一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，该方法包括菌种培养、种子罐培养、发酵罐培养等工序，高效生产羟基类固醇脱氢酶。该酶对作物有显著的防病、促生长、增产功能。同时，将羟基类固醇脱氢酶作为一种新型的饲用酶制剂应用到畜牧业的养殖方面，能有效促进猪、肉鸡的生长，提高蛋鸡产蛋率，减少畜禽疾病，促生长效果显著。本发明的方法中，发酵液中的活菌体由原来的每毫升一亿个提高到三百亿个，酶活由原来的每克干粉中1000个酶活上升到现在的每克干粉30万个酶活，大大降低了生产成本，可进入工业化生产。
【专利说明】一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法。
【背景技术】
[0002]任何植物个体，都是由植物自身的组织细胞与其体内外酶、微生物的组合体，也就是说酶及微生物本身就是植物中的一部分，其中酶在生命活动中起着非常重要的作用，酶能在常温常压下催化各种生化反应，产生多种抗生素、促生长激素，活化土壤释放大量的微量元素，能增加植物的主干根和毛细根数量，拓宽养分的输送管道，让作物合理平衡吸收养料，促进作物生长、早熟、增收、增强抗逆性、抗病性、抗旱涝等。要是没有这些酶，作物就不倉tH。
[0003]我国是一个农业大国，每年由农作物病虫害造成的经济损失巨大，农作物重茬病害也是农业生产中最严重的病害之一，为了防治病虫害导致化学农药的滥用，结果病虫对化学农药的抗药性越来越强，农药的施用量越来越大，浓度越来越高，病害越来越难治，再加上有机肥料使用逐年减少，化学肥料过度使用，造成土壤板结，化学药物、激素、亚硝酸盐等有害物质严重超标，生态环境也遭到了极大破坏，环境污染也越来越严重，不但人畜中毒事件频频发生，而且也造成了农作物的抗病能力大大下降，导致作物减产，农产品的品质受到极大影响，严重削弱了我国农产品在国际市场的竞争力，随着我国农产品出口量日益增加，人民生活水平的不断提高，不论是国内还是国际市场，对农产品产质产量要求越来越严格，对绿色农产品生产提出了更高的要求。
[0004]土壤是由矿物质、有机质和微生物三大部分组成，是农作物生长发育的基础，土壤中的酶及微生物直接参与土壤中物质和能量转化，采用人为方式向土壤中增加有益酶及微生物、数量，就能够增强土壤中的酶活性，从而提高土壤肥力。
[0005]目前土壤的自毒现象比较严重，自毒现象就是指在前茬作物的残留体在腐烂分解过程中会产生一些毒素，如:醛、醇、烃类，还有积累的药物残留及留体激素等，对下茬作物有显著的抑制作用，影响作物的自身生长，加上土壤病原微生物的大量繁殖，数量逐年上升，由于幼苗抵抗能力弱，易于染病，营养元素的亏缺或失衡，土壤营养元素呈现生理性不平衡，直接造成作物营养平衡失调，作物根部腐烂，根系不发达，影响作物的正常生理代谢，造成作物大面积减产甚至绝收。
[0006]根据以上所存在的技术问题，本发明经多年研究，成功的开发出一种新型农用酶制剂，羟基类固醇脱氢酶，根据实验结果证明，该酶对作物有显著的防病、促生、增产功能。此外，酶是一种生物催化剂，自然中一切生命现象都与酶的活动有关系，酶产品在养殖业中的应用正在进入快速发展阶段，逐渐成为畜牧养殖业新技术革命的主要方向和效益提升的关键。随着中国经济的持续快速发 展，农业现代化进程的不断扩大，势必会大大增加酶产品的市场需求。本发明抓住这一机遇，发挥自身的研究优势，将羟基类固醇脱氢酶作为一种新型的饲用酶制剂应用到畜牧业的养殖方面，经多批次试验证明，该酶能有效促进猪、肉鸡的生长，提高蛋鸡产蛋率，减少畜禽疾病，促生长效果显著。
【发明内容】
[0007]为克服上述技术问题，本发明提供一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其包含如下步骤:
