一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种改进的凋亡DNA?ladder提取试剂盒，包括用于将凋亡细胞中的凋亡的核小体在10秒钟内提取出来的细胞裂解液、用于将凋亡的核小体中混有RNA酶和核小体蛋白除去的提取试剂酶A液和B液、由1mL中含有790mg醋酸铵的水溶液组成的醋酸铵溶液及由1.667mL的TE缓冲液和0.333mL中含有4.4gEDTA、250mg溴酚蓝、250mgXyleneCyanolFF的水溶液组成的DNAladder溶解液。本发明检测配体具有快速、灵敏度高（凋亡率在10%以上可以检测出来）、可定性检测、特异性强的特点。
【专利说明】—种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及医用检测试剂【技术领域】，尤其涉及一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒。
【背景技术】
[0002]细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡的主要特征表现在细胞萎缩、胞膜结构的改变、核染色质致密、内源性核酸酶性切割基因组DNA。
[0003]早期细胞凋亡检测是形态学观察方法：(1) HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。⑵丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。⑶台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。⑷透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
[0004]上述方法操作简单，初学者即可很容易掌握，但是上述方法的准确度很差，也就是说很难区别凋亡细胞和坏死细胞。形态学观察只是一种辅助的手段。
[0005]目前最为经典和最被承认的方法是DNA凝胶电泳方法。其 检测原理是：
细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现18(T200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
[0006]结果判断是：
正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（Ladder)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
[0007]该方法存在操作繁琐的缺点，需要操作人员具有一定的实验技术的积累，所以较难以掌握，但是该实验结果是最被人认定凋亡的结果。这也更加说明该实验的重要性和对简化该实验操的研发的必要性和迫切性。
[0008]现有的Apoptotic DNA Ladder提取试剂盒为或为进口产品,价格昂贵；同样的提取试剂盒在美国购买需要两百多美元，而如果从国内找代理商购买，则需要四千多人民币，仅价格上就提高了 4倍，而且还很难避免所购买试剂盒因为长途运输造成的质量问题。
[0009]国产产品，效果不是很好，比如常常混有基因组DNA。⑴以碧云天开发的ApoptoticDNA Ladder提取试剂盒，其原理是将所处理细胞的所有DNA都提取出来，用孔径较小的离心柱将所提取的DNA分离和洗脱下来。该方法优点是操作方法简单，容易掌握，缺点是所提取的产物除凋亡DNA还混有总基因组和坏死细胞的长度不规则的DNA。这样跑出的DNA凝胶电泳效果可想而知，凋亡DNA ladder之间(条带与条带之间)区分度很差，最终导致实验结果效果很差。⑵又或者虽不是离心柱分离洗脱，但是由于其裂解液用的是裂解较强的基因组裂解液，而且裂解时间较长，这样势必提取产物中混有较大量的基因组DNA，会在一定程度下掩盖所提取的凋亡DNA ladder的效果。⑶用分离萃取的方法抽提蛋白，也就是用氯仿、饱和酚分离提取。这样做的缺点是一是增加试验成本，第二是步骤繁琐，毒性较大，一般在通风橱里操作。而且由于抽提蛋白的过程，凋亡DNA ladder有一定损失。
【发明内容】
[0010]本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、快速、可定性检测的改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒。
[0011]为解决上述问题，本发明所述的一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒，包括 一细胞裂解液，用于将凋亡细胞中的凋亡的核小体在10秒钟内提取出来；
所述细胞裂解液由 0.121g~0.200g Tris,2.340~3.0OOg NaCl、0.029g~0.040gEDTA、ImL~2mL Tritan-χ 组成；
