microRNA的测序试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物领域，特别涉及核酸的检测技术，具体为microRNA的测序方法，根据靶位点设计待测microRNA的特异性的扩增引物和待测microRNA的焦磷酸测序引物，所述扩增引物的其中一条引物被生物素标记；提取待测样本的DNA，用设计的所述扩增引物进行PCR扩增反应，得扩增引物，其中，所述特异性扩增引物中的任一条用生物素标记；将所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与所述测序引物进行杂交反应，并分析结果;本发明所选取的microRNA靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测microRNA基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于microRNA基因检测预测疾病的发生、发展风险。
【专利说明】microRNA的测序试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及适用于二重PCR及二重焦磷酸测序法检测microRNA基因多态性的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]microRNA是一类进化高度保守、内源性表达、单链非编码、长约18_25个核苷酸(nucleotide nt)的小 RNA 分子。microRNA 通过与祀分子 mRNA 序列 3’-UTR、5’UTR及开放阅读框互补匹配引起靶分子mRNA降解或翻译抑制，调控着人类功能基因的表达和活性。microRNA是重要的转录后调节因子，在细胞增殖、分化与凋亡、应激抵抗、脂肪代谢等生理过程中发挥重要作用，microRNA表达失衡参与各种疾病的发生发展过程。其基因多态性影响着自身及邻近microRNA表达、二级结构和与靶基因作用能力(RNA2009, 15(9): 1640-1651)，是引起个体及种族间疾病发生发展差异性的原因之一。
[0003]众多研究表明miCToRNA基因多态性影响着肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病的发生、预后风险。如has-miR-146a rs2910164G — C增加乳腺癌(PLoS0ne2012,7(2):e31615)、肝癌(Carcinogenesis2008, 29 (11):2126-2131)、肺结核(HumImmuno12011, 72(7):598-602)发病风险；has-miR-196a_2rsll614913T — C 缩短肺癌生存时间(J Clin Invest2008, 118(7):2600-2608);has_miR-499rs3746444A —G提高乳腺癌发病率(Hum Mutat2009, 30(1):79-84) ；has-miR-608rs4919510G — C 增加结直肠癌(CancerEpidemiol Biomarkers Prev2012, 21 (1): 217-227; PLoS 0ne2012, 7 (5): e36306)、肾癌(Carcinogenesis2010, 31(10): 1805-1812)、鼻咽癌(Cancer Res2013)预后及乳腺癌(PLoS0ne2012, 7(5):e35252)发 生风险。
[0004]microRNA基因多态性检测方法包括直接测序法、荧光标记探针法、限制性内切酶法等。焦磷酸测序技术是新一代基于酶级联反应的DNA序列分析技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将DNA单链上的每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术具有其独特的优势，无需电泳、DNA片段无需荧光标记。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量、灵敏度高等特点，符合临床大样本检测要求。目前，还没有基于焦磷酸测序技术的microRNA基因多态性检测方法。
[0005]本发明是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进发明的。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明提供一种microRNA的测序方法，该方法以焦磷酸测序技术为基础，准确度高，操作简便。
[0007]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0008]microRNA的测序方法，所述测序方法为焦磷酸测序法,或结合二重PCR扩增技术，具体包括以下步骤:[0009]A特异性引物的设计引物设计[0010]根据祀位点设计待测microRNA的特异性的扩增引物和待测microRNA的焦磷酸测序引物，所述扩增引物的其中一条引物被生物素标记；
[0011]B PCR 反应
[0012]提取待测样本的DNA，用步骤A涉及的所述扩增引物进行PCR扩增反应，得扩增引物，其中，所述特异性扩增引物中的任一条用生物素标记；
[0013]C焦磷酸测序
[0014]将步骤B所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与步骤A所述测序引物进行杂交反应，并分析结果。
[0015]进一步,所述的microRNA的测序方法,所述祀位点包括has_miR-146ars2910164、has_miR-149rs2293832、 has-miR-196a_2rsll614913、 has_miR-492rs2289030、has_miR-544b rs10934682>has_miR-604rs2368392、has-miR-605rs2043556 和has-miR-608rs4919510位点中的一个或多个。
[0016]进一步,所述的microRNA的测序方法,在步骤B中，has_miR-146a rs2910164和has-miR-608rs4919510 进行二重 PCR, has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556进行二重 PCR，has-miR-196a-2rsll614913 和 has-miR-604rs2368392 进行二重PCR, has-miR-492rs2289030 和 has_miR-544b rsl0934682 进行二重 PCR。