配制LB培养基:将10克蛋白胨，5克酵母浸粉和5克氯化钠不分前后顺序投入到1000毫升水中，PH值自然,搅拌溶解后分装于多个直径25mm,长度200mm的试管中，每个试管中装5毫升，将所述多个试管放医用消毒器中，采用0.12-0.14兆帕灭菌20分钟；
接种:在无菌条件下打开冻干管睾丸酮丛毛单胞菌种，然后向所述冻干管睾丸酮丛毛单胞菌种里面加入以上灭菌好的LB培养基I毫升，摇动溶化后制得冻干管菌悬液备用，然后取上面灭好菌的培养基5毫升，在无菌条件下打开试管，并向试管中加入所述冻干管菌悬液0.3毫升，重新将试管密封好，放摇瓶机中摇动制得扩大菌种液；
一级种子培养:
一级种子培养基配方中各组分的重量百分比为:
酵母浸粉 0.15%—0.25% 蛋白胨 0.25%—0.45% 氯化钠 0.1% — 0.3%
植物甾醇 0.01%—0.15% 维生素 D3 0.01%—0.15% 硫酸铵 0.25%—0.5%
余量为水PH值自然
将所述一级种子培养基配方`中的各原料不分前后顺序的加入所述一级种子培养基配方的水中，开动搅拌机搅拌制得一级种子培养液；将所述一级种子培养液量取所用量加入到三角瓶中，封口后灭菌，将装有经过灭菌的培养液的三角瓶放超静工作台中降温，当温度降到27-31°C时，在无菌条件下将所述培养好的扩大菌种液接到三角瓶中去，100毫升一级种子培养液接入的扩大菌种液为2毫升，完毕后放摇瓶机中，制得一级菌种液；
将发酵设备的管道、无菌空气过滤系统进行灭菌处理，以及将种子罐及发酵罐进行空罐灭菌处理；
种子罐培养:
种子罐培养基配方中各组分的重量百分比为:
酵母浸粉0.1%—0.4% 蛋白胨0.2%—0.5% 氯化钠0.15%—0.3%
植物甾醇0.1%—0.3% 维生素D3 0.02%—0.2% 硫酸铵0.2%—0.6%
余量为水PH值自然
将所述种子罐培养基配方中的各原料不分前后顺序的加入所述种子罐培养基配方的水中，经过高温灭菌及降温处理后，将所述培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到经灭菌处理的种子罐中，100公斤种子罐培养基接入所述一级菌种液的量为I公斤，然后盖好罐上的接种帽，通过无菌通风培养制得种子罐菌种液；
发酵罐培养:
发酵罐培养基配方中各组分的重量百分比为:
酵母浸粉0.1%—0.3% 蛋白胨0.15%—1.5% 氯化钠0.1%—0.5%
植物甾醇0.1%—0.4% 维生素D3 0.01%—0.1% 硫酸铵0.2%—0.7%
维生素E 0.01%—0.15%余量为水PH值自然
首先将所述发酵罐培养基配方中的水投入到经灭菌处理的发酵罐中，然后开动搅拌机，向发酵罐中不分前后顺序的加入所述发酵罐培养基配方中的各原料，经过高温灭菌及降温处理后，接入菌种，开始发酵培养；
羟基类固醇脱氢酶的破壁提取:
首先采用管式离心机，8000-16000转/每分钟，控制流量每小时1000公斤，弃上清，收集湿菌体；然后将收集的湿菌体按I公斤湿菌体加水3-10公斤，搅拌均匀制成菌悬液，再加入总重量为0.01-0.1%的溶菌酶和0.02-0.2%的蜗牛酶，在4°C一35°C的条件下搅拌I小时，然后放入-40°C冰冻，直至结冰冻实为止，取出后溶化冰，然后再放入-40°C结冰，这样反复3-6次即可达到破壁提取所述羟基类固醇脱氢酶的最佳效果。
[0008]该酶具备的功能与特性
1、该酶是一个酶系的组成，能将土壤中的有机成分转化分解成有机质、分解氮化合物，能将有机质中的蛋白质、脂肪、核酸等物质再分解为植物极易吸收的氨基酸、脂肪酸、多肽等，提高作物吸收养分的能力，促进植物生长。
