。
权利要求
1.一种云南臭蛙皮肤抗氧化肽基因，其特征在于由284个核苷酸编码，自5’端到3’端的全序列如序列表I所示。
2.一种云南臭蛙皮肤抗氧化肽，其特征在于由序列表I中第147至162位核苷酸编码云南臭娃皮肤抗氧化肽成熟肽，从N端到C端的氨基酸全序列为:Phe Leu Cys Val ArgGlu，分子量为 76 5.92 Daltons。
全文摘要
本发明是一种云南臭蛙皮肤抗氧化肽及其基因，属于生物医学技术领域。云南臭蛙皮肤抗氧化肽分子量为765.92Daltons，从N端到C端的氨基酸全序列为PheLeuCysValArgGlu。编码该抗氧化肽的基因cDNA由284个核苷酸组成，其中第147至162位核苷酸编码云南臭蛙皮肤抗氧化肽的成熟肽。人工合成的云南臭蛙皮肤抗氧化肽具有很强的且快速的抗氧化活性，能制备成为相关的抗氧化产品，并且还具有序列简单、合成方便等特点。
文档编号C12N15/12GK103233012SQ20131018352
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月17日 优先权日2013年5月17日
发明者梁醒财 申请人:梁醒财