一提取试剂酶A液和B液，用于将凋亡的核小体中混有RNA酶和核小体蛋白除去； 所述A液由250 μ L中含有250 μ g RNA酶的水溶液组成；
所述B液由250 μ L中含有500 μ g蛋白酶K的水溶液组成；
一醋酸铵溶液；
所述醋酸铵溶液由ImL中含有790mg醋酸铵的水溶液组成；
—DNA ladder 溶解液；
所述DNA ladder溶解液由1.667mL的TE缓冲液和0.333mL中含有4.4g EDTA、250mg溴酹蓝、250mg Xylene Cyanol FF的水溶液组成。
[0012]该试剂盒还包括由ImL中含有IOmg柔红霉素的水溶液组成的阳性处理液。
[0013]如上所述的一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒的使用方法,包括以下步骤: ⑴收集细胞IO7个到15 mL离心管中，以1200 rpm离心5 min后去上清液；
⑵向所述15 mL离心管中加入50 μ L细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500 rpm离心5min后,取上层液A于1.5 mL离心管中；再次向所述15 mL离心管中加入50 μ L所述细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500 rpm离心5 min，取上层液B于所述1.5 mL离心管中；
⑶于所述1.5 mL离心管中加入5μ L A液混匀，放入30°C ±1°C孵育10 min ；
⑷再于所述1.5 mL离心管中加入5 μ L B液混匀，放入50°C ± I°C水浴锅中过夜孵育l(Tl2h ；
(5)再于所述1.5mL离心管中加入5 μ L醋酸铵溶液混匀，并加入100 μ L异丙醇充分混匀后放入_20°C冷冻10 min，然后以13000 rpm离心10 min，去除上层液C，得到DNAladder 沉淀；
(6)所述DNAladder沉淀中加入500 μ L的质量浓度为70%的乙醇，以13000 rpm离心10 min,去除上层液D,得到洗漆后的DNA ladder沉淀；
(7)所述洗漆后的DNAladder沉淀室温下晾干10 min后加入30 μ L DNA ladder溶解液，然后采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验，Ih后采用凝胶成像系统进行紫外检测即可。
[0014]所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验的条件是指琼脂糖胶的质量浓度为1.2%,电压为80V,温度为常温,进样方式为点样,进样量为10 μ L。
[0015]所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行紫外检测的条件是指波长为254nm，温度为常温，进样量为10 μ L。
[0016]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明利用较温和的细胞裂解液处理凋亡细胞后，可将凋亡的细胞中的凋亡核小体溶解到裂解液中，然后经后面的提取步骤来专门提取凋亡小体的DNA ladder,因此其检测配体具有快速、灵敏度高(凋亡率在10%以上可以检测出来)、可定性检测、特异性强的特点。
[0017]2、由于本发明使凋亡DNA ladder几乎不含有总基因组DNA，这样做的结果就是更大程度放大凋亡DNA ladder的提取效果，因此通过对凋亡DNA ladder有针对性的提取和检测，可以实现放大检测量。
[0018]3、由于本发明在使用过程中不需饱和酚，氯仿抽提，不用分离柱分离，同时，只需37°C和50°C孵育就能完成除去RNA和核小体蛋白的反应，因此，操作过程简单、安全，可有效避免有毒物质所造成的环境污染，便于一般实验室或临床检验科室的普及应用。
[0019]4、采用本发明试剂盒对各种处理的KA细胞中DNA ladder进行提取分析发现(1.2%琼脂糖凝胶电泳后紫外检测):使用本试剂盒可以提取图像清晰的凋亡KA细胞的DNAladder，检测出KA细胞已经发生了凋亡。
[0020]其中:图1为KA细胞用VB (促凋亡药品)+金纳米颗粒处理(line 3)，VB (line2)处理或没有任何处理的 对照组(line I)处理24h ;图2为KA细胞用VB (促凋亡药品)+金纳米颗粒处理(line 3),VB (line 2)处理或没有任何处理的对照组(line I)处理48h;图3为KA细胞用VB (促凋亡药品)+金纳米颗粒处理(line 3)，VB (line 2)处理或没有任何处理的对照组(line I)处理72h ;图4为KA细胞用VB (促凋亡药品)+金纳米颗粒处理(line 3),VB (line 2)处理或没有任何处理的对照组(line I)处理Oh。(VB即毛蕊花糖苷-verbascoside促凋亡药品及金纳米颗粒均由sigma公司提供)