[0009]2、促进作物体内酶的合成，按作物的生长需要制造养分，有效抑制病原菌，使土壤根际微生物恢复平衡，从而达到抑制有害菌，防病，健株，增产的效果。
[0010]3、提高作物体内多种酶的活性，使作物新陈代谢旺盛，糖分，干物质积累增加，增强作物抗病能力，大幅提高作物产量和品质。
[0011]4、促使有益微生物在作物根部繁殖，从而活化土壤，使土壤养分转化，释放增加土壤的有效成分，提高肥料利用率和土壤肥力，防止土壤板结，改善根际环境，分解农药残留，酚、激素、烃类，抑制腐霉菌、镰刀菌、线虫等病害的发生。
[0012]5、能快速促进作物根际`细胞分裂，生新根，增加根量，提高根系活力，形成强壮根系，并有显著的生根，养根，保根效果，有效解决烂根，生根缓慢，使作物生长健壮。
[0013]6、羟基类固醇脱氢酶系可促进作物增殖过氧化氢酶和几丁质酶，过氧化氢酶是一种保护性酶，对植物抗病起积极的作用，可使作物感病后整体获得抗病性，几丁质酶可分解真菌、细菌细胞壁中的几丁质，使真菌、细菌细胞壁被分裂而死亡，几丁质还可活化作物细胞，启动作物免疫系统，极大的增强作物对外界不良环境的抵御能力。
[0014]7、刺激有机质释放营养，丰富的有机质是通过酶活动后，可不断释放出植物所需要的营养元素，达到肥效持久的目的，松土保肥，改善环境，达到肥力持久等显著效果。
[0015]技术先进性:
一、睾丸酮丛毛单胞菌是人体、动物体、土壤中存在的菌，(属胞内酶)羟基类固醇脱氢酶，具有降解许多难以降解化合物的能力，我们多年研究发现，该菌所产生的酶系，能强力分解动、植物蛋白质、留体激素，烃类、苯酚、壬基酚等有害物质，我们在实验中发现羟基类固醇脱氢酶能显著改良土壤与微生物结构，促进农作物生长，是一种理想抗作物重茬，防土壤板结，土壤通气性好，增产的新型酶制剂。
[0016]二、羟基类固醇脱氢酶在农业上具有很高的应用价值，但是该菌中的酶对污染物及相应底物的消化降解，转化，速度很缓慢，限制了该菌(酶)在土地生物修复，如果单靠自然界中该菌繁殖量十分有限，因此产酶稀少，很难发挥作用，因此开发羟基类固醇脱氢酶具有长远的经济效益和社会效益。
[0017]三、要真正使羟基类固醇脱氢酶发挥显著效果，首先要对发酵菌种的培养基、培养条件、发酵培养基、酶的提取等一系列技术进行深入研究，否则是不会产生效果的，因该菌是野生型菌株，所产的酶属胞内低温酶系，要想得到有效、有价值、低成本的酶，首先要看发酵液中活的菌体是多少，利用原野生菌种发酵后，每毫升发酵中只有一亿个活菌，本发明经多年不间断的努力，千次培养实验，发酵液中的活菌体由原来的每毫升一亿个提高到三百亿个，提高了三百倍，我们选用了近100种该酶降解底物，最后反复筛选出三种底物能全面诱导该酶系酶大幅提高，由原来的每克干粉中1000个酶活上升到现在的每克干粉30万个酶活，大大降低了生产成本，可进入工业化生产，这是我们从各种培养基的研究，发酵PH值，灭菌时间，原材料配比，接种量，发酵时间，发酵罐转速，通风量(因是好氧菌)等，进行了全面探索、研究的成果。
[0018]四、生产该酶所使用的菌种市售可得菌号:ATCC11996
五、生产所使用的设备:发酵罐、管式离心机、粉碎机、预混合机、真空干燥箱、真空冷冻干燥机、生化培养箱、摇床、超净工作台、鼓风干燥箱、医用压力消毒器【专利附图】
【附图说明】
无。
【具体实施方式】
[0019]本发明的一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其包含如下步骤:
菌种培养:
购进菌种的扩大培养，首先配置LB培养基、蛋白胨10克，酵母浸粉5克、氯化钠5克、水1000毫升，PH值自然
操作:将以上蛋白胨等原料不分前后顺序投入到配方中的水中搅拌溶解后分装于多个直径25mm，长度200mm的试管中，每管装5毫升，放医用消毒器中0.12—0.14兆帕灭菌20分钟，培养基灭菌完毕