[0017]进一步，所述的microRNA的测序方法，在步骤B中，has_miR-146a rs2910164和 has-miR-608rs4919510 进行二重 PCR 的退火温度为 62 °C ；has-miR-149rs2293832 和has-miR-605rs2043556 进行二重 PCR 的退火温度为 55 °C ;has-miR-196a_2rsl 1614913和 has-miR-604rs2368392 进行二重 PCR 的退火温度为 52 °C ；has-miR-492rs2289030 和has-miR-544b rs 10934682 进行二重 PCR 的退火温度为 58°C。
[0018]进一步，所述的microRNA的测序方法，在步骤A中，所述扩增引物具体为:has-miR-146a rs2910164位点的特异性引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2 所示；
[0019]上游引物:5’ accatctctgaaaagccgatgt3’
[0020]下游引物:bio_5，caagcccacgatgacagagatat3，
[0021]1?Β8-π?Κ-149ι^2293832位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID Ν0:3所示，下游引物如SEQ ID Ν0:4所示;
[0022]上游引物:bio_5’gctctggctccgtgtctt3’
[0023]下游引物:5’cgtcagccacctctcaca3’
[0024]has-miR-196a-2rsll614913位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID NO:5 ^示，下游引物如SEQ ID N0:6所示;
[0025]上游引物:5，agctgatctgtggcttaggtagtt3，
[0026]下游引物:bio_5，tcgacgaaaaccgactgat3，
[0027]has-miR-492rs2289030位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:7所示，下游引物如SEQ ID N0:8所示;
[0028]上游引物:bio_5，aggacctgcgggacaaga3’
[0029]下游引物:5，agcacccaaacactcaaacca3，[0030]has-miR-544b rsl0934682位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:9所示，下游引物如SEQ ID NO: 10所示；
[0031]上游引物:5’ gcggccagaagcaataattaagac3’
[0032]下游引物:bio_5，ggcactttgttagaaatgcacaacc3，
[0033]has-miR-604rs2368392位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:11所示，下游引物如SEQ ID NO: 12所示；
[0034]上游引物:5’ gtctaaaaaccgtctccagagc3’
[0035]下游引物:bio_5，gtcagaaaacctgcctgctag3’
[0036]has-miR-605rs2043556位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:13所示，下游引物如SEQ ID NO: 14所示；
[0037]上游引物:bio_5，ttgggaaaaacagagaaggc3，
[0038]下游引物:5，gaggccaggaaaaaacacat3，
[0039]has-miR-608rs4919510位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:15所示，下游引物如SEQ ID NO: 16所示；
[0040]上游引物:bio_5，gccagcctggacaatataatgagact3，
[0041]下游引物:5，gcagcctttgatggaagctctt3，
[0042]进一步，所述的microRNA`的测序方法，在步骤A中，所述测序引物具体为:
[0043]has-miR-146a rs2910164的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所不:5’ ttgtgtcagtgtcagacc3’
[0044]has-miR-149rs2293832的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所不:5’ ccggcgacctgcgtt3>
[0045]has-miR-196a-2rsll614913 的测序引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 19 所:5，gaactcggcaacaag3，
[0046]has-miR-492rs2289030的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所不:5’ aacttggttcagaagtcat3’
[0047]has-miR-544b rsl0934682的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所不:5’ tgttaaaatgcagaatcc3’
[0048]has-miR-604rs2368392的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所不:5’ ggagagcatcgtgctt3’
[0049]has-miR-605rs2043556的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所不:5’ cctgtatctgcagtcct3>