5、采用本发明试剂盒对凋亡H印G2细胞DNA ladder进行提取分析发现(1.2%琼脂糖凝胶电泳后紫外检测):使用本试剂盒可以提取图像清晰的凋亡HepG2细胞的DNA ladder,检测出！fepG2细胞已经发生了凋亡。
[0021]其中:!fepG2细胞晚期凋亡(line 1，2)，!fepG2细胞早起期凋亡(line 3,4)(参见图5)。
[0022]6、本发明不但降低了实验成本，而且降低了试剂盒本身的价格，可广泛应用于基础研究与临床检测，经济效益与社会效益显著。与国外试剂盒相比质量相当，但是价格便宜；与国内试剂盒相比价格相当，但是提取质量较高。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0024]图1为本发明凋亡KA细胞DNA ladder提取分析图(24h)。
[0025]图2为本发明凋亡KA细胞DNA ladder提取分析图(48h)。
[0026]图3为本发明凋亡KA细胞DNA ladder提取分析图(72h)。[0027]图4为本发明凋亡KA细胞DNA ladder提取分析图（Oh)。
[0028]图5为本发明凋亡H印G2细胞DNA ladder提取分析图。
【具体实施方式】
[0029]实施例I 一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒,包括
一细胞裂解液，用于将凋亡细胞中的凋亡的核小体在10秒钟内提取出来；
细胞裂解液由 O. 121g~O. 200g Tris,2. 340^3. OOOg NaCl、0. 029g~0.040gEDTA、ImL~2mL Tritan-χ 组成。
[0030]一提取试剂酶A液和B液，用于将凋亡的核小体中混有RNA酶和核小体蛋白除去； A液由250 μ L中含有250 μ g RNA酶的水溶液组成；
B液由250 μ L中含有500 μ g蛋白酶K的水溶液组成。
[0031]一醋酸铵溶液；
醋酸铵溶液由ImL中含有790mg醋酸铵的水溶液组成。
[0032]一DNA ladder 溶解液；
DNA ladder溶解液由I. 667mL的TE缓冲液和O. 333mL中含有4. 4g EDTA、250mg溴酚蓝、250mg Xylene Cyanol FF的水溶液组成。
[0033]该试剂盒的使用 方法，包括以下步骤：
⑴收集细胞IO7个到15 mL离心管中，以1200 rpm离心5 min后去上清液。
[0034]如果细胞为悬浮细胞，可以将剩余的细胞用PBS冲洗到离心管中。如果是贴壁细胞，就用胰酶消化下来，再用PBS冲洗到离心管里收集。
[0035]⑵向15 mL离心管中加入50 μ L细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500 rpm离心5min后,取上层液A于I. 5 mL离心管中；再次向15 mL离心管中加入50 μ L细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500 rpm离心5 min,取上层液B于I. 5 mL离心管中。
[0036]⑶于I. 5 mL离心管中加入5μ L A液混匀，放入30°C ±1°C孵育10 min。
[0037]⑷再于I. 5 mL离心管中加入5 μ L B液混匀，放入50°C ± I°C水浴锅中过夜孵育10~12h。
[0038](5)再于I. 5 mL离心管中加入5 μ L醋酸铵溶液混匀，并加入100 μ L异丙醇充分混匀后放入_20°C冷冻10 min，然后以13000 rpm离心10 min，去除上层液C，得到DNAladder 沉淀。
[0039](6) DNA ladder沉淀中加入500 μ L的质量浓度为70%的乙醇，以13000 rpm离心
10min，去除上层液D，得到洗涤后的DNA ladder沉淀。
[0040]⑴洗漆后的DNA ladder沉淀室温下晾干10 min后加入30 μ L DNA ladder溶解液，然后采用凝胶成像系统在琼脂糖胶的质量浓度为I. 2%、电压为80V、温度为常温、进样方式为点样、进样量为10 μ L的条件下进行凝胶电泳实验，Ih后采用凝胶成像系统在波长为254nm、温度为常温、进样量为10 μ L的条件下进行紫外检测即可。
[0041]实施例2 —种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒，包括
一细胞裂解液，用于将凋亡细胞中的凋亡的核小体在10秒钟内提取出来；
细胞裂解液由 O. 121g~O. 200g Tris,2. 340^3. OOOg NaCl、0. 029g~0.040gEDTA、ImL~2mL Tritan-χ 组成。[0042]一提取试剂酶A液和B液，用于将凋亡的核小体中混有RNA酶和核小体蛋白除去； A液由250 μ L中含有250 μ g RNA酶的水溶液组成；
B液由250 μ L中含有500 μ g蛋白酶K的水溶液组成。
[0043]—醋酸铵溶液；