接种:在无菌条件下打开购进的冻干管菌种，然后向里面加入以上灭菌好的培养基I毫升，摇动溶化后备用，此称为冻干管菌悬液，然后取上面灭好菌的培养基5毫升，在无菌条件下打开试管，然后向试管中加入溶化好的冻干管菌悬液0.3毫升，重新将试管密封好，放摇瓶机中，27-31 °C，150-210转/分钟，8_40小时即可，此称扩大菌种液一、一级种子培养:
配方:培养基各组分的重量百分比
酵母浸粉 0.15%—0.25% 蛋白胨 0.25%—0.45% 氯化钠 0.1% — 0.3%
植物甾醇 0.01%—0.15% 维生素 D3 0.01%—0.15% 硫酸铵 0.25%—0.5%
余量为水PH值自然
操作:
将上述原料称好后不分 前后的倒入配方中的水中，开动搅拌机搅拌20分钟，此称为一级种子培养液
将搅拌好的一级种子培养液量取所用量加入到三角瓶中，然后8层纱布外加一层牛皮纸扎口，放入医用高压锅中灭菌，灭菌前首先打开消毒器上的排气阀，等有少量蒸汽排出时关闭，当消毒器压力达到0.05兆帕时，打开排气阀门排气6-8分钟，然后关闭排气阀门，继续加温，当消毒器中蒸汽压力达到0.12-0.14兆帕时开始计时，灭菌时间20分钟，完毕后让其自然降温，当消毒器上的压力表归零时，打开消毒器，取出灭菌的培养基，将装有培养基的三角瓶放超静工作台中降温，当温度降到27-31°C时，在无菌条件下将上述培养好的扩大菌种液接到三角瓶中去，接种量为2%为宜，即一级种子培养液100毫升,扩大菌种液为2晕升，完毕后放摇瓶机中温度27-31°C、150-210转/每分钟，6_20小时即可，此称为一级菌种液。
[0020]发酵设备的管道及无菌空气过滤系统的灭菌
操作:打开各进出管道的阀门及无菌空气管道阀门，通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，让蒸汽与管道阀门联通并有蒸汽排出，通气10分钟，然后关闭各排气阀门，让管道内蒸汽压力保持0.12-0.14兆帕，保持40分钟。
[0021]种子罐及发酵罐的空罐灭菌
关闭各个阀门，打开罐夹层的排污阀门，打开直接蒸汽阀门向罐内通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，当罐内达到121°C 土1°C时开始计时，灭菌时间为40分钟，然后关闭罐底部排污阀，罐中温度降到25°C _35°C之间备用。
[0022]种子罐培养:
配方:培养基各组分的重量百分比
酵母浸粉0.1%—0.4% 蛋白胨0.2%—0.5% 氯化钠0.15%—0.3%
植物甾醇0.1%—0.3% 维生素D3 0.02%—0.2% 硫酸铵0.2%—0.6%
余量为水PH值自然
具体操作:
首先将配方中所使用的水投入到已灭菌的种子罐中，然后开动搅拌机，分别加入配方中所需的原料(加入顺序不分前后)，通入蒸汽加热，利用夹层蒸汽加热到95°C时，再改用直接蒸汽加热，当罐中蒸汽压力达到0.12-0.14兆帕时，保温35分钟达到灭菌效果，然后关闭蒸汽，开始降温，当罐中温度降到27-31°C时备用，此称为种子罐培养。将以上培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到种子罐中，接种量是罐内培养基的1%，即100公斤种子罐培养基接入一级菌种液I公斤，然后盖好罐上的接种帽，开始无菌通风培养，无菌空气用量为每100公斤种子培养基每分钟用无菌空气0.05立方，PH值自然，搅拌速度140转/每分钟，罐压0.05兆帕，温度30°C，培养时间10小时即可，此称为种子罐菌种液发酵罐培养
配方:培养基各组分的重量百分比
酵母浸粉0.1%—0.3% 蛋白胨0.15%—1.5% 氯化钠0.1%—0.5%