[0050]has-miR-608rs4919510的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所不:5’ agatgcctttttaaacg3’
[0051]本发明的目的之二在于提供一种试剂盒，其能用于检测microRNA多态性。
[0052]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0053]用于检测microRNA多态性的试剂盒,所述试剂盒包括待测microRNA的特异性扩增引物，待测microRNA的特异性焦磷酸测序引物，以及PCR反应液、PCR产物筛选液、焦磷酸测序反应液。
[0054]进一步，所述的试剂盒，所述特异性扩增引物has-miR_146a rs2910164位点的特异性引物:所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或所述特异性扩增引物如SEQID NO:3-4所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID NO:5-6所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID NO:7-8所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID N0:9_10所示;和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 11-12所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ IDNO: 13-14所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 15-16所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 17-18所示。
[0055]所述的用于检测microRNA多态性的试剂盒在制备用于诊断脓毒症诊断试剂盒中的应用。
[0056]本发明的有益效果在于:(I)本发明提供的PCR引物二重组合扩增目的片段，电泳结果显示二重组合下的两条目的DNA条带均等明亮、单一，说明本发明提供的二重组合PCR扩增引物效率高，两对引物扩增效率相当。(2)从对样本microRNA基因多态性焦磷酸测序结果(附图1)可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对microRNA基因型进行检测和判读。
[0057]综上,本发明所选取的microRNA祀序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测microRNA基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于miCToRNA基因检测预测疾病的发生、发展风险。【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1 为 has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510 双重 PCR 的基因型分
析结果图；
[0059]图 2 为 has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556 双重 PCR 的基因分析结果图；
[0060]图 3 为 has-miR-196a-2rsl 1614913 和 has_miR-604rs2368392 双重 PCR 的基因分
析结果图；
[0061]图 4 为 has-miR-492rs2289030 和 has_miR-544b rs 10934682 双重 PCR 的基因分
析结果图。
【具体实施方式】
[0062]以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0063]【具体实施方式】
[0064]下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。
[0065]一引物的设计
[0066]利用NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov) GenBank 革F1 序列位点及其附近约 500bp 基因组序列。利用焦磷酸测序仪附带软件“Assay Design”设计单核甘酸多态性位点PCR扩增引物及焦磷酸测序引物，选择评分最高的引物对。设计好的引物委托上海生物工程有限公司合成，并进行其中一条PCR引物5’端生物素修饰。
[0067]I)组合 1:has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510[0068]has_miR-146a rs2910164
[0069]上游引物:5，accatctctgaaaagccgatgt3’
[0070]下游引物:bio_5，caagcccacgatgacagagatat3，
[0071]has-miR-608rs4919510C/G
[0072]上游引物:bio_5，gccagcctggacaatataatgagact3，
[0073]下游引物:5，gcagcctttgatggaagctctt3，
[0074]测序引物
[0075]has-miR-146a rs2910164:5’ ttgtgtcagtgtcagacc3’
[0076]has_miR-608rs4919510:5， agatgcctttttaaacg3’
[0077]2)组合 2:has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556
[0078]has-miR-149rs2293832
[0079]上游引物:bio_5，GCTCTGGCTCCGTGTCTT3，
[0080]下游引物:5，CGTCAGCCACCTCTCACA3’
[0081]has-miR-605rs2043556 [0082]上游引物:bi0-5，TTGGGAAAAACAGAGAAGGC3 ’
[0083]下游引物:5，GAGGCCAGGAAAAAACACAT3，
[0084]测序引物
