一种获得自身反应性b细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种获得自身反应性B细胞的方法，本发明所述的方法材料包括生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠。利用本发明所述的dsDNA免疫磁珠方法分选系统性红斑狼疮小鼠模型和病人的自身反应性B细胞，结果显示本发明所述的方法能够有效地分选出高纯度的自身反应性B细胞。高纯度的自身反应性B细胞对自身抗原dsDNA的刺激能快速增殖并有效地产生自身抗体。本发明所述的方法有效地从系统性红斑狼疮小鼠模型和病人体内获得了高纯度的自身反应性B细胞。这为研究体内稀少的自身反应性B细胞的特性和将来自身反应性B细胞的应用建立细胞分选平台。
【专利说明】一种获得自身反应性B细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种从自身免疫性疾病中获得自身反应性B细胞 的方法。具体而言，本发明所述的方法材料包括生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫 磁珠，应用dsDNA免疫磁珠（生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠联用）方法所分 选的自身反应性B细胞体外实验表明所述分选方法能有效分选出高纯度的反应性B细胞。
【背景技术】
[0002] 随着我国社会经济的发展，自身免疫病的发病率日益上升，而且自身免疫病后期 对人们生产、生活乃至生命健康造成的危害是非常严重的。加强该领域的基础性研究将会 进一步了解自身免疫性疾病的发生、发展、转归，进而提高对它的诊断、治疗和预防。这对保 障人类健康生活，促进经济社会的发展均有着重要的理论及现实意义。
[0003] 自身免疫性疾病根据组织损伤机制分为两大类：一类是T细胞介导的自身免疫性 疾病如多发硬化（MS)，另一类是自身抗体通过结合组织表面的抗原或与可溶性抗原形成免 疫复合物而介导的自身免疫性疾病。自身抗体相关的疾病如系统性红斑狼疮（SLE)、重症 肌无力（MG)和sjogren氏综合症等由于自身抗原特异性B细胞耐受缺失而造成的。在自 身抗体如IgG相关的众多的疾病中，辅助性T细胞可促进自身反应性B细胞的反应。近来， 许多证据显示，在T细胞驱动的自身免疫紊乱疾病如多发性硬化症、I型糖尿病中，自身反 应性B细胞也有着不可忽视的作用。因此，现在清楚众多自身免疫紊乱是由自身反应性T、 B细胞协调和共同介导的。
[0004] 为了研究自身反应性T细胞，人们利用自身反应性T细胞的特性来使用四聚体 (tetramer)技术分选。四聚体（tetramer)技术是一种可直接对抗原特异性T细胞（antigen specific T cells, AST)进行标记和检测的方法。该技术利用1个分子的链霉亲合素与4 个分子的生物素化主要组织相容性复合体（major histocompatibility comples，MHC)_抗 原肽单聚体连接成四聚体复合物，显著增加了其与T细胞受体（T-cell receptor, TCR)的 亲和力，因而使AST的测定敏感性大为提高，被诺贝尔奖获得者Doherty教授称之为定量 检测AST的金标准（包括抗原特异性效应T细胞和记忆性T细胞）[Altman JD，Moss PAH， Goulder PJR，et al. Science, 1996, 274:94]。除此之外，四聚体技术结合细胞表面标志分 子、细胞内效应分子染色（如各种细胞因子、趋化因子和细胞毒素），以及通过对四聚体阳 性T细胞的进一步分选等，可实现对AST活化增殖、凋亡老化及功能的评估，为阐明特定AST 在疾病发生、发展及防治中的作用提供重要的研究手段[Bodinier M，Peyrat MA，Tournay C，et al. Nature Med 2000,6 :707. ]。MHC-肽与 TCR 作用的分子基础 MHC-肽与 TCR 作用的 分子基础是基于T细胞膜上表位特异性TCR对抗原呈递细胞（APC)、靶细胞表面并与MHC分 子结合成复合物[Romero P，Dunbar PR，Valmori D，et al.J Exp Med，1998,188:1641·]。