植物甾醇0.1%—0.4% 维生素D3 0.01%—0.1%硫酸铵0.2%—0.7%
维生素E 0.01%—0.15% 余量为水PH值自然
具体操作:
首先将配方中所需用的水投入到已灭菌的发酵罐中，然后开动搅拌机，向发酵罐中投入配方中的各种材料(加入顺序不分前后)，然后通入蒸汽加热，利用夹层蒸汽加热到95°C后再改用直接蒸汽加热，当罐中蒸汽压力达到0.12-0.14兆帕时，保温25分钟即可达到灭菌效果，然后开始降温，当罐中温度降至30°C时，开始接入菌种，接种时首先提高种子罐的罐压力，达到0.1兆帕，发酵 罐压力维持在0.05兆帕，然后打开接种管道的阀门，将种子罐培养好的菌液输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门开始发酵培养，培养条件:温度27-31°C、80-140转/每分钟，通风量每100公斤培养液每分钟通入无菌空气，前5小时0.07立方米，5小时至发酵完毕是0.1立方米，PH值自然，发酵时间为16-24小时结束。
[0023]离心收集菌体:
采用管式离心机，8000-16000转/每分钟，控制流量每小时1000公斤，弃上清，收集湿菌体(泥)
羟基类固醇脱氢酶的破壁提取:
将收集的湿菌体(泥)按I公斤湿菌体加水5公斤，搅拌均匀制成菌悬液，然后加入总重量0.01%溶菌酶和0.02%的蜗牛酶，在4°C一35°C的条件下搅拌I小时，然后放入_40°C冰冻，直至结冰冻实为止，取出后溶化冰，然后再放入_40°C结冰，这样反复3-6次即可达到破壁提取的最佳效果。
[0024]羟基类固醇脱氢酶的冷冻干燥
向破壁的酶液中加入3-10%的海藻糖、8-20%脱脂奶粉、3-6%的丙三醇、1.5-5%的维生素C、3-10%的麦芽糊精(加入顺序不分前后)，在80-160转/每分钟的条件下搅拌I小时，然后分装到冷冻干燥盘中预冻，预冻温度_40°C，时间5小时，全部结冰冻实为止，然后抽真空干燥，真空度15帕以下,温度_65°C,冻干时间一般在40—50时之间即可,水分含量3%_5%，然后用低温粉碎机粉碎，细度60-80目，然后将收集粉碎好的冻干酶粉用塑料袋密封好，放入4°C冰箱中保存，现用现配。
[0025]上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变`型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
【权利要求】
1.一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其特征在于包含如下步骤: 配制LB培养基:将10克蛋白胨，5克酵母浸粉和5克氯化钠不分前后顺序投入到1000毫升水中，PH值自然,搅拌溶解后分装于多个直径25mm,长度200mm的试管中，每个试管中装5毫升，将所述多个试管放医用消毒器中，采用0.12-0.14兆帕灭菌20分钟； 接种:在无菌条件下打开冻干管睾丸酮丛毛单胞菌种，然后向所述冻干管睾丸酮丛毛单胞菌种里面加入以上灭好菌的LB培养基I毫升，摇动溶化后制得冻干管菌悬液备用，然后取上面灭好菌的培养基5毫升，在无菌条件下打开试管，并向试管中加入所述冻干管菌悬液0.3毫升，重新将试管密封好，放摇瓶机中摇动制得扩大菌种液； 一级种子培养: 一级种子培养基配方中各组分的重量百分比为: 酵母浸粉 0.15%—0.25% 蛋白胨 0.25%—0.45% 氯化钠 0.1% — 0.3% 植物甾醇 0.01%—0.15% 维生素 D3 0.01%—0.15% 硫酸铵 0.25%—0.5% 余量为水PH值自然 