[0085]has-miR-149rs2293832:5’ CCGGCGACCTGCGTT3’
[0086]has-miR-605rs2043556:5’ CCTGTATCTGCAGTCCT3’
[0087]3)组合 3:has-miR-196a-2rsll614913 和 has_miR-604rs2368392
[0088]has-miR-196a_2rsl1614913
[0089]上游引物:5’ AGCTGATCTGTGGCTTAGGTAGTT3 ’
[0090]下游引物:bio-5，TCGACGAAAACCGACTGAT3’
[0091]has-miR-604rs2368392
[0092]上游引物:5，GTCTAAAAACCGTCTCCAGAGC3’
[0093]下游引物:bio-5，GTCAGAAAACCTGCCTGCTAG3，
[0094]测序引物
[0095]has-miR-196a-2rsll614913:5，GAACTCGGCAACAAG3，
[0096]has-miR-604rs2368392:5，GGAGAGCATCGTGCTT3’
[0097]4)has-miR-492rs2289030 和 has-miR-544b rsl0934682 组合
[0098]has-miR-492rs2289030
[0099]上游引物:bio-5，AGGACCTGCGGGACAAGA3，
[0100]下游引物:5’ AGCACCCAAACACTCAAACCA3 ’
[0101]has_miR-544b rsl0934682
[0102]上游引物:5’ GCGGCCAGAAGCAATAATTAAGAC3，
[0103]下游引物:bio-5，GGCACTTTGTTAGAAATGCACAACC3，
[0104]测序引物
[0105]has-miR-492rs2289030:5，AACTTGGTTCAGAAGTCAT3，
[0106]has-miR-544b rsl0934682:5’TGTTAAAATGCAGAATCC3’[0107]二全血基因组DNA提取
[0108]实验前试剂材料准备与检查工作如下:
[0109]检查全血基因组DNA纯化试剂盒(以美国Promega公司生产试剂为例)、焦磷酸测序试剂保质期及确保Wash Buffer中已添加乙醇，并在瓶盖做好标记；异丙醇和75%乙醇；高压灭菌有效期内的1.5ml Eppendorf (EP)管和各种型号移液器和枪头。从-80冰箱取出EDTA抗凝管收集的创伤患者外周血，室温下解冻并上下颠倒数次混匀；分别移取300ul全血和900ul Cell Lysis Solution加入做好对应样本标记的1.5ml EP管,室温孵育10分钟，每隔2-3分钟颠倒混匀一次；1000Og, 4°C离心I分钟；取出EP管，观察白色沉淀，弃去红色上清；重复操作2-3次,直到沉淀中无红色团块；加入300ul Nuclei Lysis Solution,充分振荡混匀，用Iml或200ul移液器将沉淀完全打散，室温放置10分钟以充分裂解细胞；加入 IOOul Protein Precipitation Solution,剧烈振荡 20 秒可见颗粒状沉淀；12000g,4°C离心3分钟；观察上清，若不清澈，增加离心时间，若清澈用移液器缓慢吸出上清液到新的1.5ml EP管中，记录体积,加入等体积预冷异丙醇(_20°C预冷),轻轻上下颠倒数次至白色絮状DNA析出；12000g，4°C离心3分钟，可见管底白色沉淀，弃上清；加入500ul预冷75%乙醇(_20°C预冷)，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；12000g，4°C离心2分钟，弃上清；在清洁的实验台上放置新滤纸，倒扣EP管，吸干液体，风干DNA沉淀；目测沉淀大小，加入50-100ul DNARehydration Solution，65°C水浴放置15分钟，每隔5-6分钟取出涡旋振荡充分溶解DNA沉淀；完全溶解后用Nano-Space紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度，核酸浓度大于20ng/ul视为合格，如浓度不足，可加入乙醇再次沉淀DNA并溶解。在管壁和管盖再次标清样本编号，保存DNA样本至_80°C冰箱备用。
[0110]三聚合酶链反应
[0111]在试剂制备区配制50ul PCR反应体系(DNA模板除外)，各组分及添加量如下表:
[0112]
【权利要求】
1.microRNA的测序方法，其特征在于，所述测序方法为焦磷酸测序法，或结合二重PCR扩增技术，具体包括以下步骤: A特异性引物的设计引物设计 根据靶位点设计待测microRNA的特异性的扩增引物和待测microRNA的焦磷酸测序引物，所述扩增引物的其中一条引物被生物素标记； B PCR反应 提取待测样本的DNA，用步骤A涉及的所述扩增引物进行PCR扩增反应，得扩增引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记； C焦磷酸测序 将步骤B所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与步骤A所述测序引物进行杂交反应，并分析结果。
2.根据权利要求1所述的microRNA的测序方法，其特征在于:所述靶位点包括 has_miR-146a rs2910164> has_miR-149rs2293832、has-miR-196a_2rsl 1614913、has-miR-492rs2289030>has_miR-544b rsl0934682> has_miR-604rs2368392、has-miR-605rs2043556 和 has_miR-608rs4919510 位点中的一个或多个。
3.根据权利要求2所述的microRNA的测序方法，其特征在于:在步骤 B 中，has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510 进行二重 PCR，和 / 或 has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556 进行二重 PCR，和 / 或has-miR-196a-2rsll614913 和 has_miR-604rs2368392 进行二重 PCR，和 / 或has-miR-492rs228903`0 和 has_miR-544b rsl0934682 进行二重 PCR。