[0005] 然而，对于自身反应性B细胞没有很好的分选方法，这极大的限制对自身反应性B 细胞的基础研究和临床应用。为了开展对自身反应性B细胞的基础研究，现在一般使用某 个自身反应性B细胞的转基因小鼠 [Pasquali JL，Soulas_Sprauel P，Korganow AS，Martin T, Auto-reactive Β cells in transgenic mice. J Autoimmun. 2007. 29 :250-256. ]〇 抗 dsDNA抗体的自身反应性B细胞特异地在SLE病人体内存在，而在正常健康人体中则检测 不至lj [Erikson J, Radic MZ, Camper SA, Hardy RR, Carmack C, ffeigert M. Expression of anti-DNA immunoglobulin transgenes in non-autoimmune mice. Nature 1991. 349 ： 331-344.]。多种针对dsDNA自身反应性B细胞转基因小鼠被建立来研究抗dsDNA抗 体的自身反应性B细胞的特性，发育等[Xu H，Li H，Suri-Payer E，Hardy RR，Weigert M. Regulation of anti-DNA B cells in recombination-activating gene-deficient mice. J Exp Med. 1998,188 :1247-54.]。尽管，通过对自身反应性B细胞转基因小鼠的研究 获得了大量的有关自身反应性B细胞的知识。然而，仍然不能很好地分选自身反应性B细 胞，进而，限制对自身反应性B细胞的临床应用，如分选人自身反应性B细胞通过体外诱导 产生调节性B细胞然后回输调节性B细胞进行治疗自身免疫性疾病的研究。
【发明内容】
[0006] 为解决分选自身反应性B细胞的技术难题，本发明公开了一种分选自身反应性B 的方法--dsDNA免疫磁珠法，所述方法材料包括生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免 疫磁珠。
[0007] 本发明通过上述dsDNA免疫磁珠（生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠 联用）分选自身反应性B细胞，具体包括以下步骤：
[0008] 1)寡DNA片段通过3'末端标记生物素
[0009] 获得胎牛胸腺，通过研磨获得细胞悬液，应用Trizol方法获得全基因组DNA。全基 因组DNA通过超声破碎获得寡脱氧核糖核酸。最后通过argrose分选出100pb-1000bp的 寡脱氧核糖核酸。
[0010] DNA探针的生物素标记反应体系为：
[0011]
【权利要求】
1. 一种自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述分选材料包括生物素铰链的 dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠。
2. 权利要求1所述的自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述的生物素铰链的 dsDNA为DNA通过3'端与生物素铰链。
3. 权利要求1所述的自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述的dsDNA为大小 不同的寡脱氧核糖核酸。
4. 权利要求1所述的自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述的链亲和素化的 免疫磁珠为链亲和素共价键铰链的免疫磁珠。
5. 权利要求1-4中任意一项所述的细胞分选材料，其特征在于，生物素铰链的dsDNA和 链亲和素化的免疫磁珠质量体积比（μ g/ul)为0. 5?10 : 1。
6. 权利要求1-4中任意一项所述的细胞分选材料，其特征在于，生物素铰链的dsDNA和 链亲和素化的免疫磁珠的质量比为1 : 4。
7. 权利要求3所述的细胞分选材料，其特征在于，所述的大小不同的寡脱氧核糖核酸 为 100pb-1000pb dsDNA。
8. 权利要求1-4所述的细胞分选材料，其特征在于，所述的大小不同的寡脱氧核糖核 酸为100pb-1000pb dsDNA还包括其它的抗原分子如ssDNA等。
9. 权利要求1-4中任意一项所述的细胞分选材料，在分选自身免疫性疾病中自身反应 性B细胞的应用。
10. 权利要求8所述的自身免疫性疾病，其特征在于，所述的自身免疫性疾病为自身抗 体相关的免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮、重症肌无力、干燥综合症。
11. 权利要求1-4中任意一项所述的自身免疫性B细胞分选方法，其特征在于，所述分 选方法所分选出的自身免疫性B的临床应用。
【文档编号】C12Q1/04GK104232577SQ201310244248
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月20日 优先权日:2013年6月20日
【发明者】王仁喜, 黎燕, 肖鹤, 韩根成, 陈国江, 侯春梅, 沈倍奋, 马宁, 邢陈 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所