将所述一级种子培养基配方中的各原料不分前后顺序的加入所述一级种子培养基配方的水中，开动搅拌机搅拌制得一级种子培养液；将所述一级种子培养液量取所用量加入到三角瓶中，封口后灭菌，将装有经过灭菌的培养液的三角瓶放超静工作台中降温，当温度降到27-31°C时，在无菌条件下将所述培养好的扩大菌种液接到三角瓶中去，100毫升一级种子培养液接入的扩大菌种液为2毫升，完毕后放摇瓶机中，制得一级菌种液； 将发酵设备的管道、无菌空气过滤系统进行灭菌处理，以及将种子罐及发酵罐进行空罐灭菌处理； 种子罐培养: 种子罐培养基配方中各组分的重量百分比为: 酵母浸粉0.1%—0.4% 蛋白胨0.2%—0.5% 氯化钠0.15%—0.3% 植物甾醇0.1%—0.3% 维生素D3 0.02%—0.2% 硫酸铵0.2%—0.6% 余量为水PH值自然 将所述种子罐培养基配方中的各原料不分前后顺序的加入所述种子罐培养基配方的水中，经过高温灭菌及降温处理后，将所述培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到经灭菌处理的种子罐中，100公斤种子罐培养基接入所述一级菌种液的量为I公斤，然后盖好罐上的接种帽，通过无菌通风培养制得种子罐菌种液； 发酵罐培养: 发酵罐培养基配方中各组分的重量百分比为: 酵母浸粉0.1%—0.3% 蛋白胨0.15%—1.5% 氯化钠0.1%—0.5% 植物甾醇0.1%—0.4% 维生素D3 0.01%—0.1% 硫酸铵0.2%—0.7% 维生素E 0.01%—0.15%余量为水PH值自然 首先将所述发酵罐培养基配方中的水投入到经灭菌处理的发酵罐中，然后开动搅拌机，向发酵罐中不分前后顺序的加入所述发酵罐培养基配方中的各原料，经过高温灭菌及降温处理后，接入菌种，开始发酵培养； 羟基类固醇脱氢酶的破壁提取:首先采用管式离心机，8000-16000转/每分钟，控制流量每小时1000公斤，弃上清，收集湿菌体；然后将收集的湿菌体按I公斤湿菌体加水3-10公斤，搅拌均匀制成菌悬液，再加入总重量为0.01-0.1%的溶菌酶和0.02-0.2%的蜗牛酶，在4°C一35°C的条件下搅拌I小时，然后放入-40°C冰冻，直至结冰冻实为止，取出后溶化冰，然后再放入_40°C结冰，这样反复3-6次即可达到破壁提取所述羟基类固醇脱氢酶的最佳效果。
2.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述扩大菌种液是在27-31°C的温度下，采用150-210转/分钟的转速，在摇瓶机中摇动8-40小时制得。
3.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述一级种子培养液的灭菌，是将所述一级种子培养液放入医用高压锅中灭菌，灭菌前首先打开消毒器上的排气阀，等有少量蒸汽排出时关闭，当消毒器压力达到0.05兆帕时，打开排气阀门排气6-8分钟，然后关闭排气阀门，继续加温，当消毒器中蒸汽压力达到0.12-0.14兆帕时开始计时，灭菌时间20分钟，完毕后让其自然降温，当消毒器上的压力表归零时，打开消毒器，取出灭菌后的培养液。
4.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述一级菌种液是在27-31°C的温度下，采用摇瓶机在150-210转/每分钟的转速下，摇动6-20小时制得。
5.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述发酵设备的管道及无菌空气过滤系统的灭菌是通过:打开各进出管道的阀门及无菌空气管道阀门，通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，让蒸汽与管道阀门联通并有蒸汽排出，通气10分钟，然后关闭各排气阀门，让管道内蒸汽压力保持0.12-0.14兆帕，保持40分钟。