4.根据权利要求3所述的microRNA的测序方法，其特征在于:在步骤B中，has-miR-146a rs2910164 和 has_miR-608rs4919510 进行二重 PCR 的退火温度为 62 °C ；has-miR-149rs2293832 和 has-miR-605rs2043556 进行二重 PCR 的退火温度为 55 °C ;has-miR-196a-2rsl 1614913 和 has_miR-604rs2368392 进行二重 PCR 的退火温度为 52°C ；has-miR-492rs2289030 和 has_miR-544b rs 10934682 进行二重 PCR 的退火温度为 58°C。
5.根据权利要求3所述的microRNA的测序方法，其特征在于:在步骤A中，所述扩增引物具体为: has-miR-146a rs2910164位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示； has-miR-149rs2293832位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示； has-miR-196a-2rsll614913位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:5所示，下游引物如SEQ ID NO:6所示； has-miR-492rs2289030位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:7所示，下游引物如SEQ ID NO:8所示； has-miR-544b rsl0934682位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID N0:9所示，下游引物如SEQ ID NO: 10所示； has-miR-604rs2368392位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID NO: 11所示，下游引物如SEQ ID NO: 12所示；has-miR-605rs2043556位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID NO: 13所示，下游引物如SEQ ID NO: 14所示； has-miR-608rs4919510位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID NO: 15所示，下游引物如SEQ ID NO: 16所示。
6.根据权利要求3所述的microRNA的测序方法，其特征在于:在步骤A中，所述测序引物具体为: has-miR-146a rs2910164的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示: has-miR-149rs2293832的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示； has-miR-196a-2rsll614913的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示; has-miR-492rs2289030的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示； has-miR-544b rsl0934682的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示； has-miR-604rs2368392的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示； has-miR-605rs2043556的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示； has-miR-608rs4919510的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示。
7.用于检测microRNA多态性的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括待测microRNA的特异性扩增引物，待测microRNA的特异性焦磷酸测序引物，以及PCR反应液、PCR产物筛选液、焦磷酸测序反应液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于:所述特异性扩增引物has-miR-146ars2910164位点的特异性引物如SEQ ID NO: 1_2所示，和/或所述特异性扩增引物如SEQ IDN0:3-4所示；和/或所述特 异性扩增引物如SEQ IDN0:5-6所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID N0:7-8所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID Ν0:9_10所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ IDN0:11-12所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 13-14所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 15-16所示；和/或所述特异性扩增引物如SEQID NO: 17-18 所示。
9.权利要求7所述的用于检测microRNA多态性的试剂盒在制备用于诊断脓毒症诊断试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103509863SQ201310376423
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】张安强, 蒋建新, 顾玮, 曾灵, 杨策 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院