一种连续制备他汀药物中间体(r)-3-羟基戊二酸乙酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种连续制备他汀药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，包括以下工艺步骤：第一步(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）在含有重组卤醇脱卤酶（HHDH）的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，第二步(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在重组腈水解酶（NIT）的催化下生成(R)-3-羟基戊二酸乙酯，所述的两个反应步骤均在反应罐中的水溶液中催化反应；本发明通过两步耦联生物催化反应，采用特定的卤醇脱卤酶和腈水解酶，连续催化制备他汀类药物的关键中间体，两步串联的连续绿色催化反应，无需提出中间体即可进行下一步反应，可连续操作、设备利用率高、成本低、简便易操作。
【专利说明】一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及有机药物合成领域，具体涉及一种两步生物催化耦联制备他汀药物中 间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法。
【背景技术】
[0002] 他汀类药物已是世界上销量最大，疗效稳定的降脂类药物。其中最有代表性的是 阿托伐他汀（Atorvastatin)和瑞舒伐他汀（Rosuvastatin),前者是世界上首款销售额突 破百亿美金的药物，而后者则是迄今为止降脂效果最好的他汀类药物，又被成为"超级他 汀"。瑞舒伐他汀由阿斯利康公司开发（英文商品名Crestor)，于2002年11月首次在荷兰 获批，2003年8月通过美国FDA上市审批，2011年在全球销售额66.2亿美元。（R)-3-羟 基戊二酸乙酯是合成瑞舒伐他汀的重要手性前体。
【权利要求】
1. 一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，包括以 下工艺步骤：第一步（S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯（（S)-CHBE)在含有重组卤醇脱卤酶（HHDH) 的催化下生成（R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，第二步（R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在重 组腈水解酶（NIT)的催化下生成（R)-3-羟基戊二酸乙酯，所述的两个反应步骤均在反应罐 中的7iC溶液中偶化皮应。
2. 根据权利要求1所述的一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述的制备装置包括反应罐1和反应罐2,反应罐中设有搅拌装置，反应罐 1和反应罐2通过带有流量调节阀的管路相连接，反应罐1上设有底物添加管路，pH控制管 路和重组卤醇脱卤酶添加管路，反应罐2上设有重组腈水解酶添加管路和产物出口管。
3. 根据权利要求1和2所述的一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，所述的制备方法为： 1) 以（S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯为底物加入含氰化钠水溶液的的反应罐1中，接着加 入重组卤醇脱卤酶进行催化反应；重组卤醇脱卤酶的用量为底物质量的2%?15% (w/w)， 氰化钠的用量为底物质量的5%?20% (w/w);所述反应在pH为6. O?8. O的水相中进行， 反应体系的温度为40?55°C ;当通过气相色谱法测得混合液体中的底物转化率大于95% 时,开始通过添加管路流加底物（S)-CHBE和卤醇脱卤酶液，同时打开两个反应罐间的流量 调节阀，保持反应罐1中的反应体积不变； 2) 在反应罐2中起始加入腈水解酶缓冲液到最低搅拌叶处，调节反应温度至25? 30°C，当从反应罐1中开始流出含中间体（R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的反应液时，同时 以反应罐2中加入腈水解酶粗酶液；腈水解酶粗酶液的用量为底物质量的20%?60% ;液 收集反应罐2产物出口管流出的反应液，调节反应液pH至2. 0,硅藻土过滤除酶，等体积乙 酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，无水硫酸钠除水，旋蒸，即得产品（R)-3-羟基戊二酸已 酯。
4. 根据权利要求2和3所述的一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，所述从反应罐1流向反应罐2的速率为反应体系流加速率，所述反应 罐1中底物流加速率、卤醇脱卤酶液、氰化钠溶液流加速率三者之和等于反应体系流加速 率。
5. 根据权利要求3所述的一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述反应罐1中的氰化钠溶液通过磷酸调节反应体系的pH值；反应罐1中 优选的pH为6. 8?7. 2,反应温度为48?50°C。
6. 根据权利要求3和4所述的一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，反应罐1中底物的流加速率为反应体系流加速率的1%?5%，卤醇脱卤 酶液的流加速率为反应体系流加速率的5%?25% ;反应罐2中腈水解酶粗酶液的流加速率 为反应体系流加速率的〇. 5%?2%。
7. 根据权利要求3所述的一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述的卤醇脱卤酶液按粗酶液：去离子水=1 :60的比例配制。
8.根据权利要求3和所述的一种连续制备他汀药物中间体（R)-3-羟基戊二酸乙酯的 方法，其特征在于，所述的含有重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的制备方法为：将含有 重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT基因的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素 抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得 到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振 荡培养，培养至OD 6tltl值达到0. 8?1. 2时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG) 至终浓度ImM，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水 清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2?8倍体积的三乙醇胺缓冲液（2mM，pH7. 0)悬浮细 胞；细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟；1：下15000g离心30min，取上清液，得 重组卤醇脱卤酶HHDH和腈水解酶NIT的粗酶液。
【文档编号】C12P7/62GK104372040SQ201310348620
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】陈令伟 申请人:南京朗恩生物科技有限公司