6.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述种子罐及发酵罐的空罐灭菌是通过:关闭各个阀门，打开罐夹层的排污阀门，打开直接蒸汽阀门向罐内通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，当罐内达到121°C ±1°C时开始计时，灭菌时间为40分钟，然后关闭罐底部排污阀，罐中温度降到25°C _35°C之间备用。
7.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述种子罐培养程序中的高温灭菌及降温处理，是:通入蒸汽加热，利用夹层蒸汽加热到95°C时，再改用直接蒸汽加热，当罐中蒸汽压力达到0.12-0.14兆帕时，保温35分钟达到灭菌效果，然后关闭蒸汽，开始降温，当罐中温度降到30°C时备用。
8.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述通过无菌通风培养制得种子罐菌种液的过程中，无菌空气用量为每100公斤种子培养基每分钟用无菌空气0.05立方，PH值自然，搅拌速度80-180转/每分钟，罐压0.05兆帕，温度27-31°C，培养时间6-20小时。
9.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述发酵罐培养步骤中的高温灭菌及降温处理是:通入蒸汽加热，利用夹层蒸汽加热到95°C后再改用直接蒸汽加热，当罐中蒸汽压力达到0.12-0.14兆帕时，保温25分钟即可达到灭菌效果，然后开始降温，当罐中温度降至27-31°C时。
10.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述发酵罐培养步骤中，所述接入菌种的过程为:接种时首先提高种子罐的罐压力，达到0.1兆帕，发酵罐压力维持在0.05兆帕，然后打开接种管道的阀门，将种子罐培养好的菌液输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门。
11.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述发酵培养的培养条件为:温度27-3--、80-140转/每分钟，通风量每100公斤培养液每分钟通入无菌空气，前5小时0.07立方米，5小时至发酵完毕是0.1立方米，PH值自然，发酵时间为16-24小时结束。
12.如权利要求1-11任一权利要求所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中羟基类固醇脱氢酶的冷冻干燥方法为，向破壁的羟基类固醇脱氨酶液中不分前后顺序的加入重量比为3-10%的海藻糖、8-20%的脱脂奶粉、3-6%的丙三醇、.1.5-5%的维生素C和3-10%的麦芽糊精，在80-160转/每分钟的条件下搅拌I小时，然后分装到冷冻干燥盘中预冻，预冻温度_40°C，时间5小时，全部结冰冻实为止，然后抽真空干燥，真空度15帕以下,温度_65°C,冻干时间一般在40—50小时之间即可,水分含量3%_5%，然后用低温粉碎机粉碎，细度60-80目，然后将收集粉碎好的冻干酶粉用塑料袋密封好，放入4°C冰箱中保存，现用现配。
【文档编号】C12R1/01GK103805577SQ201310353000
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】张起凡 申请人:济南环亿生物科技有限公司