一种全细胞催化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物，利用生物催化剂在以异丙醇为氢供体的条件下，然后加入CaCl2、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌，在pH为6.0～8.0的水相中不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；利用细胞本身的辅酶再生体系，无需添加外源性的辅酶，解决了传统生物法中催化效率低以及成本高的问题，该方法反应条件温和、反应效率高、操作简便，特别是催化反应过程不用加还原性辅酶因子，大大提高了效率和降低了反应的成本，具有广阔的工业生产应用前景。
【专利说明】一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物合成领域，尤其涉及一种全细胞催化制备（S) -4-氯-3-羟基丁酸 乙酯的方法。
【背景技术】
[0002] (S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯（（S)-CHBE)是一种重要的有机合成中间体，可用于 很多活性药物的合成，如他汀类降血脂药HMG-CoA还原酶抑制剂类、Slagenins B和C以及 P-1，4-二氢吡啶型钙离子通道阻断剂等。他汀类药物是目前最畅销的降血脂类药物，随着 阿托伐他汀专利的到期，市场对其中间体（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯的需求量会进一步加 大。
[0003] 以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)为底物合成（S)-CHBE是非常有效经济的制备途径， COBE易于合成且价格低廉。目前关于COBE不对称手性还原制备（S)-CHBE以进行了很多的 研究报道，概括起来主要有化学法和生物法。化学法催化的不对称还原，所用的催化剂包括 铑、钌等昂贵金属，最关键的是采用化学法合成的（S)-CHBE立体选择性不够高，催化还原 反应需要很高的氢气压，耗能高，污染尤其严重，对环境影响很大。
[0004] 生物法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点被广泛 地研究和应用。中国发明专利申请例如申请号200810124754. 2、201010213724. 6、 201110225388. 1等公开了数种酮还原酶生产（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，然 而这些方法的酶和辅因子用量较高，并需要添加葡萄糖作为氢供体。国内专利申请号 201210465009. 0公开了一种异丙醇作为氢供体的催化方法，所用的为酮还原酶冻干粉，酶 冻干粉的生产成本较高，而且在反应中也需加入价格昂贵的辅因子，反应体系中添加了有 机溶剂，不仅成本较高，不符合绿色化学催化的理念。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种反应步骤简单、成 本较低、产品光学纯度高、的（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种全细胞催化制备 (S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，利用生物催化剂 在以异丙醇为氢供体的条件下，在水相中不对称还原反应生成（S)-4_氯-3-羟基丁酸乙 酯，所述不对称还原反应在pH为6. 0?8. 0的水相缓冲液中进行，在反应容器中加入配 制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物C0BE、异丙醇、CaCl2、重组酮还原酶的大肠杆菌 全细胞，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法检测反应进程，至转化率达到 80 %?100%，分批加入底物C0BE;继续进行反应，至反应转化率达到95%?100 %时结束 反应，加入二氯甲烷多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙 酯；本发明的催化方法绿色无污染，无需添加有机溶剂和还原性辅因子，效率高、成本低、步 骤少，简便易操作。
[0007] 本发明所述的底物COBE和其他基本的化学试剂由市售购得，所述的含有重组酮 还原酶的大肠杆菌由本公司专利201310345823. 3中所制得。
【权利要求】
1. 一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸 乙酯（COBE)为底物，利用生物催化剂在以异丙醇为氢供体的条件下，在水相中不对称还原 反应生成（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于：所述不对称还原反应在pH为6. 0? 8. 0的水相缓冲液中进行，在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底 物COBE、异丙醇、CaCl2、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25°C?40°C下搅拌反应， 利用气相色谱方法检测反应进程，至转化率达到80 %?100%，分批加入底物COBE ;继续进 行反应，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入二氯甲烷多次萃取，合并有机相 并蒸发脱去溶剂，即得（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
2. 根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其 特征在于，所述含有重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备方法为： 1) 将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养 基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时； 2) 将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇 床180-220rpm振荡培养，培养至0D6(I(I值达到0. 8?1. 2时，加入诱导剂，于22?32°C下继 续培养16?20小时； 3) 培养完成后在4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体两遍，再次离心收集菌体 即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。
3. 根据权利要求1和所述的一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的反应体系中底物COBE的终浓度为20%?30% (w/v)，重组酮还原酶的 大肠杆菌细胞的用量为底物质量的1.0%?4.0% (w/w)，异丙醇的浓度为8%?13% (w/ v)。
4. 根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述的水相缓冲液浓度为50?200mM， pH6. 2 ?6. 8。
5. 根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其 特征在于，所述的反应体系中所用的为CaCl2，浓度为2. 0-20mM。
6. 根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述底物COBE根据反应情况分1?5批补加，每批次补加量为反应体积的 3%-15%。
7. 根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的诱导剂为异丙基-0 -D-硫代半乳糖苷（IPTG)，其诱导终浓度为0. 2? 1. OmM。
【文档编号】C12P7/62GK104372041SQ201310348621
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】陈令伟 申请人:南京朗恩生物科技有限公司