醋酸铵溶液由ImL中含有790mg醋酸铵的水溶液组成。
[0044]一DNA ladder 溶解液；
DNA ladder溶解液由1.667mL的TE缓冲液和0.333mL中含有4.4g EDTA、250mg溴酚蓝、250mg Xylene Cyanol FF的水溶液组成。
[0045]一阳性处理液；
阳性处理液由ImL中含有IOmg柔红霉素的水溶液组成。
[0046]该试剂盒的使用方法⑴~(7)同实施例1。然后将细胞放入10厘米的细胞培养皿中，用5 μ L阳性处理液处理24小时后，即得理想的阳性DNA ladder对照样品。
[0047]上述实施例f 2中，Tris由Biosharp公司提供；NaCl由广东省精细化学品工程技术研究开发中心提供；EDTA、醋酸铵、TE缓冲液、溴酚蓝、250mg Xylene Cyanol FF由国药集团化学试剂有限公司提供Jritan-x由上海凌峰化学试剂有限公司提供；蛋白酶K、RNA酶由sigma公司提供；柔红霉素由康顺医科生物公司提供。
【权利要求】
1.一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒,包括 一细胞裂解液，用于将凋亡细胞中的凋亡的核小体在10秒钟内提取出来； 所述细胞裂解液由 0.121g~0.200g Tris,2.340~3.0OOg NaCl、0.029g~0.040gEDTA、ImL~2mL Tritan-χ 组成； 一提取试剂酶A液和B液，用于将凋亡的核小体中混有RNA酶和核小体蛋白除去； 所述A液由250 μ L中含有250 μ g RNA酶的水溶液组成； 所述B液由250 μ L中含有500 μ g蛋白酶K的水溶液组成； 一醋酸铵溶液； 所述醋酸铵溶液由ImL中含有790mg醋酸铵的水溶液组成； -DNA ladder 溶解液； 所述DNA ladder溶解液由1.667mL的TE缓冲液和0.333mL中含有4.4g EDTA、250mg溴酹蓝、250mg Xylene Cyanol FF的水溶液组成。
2.如权利要求1所述的一种改进的凋亡DNAladder提取试剂盒，其特征在于:该试剂盒还包括由ImL中含有IOmg柔红霉素的水溶液组成的阳性处理液。
3.如权利要求1所述的一种改进的凋亡DNAladder提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤: ⑴收集细胞IO7个到15 mL 离心管中，以1200 rpm离心5 min后去上清液； ⑵向所述15 mL离心管中加入50 μ L细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500 rpm离心5min后,取上层液A于1.5 mL离心管中；再次向所述15 mL离心管中加入50 μ L所述细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500 rpm离心5 min，取上层液B于所述1.5 mL离心管中； ⑶于所述1.5 mL离心管中加入5μ L A液混匀，放入30°C ±1°C孵育10 min ； ⑷再于所述1.5 mL离心管中加入5 μ L B液混匀，放入50°C ± I°C水浴锅中过夜孵育l(Tl2h ； (5)再于所述1.5mL离心管中加入5 μ L醋酸铵溶液混匀，并加入100 μ L异丙醇充分混匀后放入_20°C冷冻10 min，然后以13000 rpm离心10 min，去除上层液C，得到DNAladder 沉淀； (6)所述DNAladder沉淀中加入500 μ L的质量浓度为70%的乙醇，以13000 rpm离心10 min,去除上层液D,得到洗漆后的DNA ladder沉淀； (7)所述洗漆后的DNAladder沉淀室温下晾干10 min后加入30 μ L DNA ladder溶解液，然后采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验，Ih后采用凝胶成像系统进行紫外检测即可。
4.如权利要求3所述的如权利要求1所述的一种改进的凋亡DNAladder提取试剂盒的使用方法，其特征在于:所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验的条件是指琼脂糖胶的质量浓度为1.2%，电压为80V，温度为常温，进样方式为点样，进样量为10μ L。
5.如权利要求3所述的如权利要求1所述的一种改进的凋亡DNAladder提取试剂盒的使用方法，其特征在于:所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行紫外检测的条件是指波长为254nm,温度为常温,进样量为10 μ L。
【文档编号】C12N15/10GK103484450SQ201310437347
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】张根, 赵晓辉, 曾新, 刘宾, 袁毅, 陈明月 申请人:张根